黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的交配型和multi-locus基因型分析.pdf
<p>黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的交配型和 multi -locus 基因型分析 張鉉哲 韓曉旭 郭衍錦 李 璐 李媛媛 （東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030） 摘 要：20152017年在黑龍江省哈爾濱市、綏化市和齊齊哈爾市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)共采集分離了126株馬鈴薯晚疫病菌菌 株，測定交配型、mtDNA單倍型、SSR基因型并進(jìn)行multi-locus基因型分析。結(jié)果顯示，126株菌株中發(fā)現(xiàn)了A1、A2、自 育型3種交配型，分別占分離菌株總數(shù)的88.1、6.3和5.6。126株菌株中共鑒定出a和a兩種mtDNA單倍型，分別 占分離菌株總數(shù)的17.5和82.5。126株菌株中共鑒定出7種SSR基因型，分別為F-01、F-02、F-03、F-05、F-06、D-03 和G-02，其中F-01基因型（77.8）為優(yōu)勢基因型。根據(jù)馬鈴薯晚疫病菌的mtDNA單倍型和SSR基因型，共劃分了9種 multi-locus基因型，其中multi-locus基因型A（65.1）是黑龍江省發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢基因型。20152017年黑龍江省馬鈴薯晚疫 病菌群體結(jié)構(gòu)逐年復(fù)雜，綏化市馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。 關(guān)鍵詞：馬鈴薯晚疫病菌；交配型；mtDNA單倍型；SSR基因型；multi-locus基因型 型，其出現(xiàn)頻率僅為2.2。王騰等（2016）對 20112013年在黑龍江采集的菌株進(jìn)行交配型測 定，A1交配型占菌株總數(shù)的51.63，其余為A2 交配型。這些研究表明晚疫病菌由于不同交配型的 出現(xiàn)，可以在田間進(jìn)行有性生殖和無性繁殖，導(dǎo)致 晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)變 化對晚疫病害的防治提出了新的挑戰(zhàn)，因此研究馬 鈴薯晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)變化具有重要意義。 線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡單、無組織特異性等 優(yōu)點(diǎn)，采用檢測線粒體多態(tài)性方法研究晚疫病菌群 體遺傳結(jié)構(gòu)變化效果更佳（May & Ristino，2004）。 對馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA（mtDNA）多態(tài)性 進(jìn)行研究，逐步成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。Griffith和 Shaw（1998）采用改進(jìn)PCR-RFLP方法將線粒體單 倍型分為a、a、b、b。Rojas和Kirk（2016） 研究表明，20082010年在密歇根州采集分離的 124株致病疫霉的mtDNA單倍型均為a型。Tian 等（2016）鑒定了中國西北地區(qū)采集分離的馬鈴 薯晚疫病菌mtDNA單倍型，結(jié)果檢測到a、a 和b 3種單倍型，其中a為優(yōu)勢基因型。徐生軍 （2010）利用PCR-RFLP方法，對黑龍江省采集分 離的馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行mtDNA單倍型檢測，共 張鉉哲，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：植物病害綜合防治， E-mail：zhe3850163.com 收稿日期：2017-11-13；接受日期：2018-03-06 基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2016019） ，黑龍江省經(jīng)濟(jì)作 物現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新體系項(xiàng)目（HNWJZTX201701） 中國是馬鈴薯生產(chǎn)大國，馬鈴薯已成為繼小 麥、玉米之后的第三大作物，種植面積和產(chǎn)量居于 世界首位（王立 等，2013） 。黑龍江省因得天獨(dú)厚 的冷涼氣候和地理?xiàng)l件，成為我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之 一（關(guān)紅穎，2011） 。然而，近幾年由于黑龍江省 降雨量大等天氣原因，馬鈴薯晚疫病發(fā)生十分嚴(yán)重。 馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉Phytophthora infestans引起的馬鈴薯毀滅性病害，可造成巨大的 經(jīng)濟(jì)損失（金光輝 等，2017） 。馬鈴薯晚疫病菌通 過不同交配型菌株之間異宗配合進(jìn)行有性生殖，有 性生殖可產(chǎn)生卵孢子，卵孢子可在土壤中越冬，成 為翌年的初侵染源。不同交配型同時(shí)存在時(shí)說明馬 鈴薯晚疫病菌適應(yīng)性和變異性增強(qiáng)（閔凡祥 等， 2010）。Gallegly和Galindo（1958）在墨西哥中部首 先發(fā)現(xiàn)了A1和A2交配型。張志銘等（1996）首 次在國內(nèi)報(bào)道了A2交配型菌株。朱杰華（2004） 首次在黑龍江采集分離的菌株中鑒定出A2交配 58 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 58 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（4）：58 - 64 檢測到a和a兩種單倍型。可見，4種單倍型在 不同國家和地區(qū)的分布具有一定差異。 SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、 發(fā)生頻率高、批量操作等優(yōu)點(diǎn)（李建武，2011） ， 近些年成為研究馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性的 主要方法。對采自黑龍江的致病疫霉進(jìn)行SSR基因 型分析，吳艷清等（2012）鑒定出8種基因型，F(xiàn)-01 型所占比例最高。而王晨（2013）的鑒定結(jié)果表明， 從黑龍江采集的菌株共鑒定出6種SSR基因型，F(xiàn)-01 為優(yōu)勢基因型。這些研究表明，黑龍江省馬鈴薯晚 疫病菌的SSR基因型呈現(xiàn)一種動態(tài)變化。 Runno-Paurson等（2016）對愛沙尼亞的馬鈴 薯晚疫病菌進(jìn)行交配型和SSR基因型測定，結(jié)果表 明該地區(qū)出現(xiàn)不同交配型菌株，SSR基因型也趨于 多樣化。Rekad等（2017）通過SSR標(biāo)記分析、交 配型和瑞毒霉敏感性的測定，對阿爾及利亞西北部 地區(qū)的致病疫霉進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明不同交配 型的菌株其對應(yīng)的優(yōu)勢SSR基因型有差異。Guo等 （2010）通過交配型、同工酶基因型、mtDNA單倍 型和RG57指紋的分析，發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)的馬鈴薯晚 疫病菌基因型和表現(xiàn)型與其他國家有差異。 我國缺少對馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型 的研究。本試驗(yàn)首先測定黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌 的交配型；其次，利用PCR-RFLP方法和SSR標(biāo) 記測定黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的mtDNA單倍型 和SSR基因型；第三，利用mtDNA單倍型和SSR 基因型確定黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的muti-locus 基因型；最終，分析交配型與muti-locus基因型的 相互關(guān)系。以期為馬鈴薯晚疫病菌的群體遺傳研究 和馬鈴薯晚疫病的防治提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 供試菌株及培養(yǎng)基 20152017年，在黑龍江省齊齊哈爾市、綏 化市、哈爾濱市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集具有馬鈴薯晚 疫病主要癥狀的單病斑葉片，將馬鈴薯切成約0.5 cm的薯片，用70%酒精將切后的薯片消毒，將病 葉放入滅菌后的選擇性培養(yǎng)基中，把消毒處理后的 薯片放在病葉上，加入一定的蒸餾水，用封口膜封 蓋，19 黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46 d。 供試培養(yǎng)基為20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基和選擇 性培養(yǎng)基（張鉉哲和徐生軍，2010）。 1.2 馬鈴薯晚疫病菌的交配型測定 交配型的測定采用對峙培養(yǎng)法，使用20%番 茄汁瓊脂培養(yǎng)基。將標(biāo)準(zhǔn)菌株A1（DN-3085日本）、 A2（TBC-3韓國）與待測菌株預(yù)培養(yǎng)，然后將標(biāo) 準(zhǔn)菌株和待測菌株菌餅分別與A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株對 峙培養(yǎng)，菌餅之間距離為3 cm。封蓋，每個(gè)菌株重 復(fù)測定3次，19 恒溫培養(yǎng)14 d，在顯微鏡下觀察 菌落交界處是否產(chǎn)生卵孢子。若待測菌株與A2標(biāo) 準(zhǔn)菌株之間產(chǎn)生卵孢子，且與A1標(biāo)準(zhǔn)菌株間不產(chǎn) 生卵孢子，說明所測菌株是A1交配型；相反，則 是A2交配型。若與2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株間都產(chǎn)生卵孢子， 且自身也可產(chǎn)生卵孢子，則待測菌株類型為自育型。 1.3 DNA提取 將待測菌株接種到20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基 中，每株菌株接種3皿，19 黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 14 d左右，用滅過菌的濾紙吸干菌絲上的水分，裝 入1.5 mL EP管中，-20 下保存用于DNA的提取。 參考Goodwin等（1992）的方法提取基因組DNA。 1.4 馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型測定 1.4.1 引物序列與擴(kuò)增體系 線粒體DNA單 倍型分析的PCR-RFLP方法參考Griffith和 Shaw（1998）的方法。引物序列：P2：F2： 5- TTCCCTTTGTCCTCTACCCAT-3，R2： 5-TTACGGCGGTTTAGCACATACA-3；P4：F4： 5-TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT-3，R4：5- CCGATACCGATACCAGCACCAA-3。所用引物由 生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò) 增體系和程序參考Zhang等（2006）的方法。 1.4.2 酶切體系 目的片段回收采用核酸回收試劑 盒生工生物工程（上海）股份有限公司 。P2引 物擴(kuò)增片段使用 Msp 酶切，P4引物擴(kuò)增片段使用 EcoR 酶切，酶切體系為50 L：膠回收產(chǎn)物10 L，Buffer 5 L，Enzyme 1 L，ddH 2 O補(bǔ)足至50 L。反應(yīng)條件為37 水浴3 h。將酶切產(chǎn)物與溴 酚藍(lán)混合，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝 膠成像儀拍照。 1.5 馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型測定 1.5.1 SSR引物序列與擴(kuò)增體系 馬鈴薯 晚疫病SSR基因型劃分標(biāo)準(zhǔn)參考Knapova 和Gisi（2002） 的 方 法。 引 物 序 列Pi4B： 59 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 59 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES F：5 -AAAATAAAGCCTTTGGTTA-3 ，R： 5-GCAAGCGAGGTTTGTAGATT-3；Pi4G： F：5-CGCTGTGTGGATGACAAGTA-3，R： 5-TCGACCTGACATACGAGCTA-3。SSR擴(kuò)增體 系和擴(kuò)增程序參考王晨（2013）的方法。 1.5.2 聚丙烯凝膠電泳檢測 將擴(kuò)增后的樣品與同 體積的Loading Buffer混合，95 變性10 min，擴(kuò) 增產(chǎn)物用12%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染 染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照（Gene Company Limited GBOX-CHEMI-XRQ）。 2 結(jié)果與分析 2.1 馬鈴薯晚疫病菌分離 20152017年在黑龍江省哈爾濱市、綏化市 和齊齊哈爾市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)共采集分離了126株 馬鈴薯晚疫病菌菌株（表1）。 表1 黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌菌株信息 采集年份 采集地區(qū) 菌株數(shù) 2015 齊齊哈爾 16 綏化 2 哈爾濱 4 2016 綏化 26 哈爾濱 6 2017 綏化 35 齊齊哈爾 37 2.2 馬鈴薯晚疫病菌交配型分析 在黑龍江省采集分離的126株馬鈴薯晚疫病 菌菌株中共發(fā)現(xiàn)了3種交配型。A1、A2和自育 型菌株分別占所分離菌株總數(shù)的88.1、6.3和 5.6。從采集年份分析結(jié)果顯示，2015年采集的 22株菌株中，共鑒定出A1和A2 2種交配型，其 中，21株菌株為A1交配型（95.5），僅1株菌 株為A2交配型（4.5）。2016年采集的32株菌 株中共鑒定出3種交配型，其中26株A1交配型 菌株（81.3），4株A2交配型（12.5），2株自 育型（6.2）。2017年共分離鑒定了72株菌株， 3株菌株為A2交配型（4.2） ，5株菌株為自育型 （6.9），其余64株菌株為A1交配型（88.9）， 由此可見，自育型菌株比例逐年增長，各年份之間 A1交配型所占比例具有差異。 從采集地區(qū)分析結(jié)果顯示，哈爾濱市采集分 離的菌株均為A1型（100） ，綏化市采集分離的 菌株共鑒定出3種交配型，56株為A1交配型菌株 （88.9），5株為A2交配型菌株（7.9），2株 為自育型菌株（3.2） 。齊齊哈爾市采集分離的菌 株共測定出A1、A2和自育型3種，分別為46株 （86.8）、2株（3.8）和5株（9.4） 。以上結(jié) 果顯示，哈爾濱市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)與其他2個(gè)馬鈴薯 主產(chǎn)區(qū)相比晚疫病菌交配型相對單一，各地區(qū)之間 不同交配型所占百分比具有明顯差異。 2.3 馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型分析 黑龍江省采集分離的126株馬鈴薯晚疫病菌菌 株共鑒定出a和a 2種mtDNA單倍型，其中104 株菌株為a單倍型（82.5） ，22株菌株為a單倍 型（17.5） 。從采集年份分析結(jié)果顯示，2015年 測定的22株菌株中，共測定出19株a單倍型菌 株（86.4%），3株為a單倍型菌株（13.6%）。2016 年分離鑒定的32株菌株中，24株為a單倍型菌株 （75.0%），其余8株為a單倍型菌株（25.0）。 2017年分離的72株菌株中，11株為a單倍型菌株 （15.3），61株為a單倍型菌株（84.7）。2015 年所鑒定菌株中a單倍型比例最高。 從采集地區(qū)分析結(jié)果顯示，哈爾濱市采集分離 的菌株均為a單倍型（100） ，綏化市分離的63 株菌株中，共鑒定出a和a 2種單倍型，分別為 15株（23.8）和48株（76.2）。齊齊哈爾市鑒 定的53株菌株中，46株為a單倍型（86.8），7 株為a單倍型（13.2） ?？梢姽枮I市馬鈴薯主 產(chǎn)區(qū)mtDNA單倍型單一，各地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌 不同mtDNA單倍型所占比例具有明顯差異。 2.4 馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型分析 對黑龍江省采集分離的126株馬鈴薯晚疫病菌 菌株進(jìn)行SSR基因型分析，共鑒定出7種基因型， 分 別 為F-01、F-02、F-03、F-05、F-06、D-02 和G-02。其中F-01基因型菌株共鑒定出98株 （77.8），F(xiàn)-05基因型為12株（9.5%） ，F(xiàn)-03基 因型菌株為7株（5.5），D-02基因型菌株為4株 （3.2） ，F(xiàn)-06基因型菌株為3株（2.4），F(xiàn)-02 基因型和G-02基因型分別鑒定出1株（0.8）。 從采集年份來看（圖1） ，2015年分離鑒定的 22株菌株中，共鑒定出3種基因型，分別為F-01、 F-05和F-03。2016年共鑒定出5種基因型，分別 為F01、F02、F03、F05、D02，其中F-01基因型 60 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 60 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 菌株24株（75.0%），占比最高。2017年共鑒定出 6種基因型。可見黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌SSR基 因型多樣性逐年增加，F(xiàn)-01基因型為優(yōu)勢基因型， 各年份間F-01基因型所占比例存在差異（圖1）。 從采集地點(diǎn)來看（圖2） ，哈爾濱市采集分離 的菌株只有F-01和D-02 2種基因型，分別占鑒定 總菌株數(shù)的90.0和10.0。綏化市采集分離的菌 株SSR基因型最多，有7種，其中F-01基因型47 株（74.6），占比最高。齊齊哈爾市共鑒定出5種 SSR基因型（圖2）。 2.5 馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型分析 根據(jù)mtDNA單倍型和SSR基因型，20152017 年黑龍江省采集分離的菌株共劃分成9種multi- locus基因型（表2），優(yōu)勢基因型均為multi-locus A 基因型。其中2015年采集分離的馬鈴薯晚疫病菌 共鑒定出4種multi-locus基因型，2016年共鑒定 出7種multi-locus 基因型，其中multi-locus F基因 型只在2016年分離的菌株中出現(xiàn)。2017年共鑒定 出8種基因型。Multi-locus H基因型和multi-locus I 表2 黑龍江省分離的馬鈴薯晚疫病菌采集年份與multi-locus基因型分析 multi-locus基因型 采集年份/個(gè)數(shù)（占比） 交配型/個(gè)數(shù) 2015 2016 2017 A1 A2 自育型 總菌株數(shù) A 15（68.2%） 18（56.3%） 49（68.1%） 69 6 7 82 B 3（13.6%） 6（18.8%） 7（9.6%） 15 1 0 16 C 2（9.1%） 4（12.5%） 6（8.3%） 12 0 0 12 D 2（9.1%） 1（3.1%） 2（2.8%） 4 1 0 5 E 0（0） 1（3.1%） 1（1.4%） 2 0 0 2 F 0（0） 1（3.1%） 0（0） 1 0 0 1 G 0（0） 1（3.1%） 3（4.2%） 4 0 0 4 H 0（0） 0（0） 3（4.2%） 3 0 0 3 I 0（0） 0（0） 1（1.4%） 1 0 0 1 注：Aa，F(xiàn)-01；Ba，F(xiàn)-01；Ca，F(xiàn)-05；Da，F(xiàn)-03；Ea，F(xiàn)-03；Fa，F(xiàn)-02；Ga，D-02；Ha，F(xiàn)-06；Ia，G-02； 下表同。 圖2 采集地區(qū)與馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型關(guān)系 100 80 60 40 20 0 SSR基因型占比/% 年份 2015 2016 2017 F-03 F-01 F-02 F-05 G-02 D-02 F-06 100 80 60 40 20 0 SSR基因型占比/% 地點(diǎn) 哈爾濱市 綏化市 齊齊哈爾市 F-03 F-01 F-02 F-05 G-02 D-02 F-06 10.0 1.6 3.2 1.9 11.3 7.5 77.4 1.9 3.2 9.5 1.6 6.3 74.6 90.0 圖1 采集年份與馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型關(guān)系 100 80 60 40 20 0 SSR基因型占比/% 年份 2015 2016 2017 F-03 F-01 F-02 F-05 G-02 D-02 F-06 100 80 60 40 20 0 SSR基因型占比/% 地點(diǎn) 哈爾濱市 綏化市 齊齊哈爾市 F-03 F-01 F-02 F-05 G-02 D-02 F-06 9.1 9.1 81.8 3.1 12.6 6.2 3.1 75.0 1.4 4.2 4.2 8.2 4.2 77.8 基因型只在2017年分離的菌株中出現(xiàn)。Multi-locus 基因型多樣性呈逐年增加的趨勢。 從表3可以看出，哈爾濱市采集分離的菌株鑒 定出3種基因型，綏化市采集分離的菌株共鑒定出 9種基因型，其中multi-locus F和multi-locus I基 因型僅在綏化市出現(xiàn)。齊齊哈爾市采集分離的菌株 中共鑒定出7種基因型。表明綏化市各馬鈴薯主產(chǎn) 區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌基因型更為豐富（表3）。 綜合上述multi-locus基因型和交配型結(jié)果， multi-locus基因型為A基因型的馬鈴薯晚疫病菌其 交配型類型為A1、A2和自育型，基因型B和基因 型D的馬鈴薯晚疫病菌其交配型類型為A1和A2。 其余幾種multi-locus基因型的馬鈴薯晚疫病菌交配 型都為A1。 61 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 61 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 3 結(jié)論與討論 3.1 馬鈴薯晚疫病菌交配型 馬鈴薯晚疫病菌是危害馬鈴薯、番茄等作物的 一種卵菌綱致病真菌，20122013年馬鈴薯晚疫病 在全國范圍內(nèi)偏重發(fā)生，發(fā)生范圍廣且流行快，對 馬鈴薯造成嚴(yán)重危害（黃沖和劉萬才，2016）。 王鶴等（2012）對2009年在黑龍江省采集的 菌株進(jìn)行交配型檢測，結(jié)果表明鑒定菌株均為A1 交配型。郭梅等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，20112012 年在黑龍江省哈爾濱、綏化望奎縣、齊齊哈爾克 山等地發(fā)現(xiàn)大量A2交配型馬鈴薯晚疫病菌菌株， 2011年A2交配型占被測菌株的23.08%；2012年 占被測菌株的30%。由此可見，黑龍江省馬鈴薯 晚疫病菌交配型逐年復(fù)雜，但2014年后有關(guān)黑龍 江省馬鈴薯晚疫病菌交配型方面的報(bào)道較少。本試 驗(yàn)對20152017年在黑龍江馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集分 離出的晚疫病菌進(jìn)行交配型測定，研究發(fā)現(xiàn)自育型 菌株出現(xiàn)頻率逐年增加。從采集地點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)哈爾 濱市只有A1交配型菌株，綏化市和齊齊哈爾市出 現(xiàn)3種交配型，說明與其他2個(gè)地區(qū)相比，哈爾濱 市馬鈴薯晚疫病菌交配型較為單一。這一結(jié)論與郭 梅等（2015）的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)也說明綏 化市和齊齊哈爾市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)有可能發(fā)生有性生 殖，并導(dǎo)致馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性更加復(fù) 雜化。 3.2 馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型和SSR基因型 通過測定馬鈴薯晚疫病菌基因型，可對晚疫病 菌遺傳變異進(jìn)行探究，為防治馬鈴薯晚疫病提供理 論依據(jù)。本試驗(yàn)對20152017年在黑龍江各馬鈴 薯主產(chǎn)區(qū)采集的馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行mtDNA單倍 表3 黑龍江省分離的馬鈴薯晚疫病菌采集地區(qū)與multi-locus基因型分析 multi-locus基因型 采集地點(diǎn)/個(gè)數(shù)（占比） 交配型/個(gè)數(shù) 哈爾濱市 綏化市 齊齊哈爾市 A1 A2 自育型 總菌株數(shù) A 8（80.0%） 38（60.3%） 36（67.9%） 67 8 5 82 B 1（10.0%） 10（15.8%） 4（7.5%） 14 1 0 15 C 0（0） 6（9.5%） 6（11.3%） 12 0 0 12 D 0（0） 2（3.2%） 4（7.5%） 4 2 0 6 E 0（0） 1（1.6%） 1（1.9%） 2 0 0 2 F 0（0） 1（1.6%） 0（0） 1 0 0 1 G 1（10.0%） 2（3.2%） 1（1.9%） 4 0 0 4 H 0（0） 2（3.2%） 1（1.9%） 3 0 0 3 I 0（0） 1（1.6%） 0（0） 1 0 0 1 型鑒定，鑒定出a和a兩種單倍型。其中，a單 倍型為優(yōu)勢基因型，與張鉉哲等（2015）的研究結(jié) 果一致，但未發(fā)現(xiàn)b單倍型菌株。同時(shí)，本試驗(yàn) 對晚疫病菌進(jìn)行SSR基因型測定，與李微（2015） 對20122014年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌SSR基 因型測定結(jié)果相比，鑒定出新的基因型F-06基因 型。從分離年份上看，2017年黑龍江省晚疫病菌 SSR基因型更為豐富，從采集地區(qū)方面分析，綏化 市各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型更多 樣化。 3.3 馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型 利用馬鈴薯晚疫病菌的交配型和multi-locus基 因型，對馬鈴薯晚疫病菌的表現(xiàn)型和基因型進(jìn)行系 統(tǒng)綜合分析。本試驗(yàn)中，2017年在黑龍江省采集分 離的晚疫病菌multi-locus基因型最多，說明黑龍江 省馬鈴薯晚疫病群體結(jié)構(gòu)逐年復(fù)雜。從分離地點(diǎn)分 析，綏化市采集分離的馬鈴薯晚疫病菌multi-locus 基因型最為豐富。交配型與multi-locus基因型綜合 分析結(jié)果表明，multi-locus A基因型、multi-locus B基因型和multi-locus D基因型與交配型沒有相關(guān) 性，其余multi-locus 基因型與交配型相關(guān)。 哈爾濱市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)馬鈴薯晚疫病菌 multi-locus基因型多樣性較低，說明該地區(qū)馬鈴薯 晚疫病菌遺傳結(jié)構(gòu)較為簡單；而綏化市采集的馬鈴 薯晚疫病菌multi-locus基因型最多，表明該地區(qū) 馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)更具多樣性?？傮w來 說，20152017年黑龍江省各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的晚疫 病菌群體結(jié)構(gòu)逐年復(fù)雜，給黑龍江省馬鈴薯晚疫病 的防治帶來了新的挑戰(zhàn)。綏化市可能是黑龍江省馬 鈴薯晚疫病的起源中心，未來該地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)對馬鈴 薯晚疫病的監(jiān)控。 62 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 62 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 參考文獻(xiàn) 關(guān)紅穎.2011.黑龍江省馬鈴薯晚疫病的發(fā)生與防治.中國馬鈴薯， 25（3）：173-174. 郭梅，Vincent C，閔凡祥，呂軍，高云飛，楊帥，王曉丹，Jean- louis R.2015.黑龍江省發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）A2交配型.中國馬鈴薯，（3）：171-174. 黃沖，劉萬才.2016.近幾年我國馬鈴薯晚疫病流行特點(diǎn)分析與監(jiān) 測建議.植物保護(hù)，42（5）：142-147. 金光輝，李學(xué)湛，王玉成，王騰.2017.年際間干旱對晚疫病菌生 理小種復(fù)雜性的影響.植物保護(hù)，（4）：167-173. 李建武.2011.SSR標(biāo)記技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種研究中的應(yīng)用.中 國蔬菜，（20） ：1-8. 李微.2015.黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)的研究碩士論 文.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué). 閔凡祥，王曉丹，胡林雙，魏琪，董學(xué)志，劉偉婷，郭梅.2010. 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The results indicated that 3 mating types of A1，A2 and 63 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 63 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES QuEChERS 法動態(tài)監(jiān)測及評價(jià)山西省韭菜 中12 種農(nóng)藥殘留 郭麗麗 1花 錦 2* （ 1 山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，山西晉中 030619； 2 山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 山西太原 030024） 摘 要：采用乙腈超聲提取，經(jīng)PSA、C 18 基質(zhì)分散凈化，通過液質(zhì)聯(lián)用及氣質(zhì)聯(lián)用建立了韭菜中吡蟲啉、敵敵畏、毒死蜱、 多菌靈、腐霉利、甲胺磷、甲氰菊酯、克百威、六六六、氯丹、 （高效）氯氟氰菊酯、阿維菌素等12種農(nóng)藥的QuEChERS（quick， easy，cheap，effective，rugged，safe）快速檢測方法，并對山西省市售韭菜的農(nóng)藥殘留狀況進(jìn)行了動態(tài)監(jiān)測和評價(jià)。結(jié)果表明： 山西省韭菜中農(nóng)藥殘留的總檢出率為80%，超標(biāo)率為20%，使用比較多的農(nóng)藥為吡蟲啉、敵敵畏、多菌靈、腐霉利、甲氰 菊酯和（高效）氯氟氰菊酯，腐霉利超標(biāo)是韭菜產(chǎn)品不合格的主要因素。8月后太原及周邊地區(qū)韭菜中的農(nóng)藥殘留水平較高， 且該地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場與超市韭菜中農(nóng)藥殘留的檢出率相近，但前者超標(biāo)率（27.3%）明顯高于后者（9.1%）。 關(guān)鍵詞：QuEChERS；韭菜；農(nóng)藥殘留；監(jiān)測；評價(jià) 2012） 。然而韭菜生產(chǎn)中韭蛆、灰霉病等病蟲害多 發(fā)，種植過程中需要適量使用農(nóng)藥以減少病蟲害損 失（Farha et al.，2017）。但是一些菜農(nóng)為了追求產(chǎn) 量，經(jīng)常采用灌根的方法將一些高毒農(nóng)藥用于韭蛆 的防治（宋丹 等，2016） ，造成韭菜中農(nóng)藥殘留超 標(biāo)，中毒事件頻頻發(fā)生（王文嬌 等，2011）。2017 年11月1日起，山東省全面啟動實(shí)施韭菜產(chǎn)品“雙 證制”管理，嚴(yán)禁無合格證和市場銷售憑證 的韭菜產(chǎn)品進(jìn)入食用農(nóng)產(chǎn)品市場、生產(chǎn)加工、餐飲 服務(wù)環(huán)節(jié)。這一舉措反映出韭菜農(nóng)藥殘留問題的日 益嚴(yán)重性，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)韭菜中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測 郭麗麗，女，講師，專業(yè)方向：食品安全與檢測，E-mail： cauguolili163.com *通訊作者（Corresponding author）：花錦，女，工程師，專業(yè)方向：食 品安全，E-mail：hua-jin1986163.com 收稿日期：2017-12-12；接受日期：2018-02-01 基金項(xiàng)目：國家認(rèn)監(jiān)委檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目（2012B131） ，山西中醫(yī) 藥大學(xué)博士科研啟動項(xiàng)目（2015BK11） 韭菜是我國的特色蔬菜，味道鮮美、香味獨(dú)特， 具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值。韭菜含有VC、VB 1 等多種 維生素及礦物質(zhì)，還含有豐富的纖維素，可以促進(jìn) 腸道蠕動。韭菜中硫化物的獨(dú)特辛香味具有一定的 殺菌消炎作用，有助于提高人體免疫力（商飛飛， self-fertility were found in 126 strains isolated，accounting for 88.1%，6.3% and 5.6% of the total isolates， respectively. Two mtDNA haplotypes，a and a，were identified，accounting for 17.5% and 82.5% of the total number of isolates，respectively. Seven SSR genotypes，F(xiàn)-01，F(xiàn)-02，F(xiàn)-03，F(xiàn)-05，F(xiàn)-06，D-03 and G-02， were identified from 126 isolates tested. Among them，the F-01 genotype（77.8%）was dominant ge</p>
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