園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1125 1135. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0071； http： /www. ahs. ac. cn 1125 收稿日期 ： 2018 03 13； 修回日期 ： 2018 06 04 基金項目 ： 國家自然科學(xué)基金項目（ 31272175） ；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目（ NCET-11-0670） ；江蘇省自然科學(xué)基金杰出青年基金項目（ BK20130027） ；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項目（ PAPD） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： xiongaishengnjau.edu.cn） 芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因 AgNAC1 的克隆及其對非生物脅迫的響應(yīng) 段奧其，馮 凱，劉潔霞，徐志勝，熊愛生*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，南京 210095） 摘 要： 通過 RT-PCR 方法，從芹菜六合黃心芹和文圖拉中分別克隆獲得編碼 NAC 轉(zhuǎn)錄因子的基因 AgNAC1。利用生物信息學(xué)方法分析其編碼氨基酸序列組成、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、親緣關(guān)系、空間結(jié)構(gòu)等，采用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測基因在不同非生物脅迫下的表達水平。結(jié)果表明： 六合黃心芹和文圖拉 AgNAC1 開放閱讀框長度均為 957 bp，編碼 318 個氨基酸，其蛋白質(zhì)相對分子量分別為 36.89和 36.77 kD，理論等電點分別為 5.94 和 5.78。 AgNAC1 蛋白與不同植物中 NAC 家族成員同源性比對和進化樹分析表明，其與胡蘿卜 DcNAC 屬于同一個分支，進化距離最近。蛋白功能域預(yù)測顯示， AgNAC1有多個 螺旋和 轉(zhuǎn)角二級結(jié)構(gòu)單元。熒光定量 PCR 結(jié)果表明， AgNAC1 在芹菜葉中表達量最高，具有組織特異性，同時對高溫、低溫、干旱和鹽脅迫均有響應(yīng)。 六合黃心芹中 AgNAC1 的表達水平在高溫處理 24 h 達到最高。 文圖拉中 AgNAC1 的表達水平在高溫、低溫及鹽處理后 2 h 和 8 h 高于對照，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在干旱處理 4 h 時表達水平最高。 關(guān)鍵詞： 芹菜； NAC 轉(zhuǎn)錄因子；表達分析；葉；非生物脅迫 中圖分類號： S 636.3 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 06-1125-11 Cloning and Response to Abiotic Stress of NAC Transcription Gene AgNAC1 in Apium graveolens DUAN Aoqi， FENG Kai， LIU Jiexia， XU Zhisheng， and XIONG Aisheng*（ State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China） Abstract： An AgNAC1 gene encoding NAC transcription factor was cloned from Apium graveolens Liuhe Huangxinqin and Ventura by RT-PCR method， respectively. The amino acid sequences， protein physicochemical properties， phylogenetic relationships and spatial structures of AgNAC1 were analyzed. The relative expression levels of AgNAC1 under different abiotic stresses were detected by quantitative real-time PCR. The results showed that the lengths of open reading frame of AgNAC1 genes in Liuhe Huangxinqin and Ventura were both 957 bp and encoded 318 amino acids. The relative molecular masses Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1126 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1125 1135. of AgNAC1 were 36.89 and 36.77 kD， with theoretical pI about 5.94 and 5.78， respectively. The homologous alignment and phylogenetic analysis of AgNAC1 with other NAC TFs in different plants revealed that AgNAC1 and DcNAC of Daucus carota belong to the same branch of evolutionary distance. AgNAC1 had the closest genetic relation with DcNAC. The prediction of protein functional domain showed that AgNAC1 protein contains multiple -helix and -turn secondary structure units. Quantitative real-time PCR analysis indicated that the AgNAC1 was tissue-specific in celery， and it mainly expressed in leaf. In addition， AgNAC1 responded to heat， cold， drought and salt stresses. The expression levels of AgNAC1 in Liuhe Huangxinqin peaked at 24 h under high temperature treatment. The expression levels of AgNAC1 in Ventura were higher than that of the control at 2 h and 8 h under high temperature treatment， low temperature and salt treatments， showing a trend of first decrease and then increase. The expression level of AgNAC1 was the highest at 4 h under drought treatment. Keywords： Apium graveolens； NAC transcription factor； expression analysis； leaf； abiotic stress 非生物脅迫因素影響植物生長發(fā)育，如干旱、鹽脅迫等都會使植物細胞受損，進而使產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降（孫利軍 等， 2012） 。研究發(fā)現(xiàn)， NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)，能直接或間接調(diào)控一些應(yīng)答基因在低溫、干旱、高鹽脅迫下的表達，在增強植物抗寒、抗旱、抗鹽堿、耐熱方面有重要作用（ Olsen et al.， 2004；孫利軍 等， 2012；王瑞芳 等， 2014） 。 NAC 轉(zhuǎn)錄因子還參與植物生長發(fā)育的調(diào)控，包括細胞次生壁的產(chǎn)生、莖尖分生組織、花器官、側(cè)枝和側(cè)根的形成、胚的生長代謝及形態(tài)建成以及植物激素的控制和防御（ Olsen et al.， 2004， 2005； Delessert et al.，2005； Kubo et al.， 2005； Guo & Gan， 2006） 。例如，轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證了蘋果愈傷組織中超表達的MdNAC029 能夠促進花青苷積累（安建平 等， 2018） 。研究證實 NAC1 轉(zhuǎn)錄因子參與植物對非生物脅迫逆境的響應(yīng)（ Wang et al.， 2018） 。 自從首次從矮牽牛（ Petunia hybrida）中分離出了 NAC（取基因 NAM、 ATAF1/2、 CUC2 第一個字母命名）轉(zhuǎn)錄因子后，水稻（ Oryza sativa） 、擬南芥（ Arabidopsis thaliana） 、大 豆（ Glycine max） 、小麥（ Triticum aestivum Linn）等植物中的 NAC 轉(zhuǎn)錄因子也接連被發(fā)現(xiàn)（ Souer et al.， 1998； Rhoades et al.， 2002； Hu et al.， 2008） 。 NAC1 不但能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育，而且也能增強植物在逆境脅迫下的防御和耐受能力（申玉華 等， 2015） 。水稻 NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族中第亞類含有與逆境相關(guān)的成員，受非生物脅迫誘導(dǎo)表達（方玉潔， 2013） 。小麥 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因 TaNAC47 和 TaNAC62均能增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽、耐旱及耐凍的能力（張麗娜， 2014） 。 芹菜（ Apium graveolens）是傘形科（ Apiaceae）芹屬重要的葉菜類蔬菜作物，具有較強的抗寒性，相對不耐高溫，在中國南北地區(qū)廣泛種植，基本實現(xiàn)周年生產(chǎn)（方智遠， 2011； Li et al.， 2018） 。本試驗中以六合黃心芹和文圖拉芹菜為材料，克隆出芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因 AgNAC1，對其進行了生物信息學(xué)分析，檢測和分析其在不同非生物脅迫下的響應(yīng)，為進一步研究芹菜對非生物脅迫的響應(yīng)機制提供基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 六合黃心芹 （ A. graveolens Liuhe Huangxinqin ）是南京市六合區(qū)的地方優(yōu)良品種，葉心黃，段奧其，馮 凱，劉潔霞，徐志勝，熊愛生 . 芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因 AgNAC1 的克隆及其對非生物脅迫的響應(yīng) . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1125 1135. 1127 口味清香，生長速度快。 文圖拉 （ A. graveolens Ventura ）原產(chǎn)美國，品質(zhì)脆嫩，耐寒耐熱，生長勢強，春季栽培不易先期抽薹。芹菜種子均保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)傘形科蔬菜作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室。 以芹菜六合黃心芹和文圖拉為試材， 2017 年 2 月 3 日將種子播種于人工氣候生長室中，各 100 株，待 3 月齡時，進行不同逆境條件處理：分別置于 4 和 38 生長室進行低溫和高溫處理，分別用 200 g · L-1的 PEG6000 溶液和 200 mmol · L-1NaCl 溶液澆灌進行干旱和鹽脅迫處理，設(shè)置 ddH2O 處理作為對照（田暢 等， 2014） 。分別在處理 1、 2、 4、 8 和 24 h 時，取植株頂部第 3 4片葉，同時取對照組的葉片、葉柄的 1/2 處上、下 2 cm 左右及根，立即用液氮速凍后保存于 80 冰箱。每個處理設(shè)置 3 次生物學(xué)重復(fù)。 1.2 AgNAC1 的克隆 利用 RNA 提取試劑盒（ RNA simple total RNA Kit，北京 Tiangen 公司）提取芹菜總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （ Prime Script RT Reagent Kit， 大連 TaKaRa 公司） 將提取的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。 基于本課題組芹菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（ Jia et al.， 2015） ，檢索獲得芹菜 AgNAC1 基因。根據(jù)基因序列設(shè)計 AgNAC1 的正向引物 5-ATGAAGAACAGCGGCAGTGAGA-3，反向引物 5-CTAAAAGGGC TTTTGTGTGAAC-3。 PCR 擴增采用 20 L 體系： 10 L PrimeSTAR Max Premix（大連 TaKaRa 公司） ，7 L ddH2O， 1 L cDNA 模板，上、下游引物各 1 L。反應(yīng)條件為： 94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 s， 54 退火 30 s， 72 延伸 1 min， 35 個循環(huán)； 72 延伸 10 min。委托南京金斯瑞生物科技有限公司測序。 1.3 AgNAC1 的序列分析 利用 BioXM 2.6 獲得 AgNAC1 核苷酸及編碼的氨基酸序列；利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫 BLAST 工具，獲得不同物種相關(guān)基因及氨基酸序列；用 Prot-Param 軟件對蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、氨基酸構(gòu)成成分和理論等電點等進行分析；利用 Prot Scale 軟件獲得蛋白質(zhì)親疏水性圖、用 DNAMAN 6.0 軟件獲得多序列結(jié)構(gòu)域比對圖；利用 NCBI 網(wǎng)站上 BLAST 進行同源性分析；利用 MEGA 5.2 軟件構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進化樹；利用 NCBI CDD 數(shù)據(jù)庫對芹菜轉(zhuǎn)錄因子進行保守域預(yù)測；利用 SignalP 軟件進行信號肽分析預(yù)測；利用 SOPMA 軟件對芹菜 AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析；利用Swiss-Model 通過同源建模建立三級模型。 1.4 AgNAC1 的表達分析 使用 Real-Time PCR 檢測系統(tǒng)（ Bio-rad， CFX96， USA）在 96 孔板中進行實時定量 PCR 反應(yīng)。選用芹菜 Actin 作內(nèi)參基因（ Jia et al.， 2015） ，正向引物 5-AGAAGTCCTGTTCCAGCCGTCTT-3，反向引物 5-CGAACCACCACTGAGCACTATGTT-3。根據(jù)擴增的 AgNAC1 序列設(shè)計表達檢測引物，正向引物 5-TTCATCCGACAGACGAGGAGTTAGT-3 ，反向引物 5-TCACCATACAGAGCCA TTTCAGGAAG-3。實時定量 PCR 使用 SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（大連 TaKaRa 公司） ，按操作說明書進行。采用 20 L 體系，每個 PCR 反應(yīng)體系中包含 2.0 L cDNA， 0.4 L 正反向熒光定量引物， 10 L SYBR Green I mix 和 7.2 L ddH2O。使用 Microsoft Excel 軟件進行不同組織內(nèi)表達水平的分析。通過公式 2-Ct轉(zhuǎn)換為相對轉(zhuǎn)錄值（ Pfaffl， 2001； Li et al.， 2016） 。 Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1128 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1125 1135. 2 結(jié)果與分析 2.1 AgNAC1 的克隆與序列分析 分別以芹菜六合黃心芹和文圖拉的 cDNA 為模板， PCR 擴增得到 2 個 1 000 bp 左右的目的片段，片段大小與預(yù)期一致。測序結(jié)果表明六合黃心芹和文圖拉中的 AgNAC1 均含有1 個 957 bp 的開放閱讀框（ ORF） ，編碼 318 個氨基酸（圖 1） 。 圖 1 六合黃心芹 AgNAC1 核苷酸及編碼的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide and amino sequences of AgNAC1 gene from A. graveolens Liuhe Huangxinqin 六合黃心芹和文圖拉的核苷酸差異表現(xiàn)在 4 個堿基位點，分別為第 133 位 A/G（ 六合黃心芹 /文圖拉 ，下同） ，第 354 位 G/A，第 361 位 A/G 和第 579 位 G/A。 保守域預(yù)測得出轉(zhuǎn)錄因子在 11 134 氨基酸位點含有 NAC 家族典型的 NAM 保守結(jié)構(gòu)域， 表明得到的轉(zhuǎn)錄因子 AgNAC1 屬于 NAC 家族（圖 2） 。 圖 2 芹菜 AgNAC1 保守域預(yù)測 Fig. 2 Prediction of the conserved domain of AgNAC1 from celery 段奧其，馮 凱，劉潔霞，徐志勝，熊愛生 . 芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因 AgNAC1 的克隆及其對非生物脅迫的響應(yīng) . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1125 1135. 1129 2.2 AgNAC1 與其他植物 NAC 蛋白的多重比對與系統(tǒng)進化分析 利用 DNAMAN 6.0 軟件進行 AgNAC1 與胡蘿卜（ XP_017243840.1） 、可可（ EOX92686.1） 、榴蓮（ XP_022740811.1） 、芝麻（ XP_011099683.1） 、柿子（ AJF38901.1） 、洋薊（ KVH92730.1） 、海欖雌（ ABS80935.1） 、菠菜（ XP_021863783.1） 、向日葵（ XP_022025321.1） 、番薯（ ACT55332.1） 、橡膠樹（ XP_021649171.1） 、毛葡萄（ ALM02085.1） 、辣椒（ PHU19421.1） 、黃花蒿（ AQU15092.1） 、蓖麻（ EEF39462.1） 、綠豆（ XP_014509424.1） 、番木瓜（ XP_021900375.1） 、紫苜蓿（ AGJ76628.1） 、大豆（ AGO14650.1） 、擬南芥（ NP_172690.1）的 NAC 蛋白進行序列比對（圖 3） ，并繪制系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明 AgNAC1 與傘形科胡蘿卜 DcNAC 同屬于一個分支，與海欖雌科的海欖雌進化距離較近，其次是十字花科的擬南芥（圖 4） 。 圖 3 芹菜與其他植物 NAC 氨基酸序列的多重比對 Fig. 3 The alignment of amino acid sequences of NAC from celery and other plants Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1130 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1125 1135. 圖 4 芹菜 AgNAC1 與其他植物 NAC 類蛋白系統(tǒng)構(gòu)象樹 Fig. 4 The phylogenetic tree of AgNAC1 of celery and some other NAC proteins 2.3 AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸組分及理化性質(zhì)分析 對芹菜六合黃心芹和文圖拉兩個品種的 AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子進行蛋白序列和理化性質(zhì)分析，兩者相似度較高。對 AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白與不同植物 NAC 類轉(zhuǎn)錄因子進行氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析。 結(jié)果顯示， 兩個芹菜品種 AgNAC1 的蛋白質(zhì)相對分子量分別為 36.89 和 36.77 kD，理論等電點分別為 5.94 和 5.78。兩個品種和 20 種植物 NAC 蛋白氨基酸數(shù)在 274 395 之間，酸性氨基酸比例大于堿性氨基酸，表現(xiàn)為酸性蛋白。 六合黃心芹中芳香族氨基酸比例總體大于脂肪族氨基酸比例， 文圖拉中脂肪族氨基酸比例大于芳香族氨基酸比例（表 1） 。 六合黃心芹和文圖拉 AgNAC1 蛋白由 20 種氨基酸組成，其中，絲氨酸（ Ser）含量最高，為 8.8%，半胱氨酸（ Cys）含量最低， 為 1.3%； 脂肪系數(shù)分別為 50.03 和 49.72； 不穩(wěn)定系數(shù) （ instability index） 為 52.50 和 52.32；親水性平均系數(shù)（ GRAVY）分別為 0.853 和 0.841，表現(xiàn)為較強的親水性（圖 5） 。 圖 5 六合黃心芹 （ A） 和 文圖拉 （ B） AgNAC1 氨基酸序列親水性 /疏水性分析 Fig. 5 Predicted hydrophobicity and hydrophilicity of deduced amino acid sequence of AgNAC1 from Liuhe Huangxinqin（ A） and Ventura（ B） celeries 段奧其，馮 凱，劉潔霞，徐志勝，熊愛生 . 芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因 AgNAC1 的克隆及其對非生物脅迫的響應(yīng) . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1125 1135. 1131 表 1 不同植物來源的 NAC 蛋白氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析 Table 1 The comparison of composition and physical and chemical characterization of amino acid sequences of NAC protein from different plant species 來源植物 Source plant 登錄號 GenBank accession 氨基酸數(shù) No. of amino acid分子量 / kD Molecular mass pI 比例 /% Ratio 堿性氨基酸Basic aminoacid 酸性氨 基酸 Acid amino acid 脂肪族 氨基酸 Aliphatic amino acid 芳香族 氨基酸 Aromatics amino acid 芹菜 Apium 六合黃心芹 Liuhe Huangxinqin 318 36.89 5.94 14 25 12 13 文圖拉 Ventura 318 36.77 5.78 14 25 27 10 胡蘿卜 Daucus sativus XP_017243840.1 315 36.52 6.03 14 24 14 13 可可 Theobroma cacao EOX92686.1 294 33.64 6.01 13 23 16 12 榴蓮 Durio zibethinus XP_022740811.1 296 33.93 6.60 14 24 15 11 芝麻 Sesamum indicum XP_011099683.1 293 33.90 5.80 15 24 16 12 柿子 Diospyros kaki AJF38901.1 293 33.50 6.27 15 20 14 13 洋薊 Cynara scolymus KVH92730.1 284 32.78 6.31 16 21 16 12 海欖雌 Avicennia marina ABS80935.1 303 34.50 5.70 14 21 16 12 菠菜 Spinacia oleracea XP_021863783.1 299 34.33 7.81 15 21 15 12 向日葵 Helianthus annuus XP_022025321.1 274 31.60 6.59 16 22 15 12 番薯 Ipomoea batatas ACT55332.1 280 32.39 7.04 15 23 16 13 毛葡萄 Vitis quinquangularis ALM02085.1 292 33.17 8.31 14 21 15 12 橡膠 Hevea brasiliensis XP_021649171.1 278 31.71 8.18 15 20 15 12 辣椒 Capsicum chinense PHU19421.1 286 32.92 8.16 16 21 17 11 黃花蒿 Artemisi annua AQU15092.1 284 32.81 6.36 15 22 15 12 蓖麻 Ricinus communis EEF39462.1 298 33.88 5.79 15 23 17 11 綠豆 Vigna radiata XP_014509424.1 293 33.73 6.03 15 24 15 12 番木瓜 Carica papaya XP_021900375.1 274 31.44 6.83 16 22 18 11 紫苜蓿 Medicago sativa AGJ76628.1 285 32.72 8.23 16 21 16 12 大豆 Glycine max AGO14650.1 292 33.19 6.04 14 21 16 11 擬南芥 Arabidopsis thaliana NP_172690.1 395 45.84 5.83 15 29 15 10 2.4 芹菜 AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 以六合黃心芹為例用 SOPMA 軟件和 SignalP 進行分析， AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子是由 27.67%的 螺旋（ Alpha helix） ， 15.72%的延伸主鏈（ Extended strand） ， 9.12%的 轉(zhuǎn)角（ Beta turn）和 47.48%的無規(guī)則卷曲（ Random coil）構(gòu)成。總體上看， AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)是 螺旋和無規(guī)則卷曲。此外，通過對六合黃心芹 AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子序列信號肽的分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白序列不存在信號肽。利用 Swiss-Model 軟件預(yù)測 AgNAC1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，以水稻 OsNAC1 轉(zhuǎn)錄因子的A 鏈（ PDB ID： 3ULX）為模板對六合黃心芹和文圖拉 AgNAC1 蛋白進行同源構(gòu)建， AgNAC1與模板的一致性均大于 70%，存在多個二級結(jié)構(gòu)單元。三級結(jié)構(gòu)均含有 11 個 折疊，但 螺旋數(shù)量不同， 六合黃心芹含有 3 個 螺旋， 文圖拉含有 2 個 螺旋。 2.5 AgNAC1 在芹菜不同組織的表達分析 通過實時定量 PCR 檢測 AgNAC1 在芹菜根、葉柄、葉片中的相對表達水平。結(jié)果（圖 6）表明，AgNAC1 在兩個品種的根、 葉柄、 葉片中均有表達， 在葉片中的表達量最高， 在葉柄中最低； AgNAC1在六合黃心芹葉片中的表達量分別為葉柄和根中的 57.29 和 3.68 倍； AgNAC1 在文圖拉葉片中的表達量為葉柄的 14.43 倍，與根中的無顯著差異。 Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1132 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1125 1135. 圖 6 AgNAC1 在芹菜不同組織部位的表達情況 不同字母在 0.05 水平上有顯著差異。 Fig. 6 Expression analysis of AgNAC1 in different tissues of celery Different letters indicate significant difference at 0.05 level. 2.6 AgNAC1 對不同非生物脅迫的響應(yīng) 由圖 7 可見，高溫、低溫、干旱及鹽脅迫處理下 AgNAC1 表達水平具有差異。 圖 7 AgNAC1 在芹菜不同非生物逆境下的表達 Fig. 7 Expression analysis of AgNAC1 in celery under different treatments 38 高溫、 4 低溫、鹽處理（ NaCl）條件下六合黃心芹中 AgNAC1 表達量在處理后 4 h和 8 h 比對照顯著降低， 38 高溫處理至 24 h 時達到對照的 13.64 倍； 38 高溫條件下， 文圖拉中 AgNAC1 表達量在處理后 1 h 顯著增加， 2 h 時表達量最高，是對照的 2.23 倍， 4 h 時顯著減少。段奧其，馮 凱，劉潔霞，徐志勝，熊愛生 . 芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因 AgNAC1 的克隆及其對非生物脅迫的響應(yīng) . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1125 1135. 1133 4 低溫條件下， 六合黃心芹中 AgNAC1 表達量在處理后 24 h 表達量與對照無差異； 文圖拉中 AgNAC1 表達量在處理后 2 h 顯著增加，表達量均高于對照，尤其在處理 8 h 后達到對照的 7.96倍。干旱（ PEG6000）條件下， 六合黃心芹中 AgNAC1 表達量在處理 8 h 時達到最高，是對照的1.17 倍； 文圖拉中 AgNAC1 表達量在處理后 4 h 顯著增加，是對照的 10.19 倍。鹽（ NaCl）脅迫條件下六合黃心芹中 AgNAC1 表達量在處理后 4 h 和 8 h 比對照顯著降低，在其他處理時間差異不顯著； 文圖拉 中 AgNAC1 表達量在處理后 2 h 和 8 h 差異顯著， 分別是對照的 15.03 倍和 16.88倍。 3 討論 試驗中選用地域來源不同的兩個芹菜品種六合黃心芹和文圖拉為材料，從中克隆得到與非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因 AgNAC1。 六合黃心芹和文圖拉 AgNAC1 蛋白序列一致性較高，在 11 134 氨基酸位點均含有 1 個 NAC 家族典型的 NAM 保守結(jié)構(gòu)域，這表明該轉(zhuǎn)錄因子屬于 NAC 家族（ Olsen et al.， 2005） 。多 數(shù) NAC 轉(zhuǎn)錄因子的 NAM 保守結(jié)構(gòu)域具有核定位序列（ Paul et al.， 2012） 。通過 ProtComp 軟件預(yù)測 表明 芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子也定位于細胞核中， AgNAC1 蛋白是核蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示 AgNAC1 蛋白序列不存在信號肽，說明不是膜結(jié)合蛋白。進化樹分析顯示 AgNAC1 轉(zhuǎn)錄因子與同屬傘形科的胡蘿卜親緣關(guān)系最近，而同屬菊科的向日葵、洋薊和黃花蒿進化關(guān)系較遠， 這可能與前期的品種馴化和栽培地的氣候條件差異相關(guān) （ Soltis & Soltis， 2004；李巖 等， 2015） 。 NAC 轉(zhuǎn)錄因子是高等植物特有的功能性轉(zhuǎn)錄因子， 在植物生長發(fā)育和抗逆調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用（申玉華 等， 2015） 。非生物脅迫下的表達分析顯示， AgNAC1 在 4 種逆境處理下均有響應(yīng)。六合黃心芹 AgNAC1 在高溫脅迫 24 h 時表達最強，而對鹽脅迫的響應(yīng)相對不敏感，表達變化較慢。 文圖拉 AgNAC1 對低溫、干旱和鹽脅迫的響應(yīng)較敏感，在 4 低溫脅迫 4 h 后隨時間推移呈現(xiàn)上升的趨勢。不同品種中的 NAC 轉(zhuǎn)錄因子在逆境處理下表達量不同，說明 AgNAC1 對非生物脅迫的響應(yīng)與品種特性相關(guān)。 實時定量 PCR 結(jié)果顯示 AgNAC1 在芹菜葉片和根中的表達量明顯高于葉柄，具有明顯的組織特異性（蔣倩 等， 2012；馮凱 等， 2016；李靜文 等， 2018） 。有研究表明 NAC轉(zhuǎn)錄因子基因在不同植物組織中表達差異顯著，一些 NAC 基因的表達模式具有組織特異性，如在根和葉中優(yōu)先表達（ Karanja et al.， 2017） 。其中擬南芥 AtNAC1 在根中表達水平最高，在葉片中表達水平較低（ Xie et al.， 2000；王國東 等， 2017） ；半定量 RT-PCR 組織表達譜分析表明， SlNAC1主要在番茄根、花和綠色的果實中表達（ Yang et al.， 2011） ； GmNAC20 參與大豆根的生長和發(fā)育過程（ Hao et al.， 2011） 。 NAC 轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥和水稻兩種模式植物中的研究較為成熟， 在其他作物中大多處于基因克隆分析層面上， NAC 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控機制上的研究取得了一定的進展，但仍不完善。芹菜分子遺傳研究較為緩慢，在分子水平上對芹菜 NAC 轉(zhuǎn)錄因子進行分析并進一步驗證其功能具有深遠的意義（ Olsen et al.， 2004；李小蘭 等， 2013） 。 References An Jianping， Song Laiqing， Zhao Lingling， You Chunxiang， Wang Xiaofei， Hao Yujin. 2018. Overexpression of MdNAC029 promotes anthocyan