園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2141 2152. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0269； http： /www. ahs. ac. cn 2141 收稿日期 ： 2018 07 16； 修回日期 ： 2018 10 22 基金項(xiàng)目 ： 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ 2016YFD0100204-25， 2016YFD0101705-5） ；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ 31430075） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： jfchennjau.edu.cn） 黃瓜 / 酸黃瓜漸滲系 IL77抗蔓枯病主效 QTL定位及候選基因鑒定 張 旭，徐 建，李 季，婁群峰，陳勁楓*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095） 摘 要： 以黃瓜 /酸黃瓜漸滲系 IL77為抗病親本，栽培種 8419為感病親本，通過親本及 F26群體篩選，構(gòu)建了包含 137 對 SSR 標(biāo)記和 6 對 InDel 標(biāo)記的遺傳圖譜，結(jié)合 2017 年春、秋兩季 F26群體表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果對抗蔓枯病主效 QTL 進(jìn)行定位；同時(shí)構(gòu)建極端混池并進(jìn)行 QTL-seq，最終將抗病基因定位到 1 號染色體 24.6 27.1 Mb 范圍內(nèi)；通過與參考基因組 9930 比對發(fā)現(xiàn)該區(qū)段存在 13 個(gè)基因在外顯子區(qū)域發(fā)生非同義突變，其中 Csa1G654870 參與 RNAi 抗性反應(yīng)，可能與抗蔓枯病過程相關(guān)。通過 qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，接種前后 Csa1G654870 在抗病親本 IL77中表達(dá)量明顯高于感病親本 8419 ，由此進(jìn)一步推斷 Csa1G654870 是抗蔓枯病基因。 關(guān)鍵詞： 黃瓜；漸滲系；蔓枯??；遺傳圖譜；混池測序；抗病基因 中圖分類號： S 642.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 11-2141-12 QTL Mapping and Identification of Candidate Gene for Resistance to Gummy Stem Blight in Cucumis sativus/hystrix Introgression Line IL77 ZHANG Xu， XU Jian， LI Ji， LOU Qunfeng， and CHEN Jinfeng*（ College of Horticulture， State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China） Abstract： In this study， a linkage map containing 137 pairs of SSR markers and 6 pairs of InDel markers was constructed using recombinant inbred lines F26derived from a cross between parental lines IL77 （ resistant line from the cross of C. hystrix × C. sativus） and 8419 （ susceptible line） . Genetic analysis indicated that the resistance to gummy stem blight（ GSB） in IL77 was quantitative. Both mapping and BSA-seq analysis were used to detect quantitative trait loci（ QTLs） conferring GSB resistance in cucumber leaves. The results showed that the GSB resistance genes were located in the 24.6 27.1 Mb region of chromosome 1. There were 13 candidate genes with exonic nonsynonymous SNP mutation predicted as GSB-resistance related genes in this region. Moreover， bioinformatics analysis and qRT-PCR results provided strong evidence that Csa1G654870 was closely related to GSB resistance process. Keywords： cucumber； introgression line； gummy stem blight； linkage map； BSA-seq； resistance gene 瓜類蔓枯病由瓜類黑腐球殼菌 Didymella bryoniae（ Auersw.） Rehm 引起，至少危害葫蘆科 12 個(gè) Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line IL77 . 2142 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 屬 23 種作物（ Keinath， 2011） 。蔓枯?。?Gummy stem blight， GSB）發(fā)病部位一般為葉片和莖部，受傷部位更易感?。?Stamand & Wehner， 1995） ，引起幼苗猝倒，加速莖和葉柄潰爛，最終影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)（ Basim et al.， 2016） 。由于葫蘆科作物普遍缺乏穩(wěn)定抗性，蔓枯病給作物生產(chǎn)帶來了巨大損失（ dos Santos et al.， 2013） 。 不同作物遺傳特性及抗性存在差異（ Keinath， 2014） 。在甜瓜中已發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定抗源 PI140471 含抗性基因 Gsb-1（ Frantz & Jahn， 2004）以及抗源 PI420145 含抗性基因 Gsb-6（ Wolukau et al.， 2009） ，并由此開發(fā)了一系列分子標(biāo)記，為甜瓜抗蔓枯病分子育種奠定了良好基礎(chǔ)，其他葫蘆科作物通過選取抗性砧木進(jìn)行嫁接在一定程度上增強(qiáng)了抗性（ Ito et al.， 2009） 。而黃瓜由于遺傳基礎(chǔ)狹窄（ Horejsi & Staub， 1999） ，目前還沒有發(fā)掘到主效抗病基因。種間雜交擴(kuò)大了黃瓜的變異來源（ Chen et al.，1997） ， 通過 C. hystrix × C. sativus， 對 F2的 52 個(gè)漸滲系和 8 個(gè)栽培種進(jìn)行篩選， 用 SSR 標(biāo)記進(jìn)行 QTL定位，發(fā)現(xiàn)了漸滲系 HH1-8-1-2 的 2 個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)分別在 4 號和 6 號染色體上，跨度分別為 3.569和 1.299 Mb（ Lou et al.， 2013） 。以黃瓜品種 PI183967和 931分別為抗感親本，通過構(gòu)建 RIL F9（ 160 株）及包含 405 個(gè) SSR 標(biāo)記的遺傳圖譜，將控制幼苗蔓枯病抗性的候選基因定位到 5 號染色體上，并鑒定出該區(qū)段 7 個(gè) NBS-LRR 類基因，但缺少進(jìn)一步分析及驗(yàn)證過程（ Liu et al.， 2017） 。 集群分離分析法（ Bulk Segregant Analysis， BSA）主要是通過選擇表型差異顯著的親本構(gòu)建分離群體（或家系群體） ，并從分離群體中選擇目標(biāo)性狀極端的單株構(gòu)建 DNA 混池（ DNA pools）進(jìn)行候選基因定位。 QTL-seq 已廣泛應(yīng)用于水稻耐鹽性狀 （ Takagi et al.， 2015） ， 黃瓜早花性狀 （ Lu et al.，2014） ，赤擬谷盜抗磷性狀（ Jagadeesan et al.， 2013）候選基因的發(fā)掘，以及矮生梨育種（李煒 等，2015） 、葡萄白腐?。ㄐ煅?等， 2003）抗性育種相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)。本研究以黃瓜 /酸黃瓜漸滲系 IL77和栽培種 8419分別作為蔓枯病抗病、感病親本，接種蔓枯病菌后通過構(gòu)建遺傳圖譜進(jìn)行 QTL 定位， 并結(jié)合 BSA 測序開發(fā) InDel 標(biāo)記并縮小定位區(qū)間， 最終在 1 號染色體上獲得主效 QTL并得到 1 個(gè)候選基因 Csa1G654870。通過基因注釋及 qRT-PCR 驗(yàn)證，推斷其為抗蔓枯病候選基因。 1 材料與方法 1.1 材料和群體構(gòu)建 試驗(yàn)材料有抗病親本黃瓜 /酸黃瓜漸滲系 IL77 （野生種 C. hystrix 與普通栽培黃瓜 CC3種間雜交后代）、感病親本普通栽培黃瓜 8419（由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃瓜研究室保存）及其雜交后代 RIL 群體 F26。選取本實(shí)驗(yàn)室前期分離純化的強(qiáng)致病力 A1 蔓枯病菌菌種為接種病菌，用 PDA 試管保存于 4 冰箱備用。 1.2 幼苗接種與病級統(tǒng)計(jì) 將保存在 4 冰箱的蔓枯病菌轉(zhuǎn)移到 PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)， 25 暗培養(yǎng) 7 d 后進(jìn)行 4 d 紫外燈光照處理（ 12 h 紫外燈 /12 h 黑暗），誘導(dǎo)分生孢子產(chǎn)生。用無菌水配制孢子懸浮液，并用乳酸調(diào)整孢子懸浮液至 pH 3.5 4.0，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子濃度。用于接種的孢子濃度為 1 × 106分生孢子 /毫升，接種前加入 2.5 g · L-1的吐溫 80 作為表面活性劑。 分別于 2017 年春季和秋季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓基地和白馬基地進(jìn)行接種試驗(yàn)。在幼苗 3 4 片真葉時(shí)人工噴霧接種，噴灑至葉面滴水為止。接種后覆蓋棚膜 3 d 遮光密閉，保證棚內(nèi)相對濕度 92% 95%，晝夜溫度 25 /21 。接種 3 d 后揭開棚膜，保證幼苗正常生長所需光照、溫度和水分條件。張 旭，徐 建，李 季，婁群峰，陳勁楓 . 黃瓜 /酸黃瓜漸滲系 IL77抗蔓枯病主效 QTL 定位及候選基因鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 2143 接種 10 d 后參照 Zhang 等（ 2013）的方法進(jìn)行病級統(tǒng)計(jì)。 1.3 總 RNA 提取和極端混池測序 2017 年春季對接種 0、 2、 4 和 6 d 后的抗、感親本 IL77和 8419進(jìn)行葉部取樣，利用 Total RNA Kit（ TaKaRa， Japan）提取葉片總 RNA 用于相關(guān)抗病基因的定量驗(yàn)證，提取步驟參考試劑盒說明。根據(jù) Murray 和 Thompson（ 1980）的 CTAB 法并做改良，提取親本 IL77、 8419及 RIL群體 F26新鮮葉片的 DNA，用于遺傳圖譜構(gòu)建及極端混池測序分析。以標(biāo)準(zhǔn)濃度 DNA 為對照，取2 L DNA 溶液于瓊脂糖凝膠（ 1%EB）檢測濃度。 根據(jù) 2017 年春季病級統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，挑選接種 10 d 后病級最高和最低的黃瓜苗各 20 株對葉部取樣并提取 DNA。將提取的 DNA 分別等量混合作為抗病池和感病池進(jìn)行 BSA-seq，親本池選擇 IL77進(jìn)行重測序。對測序結(jié)果的原始圖像數(shù)據(jù)利用軟件 bcf2fastq（ version 2.17.1.14）進(jìn)行圖像堿基識別（ Base calling），進(jìn)行初步質(zhì)量分析；使用二代測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)軟件 cutadapt（ version 1.9.1）對測序原始數(shù)據(jù)（ Pass Filter Data）去除接頭以及低質(zhì)量序列等；利用 Dragen 比對軟件將 clean data 比對到參考基因組 9930 上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比對； 基于比對結(jié)果， 使用 Samtools（ version 1.1） 軟件， 以及 GATK的 Unified Genotyper 模塊進(jìn)行 SNV（單堿基突變） /InDel（插入或缺失突變）的檢測，檢測參考基因組每個(gè)位點(diǎn)是否存在 SNV 或者 InDel 突變。 1.4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建 SSR 引物序列來源于 9930和 Gy14黃瓜基因組測序信息。 經(jīng)雙親重測序利用 SAMTOOLS 檢測長度小于 50 bp 小片段的插入與缺失，并用 Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì) InDel 引物（由擎科生物技術(shù)有限公司合成）。選擇均勻分布于 7 條染色體上的 1 335 對 SSR 引物及 31 對 InDel 引物對親本 IL77和 8419進(jìn)行多態(tài)性分析，獲得的多態(tài)性引物用于 117 株 RIL 群體 F26單株的基因型鑒定。 PCR反應(yīng)總體系為 10 L： 2× Taq Master Mix（含有 Taq 酶、 dNTPs、 MgCl2、 buffer） 5 L，正、反向引物各 1 L， DNA 1 L， ddH2O 2 L。聚丙烯酰胺凝膠電泳后顯色統(tǒng)計(jì)。銀染方法： 400 mL 蒸餾水 + 0.8 g AgN03，可染 6 塊 102 孔的膠，銀染 7 min；蒸餾水清洗約 1 min； 6 g NaOH + 400 mL ddH2O + 4 mL HCHO，顯色 3 min；與母本 IL77帶型一致的記為 A，與父本 8419帶型一致的記為 B，雜合帶型記為 H，模糊或缺失的條帶用 X 表示。采用 QTL loci Mapping 軟件 MAP 功能作圖。 1.5 主效 QTL 定位 根據(jù)溫室接種表型，利用 Microsoft Excel 97-2003 統(tǒng)計(jì)并處理病級數(shù)據(jù)，獲得兩季病情指數(shù)分布圖用于遺傳分析，其中病情指數(shù)用于 QTL 檢測。病情指數(shù) = （病級 × 該病級株數(shù)） /（最高病級 × 調(diào)查總株數(shù)） × 100。 利用 QTL loci Mapping 軟件 BIP 功能，采用復(fù)合區(qū)間作圖法（ CIM）檢測抗蔓枯病主效 QTL位點(diǎn)。步長 1 cM，在 = 0.01 水平，以 Permutation 檢驗(yàn)法重復(fù)檢驗(yàn) 1 000 次，將 LOD 閾值設(shè)定為2.0 來確定 QTL 在染色體上的位置及數(shù)目。 QTL 命名規(guī)則：性狀的英文縮寫 + 染色體編號 + QTL編號，如染色體上只有 1 個(gè) QTL 可不進(jìn)行染色體編號。 對于混池測序數(shù)據(jù)，基于基因分型結(jié)果，選擇親本（含有極端性狀）作為參考，以 1 Mb 大小為窗口， 1 kb 為步長分析計(jì)算兩個(gè)子代在親本間標(biāo)記位點(diǎn)的 SNP-index，并對 SNP-index 在染色體上的分布進(jìn)行作圖，通過兩個(gè)子代 SNP-index 作差計(jì)算 （ SNP-index），進(jìn)行 1 000 次置換檢驗(yàn)，選取 95%置信水平作為篩選的閾值，置信水平線以上的窗口作為候選區(qū)間。 Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line IL77 . 2144 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 1.6 qRT-PCR 驗(yàn)證 根據(jù)基因定位及注釋結(jié)果， 推測位于 1 號染色體定位區(qū)段內(nèi)的 Csa1G654870 與蔓枯病抗性相關(guān)，并對其在抗病、 感病品種中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。 用 Primer5.0 進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)， 引物序列如下：正向引物 5-ATTGTTTCTGCTGTGGCTCTT-3；反向引物 5-TTCTTCTTTGACTGGGTTTGC-3。 使用 TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTM PCR 試劑盒進(jìn)行 qRT-PCR。本試驗(yàn)所用 PCR 儀器型號為ABl7500。對每個(gè)樣本和內(nèi)部參照進(jìn)行擴(kuò)增，重復(fù) 3 次。通過比較 Ct 的方法進(jìn)行基因表達(dá)水平的相對定量分析，為消除樣品間模板量的差異， Ct 是看家基因的歸一化， Ct 是基準(zhǔn)品的歸一化。 2 結(jié)果與分析 2.1 表型統(tǒng)計(jì)與遺傳分析 2017 年春季和秋季分別在牌樓和白馬基地溫室進(jìn)行接種鑒定（圖 1，圖 2）， RIL 群體病情指數(shù)分布如圖 3 所示。 2017 年春季 RIL 群體病情指數(shù)分布更為集中，極少有極抗或極感株型，病情指數(shù)大多分布在 30 60 之間，而秋季病級分布較為均勻。兩季表型數(shù)據(jù)都呈現(xiàn)連續(xù)分布，符合數(shù)量性狀的遺傳特征，可以用于 QTL 檢測。 圖 1 田間（牌樓基地）自然狀態(tài)抗病親本 IL77 （ a） 、 感病親本 8419 （ b）及其接種 7 d 后（ c、 d）生長狀況 Fig. 1 Growth of resistant line L77 （ a） ， susceptible line 8419 （ b） under natural environment and their performance in 7 d after inoculation（ c， d） 圖 2 根據(jù)葉片發(fā)病面積對黃瓜蔓枯病劃分病級 Fig. 2 Disease rating scale of each seedling corresponding to the symptom of leaves 張 旭，徐 建，李 季，婁群峰，陳勁楓 . 黃瓜 /酸黃瓜漸滲系 IL77抗蔓枯病主效 QTL 定位及候選基因鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 2145 圖 3 RIL 群體接種后的枯萎病病情指數(shù)分布 Fig. 3 Frequency distribution of disease index of GSB in RIL population 2.2 連鎖圖譜構(gòu)建 利用 1 335 對 SSR 引物對 IL77和 8419進(jìn)行雙親多態(tài)引物篩選，獲得 250 對多態(tài)引物，多態(tài)率為 18.7%。將 250 對親本多態(tài)性引物用于 10 個(gè) RIL F26單株多態(tài)性檢測，共得到 137 對 SSR引物用于后續(xù)群體圖譜構(gòu)建。 最終利用 118 株 RIL 群體構(gòu)建了含有 137 對 SSR 引物的遺傳圖譜 （圖 4） 。 圖 4 基于 IL77 × 8419 雜交產(chǎn)生的 RIL F2 6群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜 Fig. 4 Linkage map based on RIL F2 6population derived from a cross between IL77 × 8419 Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line IL77 . 2146 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 表 1 遺傳圖譜數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) Table 1 Statistics of linkage map 染色體 Chromosome 標(biāo)記數(shù) Marker numbers總長度 /cM Total length 標(biāo)記平均間距 /cM Mean marker intervalChr1 16 121.38 7.59 Chr2 11 172.90 15.72 Chr3 16 122.82 7.68 Chr4 22 121.46 5.52 Chr5 17 176.68 10.39 Chr6 35 481.91 13.77 Chr7 18 171.46 9.53 總計(jì) Total 135 1 368.61 由于 SSR 引物來源于黃瓜基因組測序， 因此構(gòu)建的 7 個(gè)連鎖群分別與黃瓜的 7 條染色體相對應(yīng)。遺傳圖譜數(shù)據(jù)如表 1 所示，連鎖圖譜總長度為 1 368.61 cM， 標(biāo)記間平均間距為 10.1 cM。最長的連鎖群在 6 號染色體，最短的在 1號染色體，每個(gè)連鎖群標(biāo)記數(shù)在 11 35 之間。 2.3 抗蔓枯病主效 QTL 定位 2017 年春、秋兩季對幼苗接種蔓枯病菌后的表型統(tǒng)計(jì)，以 LOD 2.0 為閾值，檢測到 1 個(gè)抗蔓枯病主效 QTL 位點(diǎn)（表 2）。 2017 春、秋兩季主效 QTL 位點(diǎn)都在 Chr1 上，且都位于 SSR22637 UW083739 之間， LOD 值分別為 2.533 和2.308，可解釋表型變異率分別為 12.11%和 11.29%，遺傳距離為 7 cM，物理位置 22.8 27.5 Mb 之間。 表 2 利用 RIL F2： 6群體在 2017 年春秋兩季檢測到的 QTL Table 2 QTL loci detected in RIL F2： 6in 2017 spring and 2017 autumn 性狀名 Trait name 染色體 Chr 位置 /cM Position 數(shù)量性狀位點(diǎn)QTL 標(biāo)記范圍 Marker interval LOD 值 LOD score 可解釋表型 變異率 /% PVE 加性效應(yīng) Add 春季 Spring 1 89.00 Gsb1 SSR22637 UW083739 2.308 11.29 5.63 秋季 Autumn 1 89.00 Gsb1 SSR22637 UW083739 2.533 12.11 4.60 2.4 BSA-seq 鑒定出 1 個(gè)抗蔓枯病主效位點(diǎn) 對親本 IL77 重測序以及對由子代 F26構(gòu)建的抗病、感病混池進(jìn)行 Illumina Hi-seq 高通量測序，測序數(shù)據(jù)情況如表 3 所示。通過對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，對低質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并去除污染及接頭序列，最終在親本池 IL77產(chǎn)生 67 995 804 條片段，抗病池（ R pool）產(chǎn)生 71 156 550 條片段，感病混池（ S pool）產(chǎn)生 92 604 704 條片段，每條片段由 150 個(gè)堿基構(gòu)成。通過與 9930 參考基因組比對，比對上參考基因組的片段比例都在 90%以上，覆蓋度都在 95%以上，表明參考基因組的選擇合理。 表 3 過濾后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表 Table 3 Statistics of clean data 樣本 Sample 待測片段 Clean reads 片段長度 /bp Length 準(zhǔn)確度 Q30/% 與參考基因組相同片段 Mapped reads 相同片段占比 /% Mapped ratio 覆蓋度 /% Coverage IL77 67 995 804 150 94.09 64 358 659 94.65 96.74 抗病池 R pool 71 156 550 150 94.16 66 736 647 93.79 97.23 感病池 S pool 92 604 704 150 94.14 86 912 525 93.85 97.27 基于基因分型的結(jié)果，通過篩選親本純合的 SNP 位點(diǎn)，并以抗病親本 IL77基因組作為參考，以 1 Mb 大小為窗口， 1 kb 為步長分析計(jì)算得到抗病池和感病池在親本間標(biāo)記位點(diǎn)的 SNP-index（即SNP 的頻率，完全與親本相同的 SNP-index 為 0，完全與其不同的 SNP-index 為 1）。通過兩個(gè)子代張 旭，徐 建，李 季，婁群峰，陳勁楓 . 黃瓜 /酸黃瓜漸滲系 IL77抗蔓枯病主效 QTL 定位及候選基因鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 2147 SNP-index 作差： （ SNP-index） = SNP index（極端性狀 B） SNP index（極端性狀 A），進(jìn)行 1 000次置換檢驗(yàn)。選取 95%置信水平作為篩選的閾值，折線即為以窗口形式展現(xiàn)的（ SNP-index）分布，置信水平線以上的窗口為候選區(qū)間，最終將目標(biāo)區(qū)域定位到 Chr1 23.3 27.1 Mb 之間（圖 5）。 圖 5 通過 QTL-seq 得到不同染色體上（ Chr1 Chr7）抗感池之間 SNP-index 分布圖 Fig. 5 SNP-index graph was calculated by combining the information of SNP-index in R-pool and S-pool from QTL-seq 2.5 開發(fā) InDel 標(biāo)記縮小定位區(qū)間 基于雙親重測序結(jié)果，利用 Primer 5.0 軟件在 SSR22637 UW083739 之間繼續(xù)設(shè)計(jì) 31 對 InDel標(biāo)記加密遺傳連鎖圖譜，最終得到 6 對 InDel 標(biāo)記在雙親及 RIL F26群體具有多態(tài)性（表 4），同時(shí)將 2017 年春、秋兩季主效 QTL 區(qū)間都定位到 InDel12 SSR22637 之間，遺傳距離為 8 cM， LOD值分別為 2.1 和 2.2，可解釋表型變異率分別為 10.1%和 10.8%，物理位置在 Chr1 上 24.6 27.5 Mb之間（圖 6）。結(jié)合 QTL-seq 定位結(jié)果，最終定位區(qū)間為 Chr1 上 24.6 27.1 Mb 之間，將主效 QTL縮小到 2.5 Mb 之間。 Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line IL77 . 2148 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 表 4 黃瓜 1 號染色體上 SSR22637 UW083739 之間的多態(tài)性 InDel 標(biāo)記信息 Table 4 Information of InDel markers between SSR22637 UW083739 in Chr 1 標(biāo)記 Marker 位置 /堿基 /bp Position 引物序列（ 5' 3'） Primer sequence InDel 7 23 457 126 F： CCATCCTCATCCTCTATCAA； R： CTCTCCAATTGTAATCGCTC InDel 9 23 948 898 F： AAAGATGGAACTTGTTCGTG； R： AGCCACATACTTCAGATGCT InDel 10 24 177 884 F： GGCAACATAACATAATTCCG； R： GGCAAGTAGAGACAAAATGC InDel 12 24 635 328 F： CGAAATGGTCTCTCTAGGTG； R： ATTATCCCGTTAGTCGATCC InDel 26 27 861 935 F： TCGATACACTGATACGACACA； R： CACATGTATATCGTGGCAAG InDel 29 28 540 709 F： GCAATGTGATTCGATCTCTAC； R： TGGTTTATGGACTAACCGAG 圖 6 2017 年春、秋兩季主效 QTL 定位到 InDel12 SSR22637 之間 Fig. 6 QTLs detected in both 2017 spring and autumn were located between markers InDel12 SSR22637 2.6 黃瓜抗蔓枯病候選基因篩選與鑒定 結(jié)合傳統(tǒng)遺傳圖譜 QTL 定位與 QTL-seq，將抗蔓枯病基因定位到 1 號染色體 24.6 27.1 Mb 范圍內(nèi)，與參考基因組 9930 測序數(shù)據(jù)比對后發(fā)現(xiàn)，該區(qū)段共有 143 個(gè)基因完成注釋。根據(jù) SNP 發(fā)生突變的區(qū)域?qū)⑦@些基因分為 5 個(gè)類型：非編碼區(qū)域突變、基因上游區(qū)域突變、基因下游區(qū)域突變、外顯子區(qū)域突變、內(nèi)含子區(qū)域突變類型。外顯子區(qū)域突變類型基因共有 23 個(gè)，其中發(fā)生同義突變的基因有 10個(gè)， 發(fā)生非同義突變的基因有 13個(gè) （表 5） 。 通過對這 13個(gè)基因進(jìn)行注釋， 發(fā)現(xiàn) Csa1G654870與抗病相關(guān)。 Csa1G654870 物理位置在 Chr1 上 26 154 333 26 178 614 bp 之間， 非同義突變發(fā)生在該基因轉(zhuǎn)錄本第 15 個(gè)外顯子區(qū)域，第 1 831 位的堿基由 C 變成 A，相應(yīng)氨基酸序列則由 R 突變?yōu)?S。Csa1G654870 參與合成核糖核酸酶類似蛋白，包含解旋酶 C 端、 Dicer 蛋白、解旋酶 ATP 結(jié)合域等結(jié)構(gòu)。利用 TAIR 數(shù)據(jù)庫，將 Csa1G654870 比對到擬南芥，發(fā)現(xiàn)與其序列相似度較高的 AT3G03300同樣編碼 Dicer 類蛋白 。 根據(jù)基因注釋 AT3G03300 在蕪菁皺縮病毒侵染過程中替代 DCL4 產(chǎn)生ta-siRNAs，并與 DCL1 合成的 miRNA 產(chǎn)生拮抗作用來調(diào)控抗病毒的沉默響應(yīng)。 DCL1、 DCL4 作為一類保守的 dsRNA 特異性核糖核酸內(nèi)切酶，在調(diào)控 RNA 降解、轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)以及抗病毒侵染等方面發(fā)揮著重要作用，因此推斷 Csa1G654870 是抗蔓枯病候選基因。 張 旭，徐 建，李 季，婁群峰，陳勁楓 . 黃瓜 /酸黃瓜漸滲系 IL77抗蔓枯病主效 QTL 定位及候選基因鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2141 2152. 2149 表 5 黃瓜 1 號染色體 24624071 27113178 bp 范圍內(nèi) 13 個(gè)基因在外顯子區(qū)域發(fā)生非同義突變 Table 5 Nonsynonymous mutation in exon region was found in 13 genes in cucumber Chr1 24624071 27113178 bp 突變位點(diǎn) /堿基 Loci 參考基因組堿基 Ref 突變后的堿基 Obs 突變類型 Type 突變基因 Gene 24624071 G A exonic Csa1G627420 25463284 T C exonic Csa1G637440 25463448 G exonic Csa1G637440 25618945 T C exonic Csa1G642550 25634201 A G exonic Csa1G643050 25771921 T exonic Csa1G651140 25919122 G C exonic Csa1G652240 26023658 exonic Csa1G652810 26093142 A C exonic Csa1G653340 26167150 C A exonic Csa1G654870 26242932 T G exonic Csa1G655940 26755565 A exonic Csa1G662780 27069156 T A exonic Csa1G665940 27069162 exonic Csa1G665940 27113178 A C exonic Csa1G666990 2.7 qRT-PCR 驗(yàn)證 對接種蔓枯病菌 0、 2、 4 和 6 d 后的抗、感品種 IL77和 8419葉片進(jìn)行取樣保存，對Csa1G654870 進(jìn)行定量分析。分析結(jié)果表明，接種前（ 0 d） Csa1G654870 基因在兩品種中表達(dá)量存在顯著差異，接種后在 IL77中表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，接種 4 d 后達(dá)到最大，然后急劇下降；而在感病品種 8419中，其表達(dá)量相對于抗性品種一直處于較低的水平（圖 7）。 圖 7 抗病候選基因 Csa1G654870 在抗病品種 IL77和感病品種 8419接種蔓枯病菌后的表達(dá)差異 Fig. 7 Expression differences of resistant candidate gene Csa1G654870 in resistant variety IL77 and susceptible variety 8419 after inoculation 3 討論 遺傳連鎖圖譜通常用于數(shù)量性狀位點(diǎn)定位，從而獲得與目的性狀連鎖的基因組片段，開展基因的圖位克隆等工作（段蒙蒙 等， 2014；葛海燕 等， 2015；歐承剛 等， 2017）。還可以通過圖譜比較， 提供基因組進(jìn)化信息， 進(jìn)而探索物種的遺傳演化過程。 隨著黃瓜基因組測序工作的完成， 以 SSR標(biāo)記為主的高密度遺傳圖譜已將標(biāo)記間平均距離縮短到 0.51 cM（ Zhang et al.， 2012），而簡化基因Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL