基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體誘導(dǎo)及鑒定.pdf
<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (6)： 1136 1146. Acta Horticulturae Sinica 1136 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0879； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2018 02 01； 修回日期 ： 2018 06 04 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31471897） ；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃 A 類項(xiàng)目（ LR2013029） * E-mail： hmbhsina.com； Tel： 024-88487143 基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體誘導(dǎo)及鑒定 孫紅梅1,2,*，付麟嵐1，王志平1，蓋美竹1，王春夏1,2（1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110866） 摘 要： 以細(xì)葉百合（ Lilium pumilum DC. Fisch.）和蘭州百合（ Lilium davidii var. unicolor）的鱗片和胚性愈傷組織作為誘導(dǎo)材料，用不同濃度秋水仙素以浸泡和混培兩種處理方式進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)。以形態(tài)學(xué)觀測(cè)、根尖染色體計(jì)數(shù)、氣孔觀測(cè)對(duì)多倍體植株進(jìn)行倍性鑒定，分別獲得了 19 株細(xì)葉百合四倍體植株和 6 株蘭州百合四倍體植株，最佳處理方式為 0.1%秋水仙素浸泡胚性愈傷組織 24 h。使 用 ISSR 對(duì)經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生的二倍體和多倍體再生植株進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)兩種百合二倍體植株遺傳較穩(wěn)定，而多倍體植株均發(fā)生遺傳變異，其中細(xì)葉百合和蘭州百合遺傳變異率分別為 15.48%和 9.75%。 關(guān)鍵詞： 細(xì)葉百合；蘭州百合；體細(xì)胞胚發(fā)生；多倍體； ISSR 中圖分類號(hào)： S 682.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 06-1136-11 Polyploidy Induction and Identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor Based on Somatic Embryogenesis SUN Hongmei1,2,*， FU Linlan1， WANG Zhiping1， GAI Meizhu1， and WANG Chunxia1,2（1College of Horticulture， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；2Key Laboratory of Protected Horticulture of Education Ministry and Liaoning Province， Shenyang 110866， China） Abstract： Using scales and embryogenic callus as the target tissues， Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor were accomplished the ployploid inducement by soaking and mixed culture with different concentrations of colchicine. Nineteen tetraploids of Lilium pumilum DC. Fisch. and 6 tetraploids of Lilium davidii var. unicolor have been identified， through morphological observation， root tip chromosome count and stomatal observation. The optimum condition is immersing embryogenic callus with 0.1% colchicine for 24 hours to achieve the highest efficiency of chromosome doubling. Dipold plants of both lilies are genetically stable while polyploid plants experience the genetic variation by using ISSR to conduct the genetic analysis of plants via somatic embryogenesis. The variation rates of polyploid in Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor are 15.48% and 9.75%， respectively. Keywords： Lilium pumilum； Lilium davidii var. unicolor； somatic embryogenesis； polyploid； ISSR 原產(chǎn)于中國(guó)的細(xì)葉百合（ Lilium pumilum DC. Fisch.）和蘭州百合（ Lilium davidii var. unicolor） ， 孫紅梅，付麟嵐，王志平，蓋美竹，王春夏 . 基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體誘導(dǎo)及鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 1137 具有較高的觀賞價(jià)值和較強(qiáng)的抗逆性，但二者莖稈纖弱、葉片細(xì)狹、花朵嬌小、結(jié)實(shí)率低等（ Pitschmann et al.， 2013） 。在植物進(jìn)化史中，多倍體化扮演著重要的角色（ Sattler et al.， 2016） ，是遺傳、生化以及進(jìn)化之源（ Soltis & Soltis， 2016） 。植物多倍體化后除了基因組加倍導(dǎo)致新的表型外，也因組織結(jié)構(gòu)和生理上的變化導(dǎo)致了器官“巨大”化及開花時(shí)間提前等（ Levin， 1983； Guo et al.， 2017） 。在百合中，育種學(xué)家對(duì)亞洲百合（ Zhou et al.， 2008） 、紫斑百合（李旦 等， 2017）、淡黃花百合（鐘程 等， 2015）、有斑百合（張錫慶 等， 2017）等展開了多倍體化研究，發(fā)現(xiàn)與二倍體植株相比，多倍體植株鱗莖更大，鱗片更加厚實(shí)，花朵更顯碩大艷麗，葉片著色更深，株形更緊湊和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間更為短暫。 目前，多倍體誘導(dǎo)多使用傳統(tǒng)的雜交育種（ Nakel et al.， 2017； Zhang et al.， 2017） 、種子誘導(dǎo)（ Noori et al.， 2017） 、不定芽誘導(dǎo)（李曉雙 等 ， 2017）等方法，但變異情況較為復(fù)雜，常伴有大量嵌合體（ Cabral et al.， 2016； He et al.， 2016b），并且需要不斷鑒定、選擇才能保證變異株的倍性穩(wěn)定。體細(xì)胞胚發(fā)生是體細(xì)胞獲得胚性能力、形成完整植株的離體再生方式（ Zimmerman， 1993），在很大程度上體現(xiàn)了細(xì)胞的全能性（吳澤 等， 2014），短時(shí)期內(nèi)可獲得大量再生植株（ Jin et al.，2012； Zhang et al.， 2016），且倍性穩(wěn)定（ Pitschmann et al.， 2013）。依托體細(xì)胞胚發(fā)生體系進(jìn)行多倍體植株誘導(dǎo)，遺傳穩(wěn)定性好，繁殖效率高，可有效避免嵌合體形成。目前已有包括歐洲櫟（ Endemann et al.， 2001）、栓皮櫧（ Loureiro et al.， 2005）、白鶴芋（ Eeckhaut et al.， 2004）在內(nèi)的一些植物成功實(shí)現(xiàn)了以體細(xì)胞胚為受體的多倍體創(chuàng)制，這些多倍體植株均具有更為優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。然而，由于植物體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)具有基因型依賴性強(qiáng)、畸形胚比例較高且難以同步化的特點(diǎn)，目前尚未有以體細(xì)胞胚為受體材料誘導(dǎo)百合多倍體的報(bào)道。 本試驗(yàn)在前期建立細(xì)葉百合和蘭州百合體細(xì)胞胚發(fā)生體系的基礎(chǔ)上（ Zhang et al.， 2016），用秋水仙素進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，比較不同誘導(dǎo)時(shí)間和處理方式對(duì)多倍體誘變率的影響，并綜合使用形態(tài)學(xué)觀測(cè)、根尖染色體計(jì)數(shù)、氣孔觀測(cè)等進(jìn)行加倍植株的倍性鑒定；使用 ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行多倍體植株遺傳分析，以期為提升其觀賞價(jià)值并創(chuàng)制新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件 本試驗(yàn)于 2016 年 1 月至 2017 年 6 月在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院觀賞植物栽培生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所用試管苗來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存的蘭州百合和細(xì)葉百合離體材料。 采用 MS 固體培養(yǎng)基（添加 30 g · L-1蔗糖 + 7 g · L-1瓊脂） ，胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（ M1）為MS + 1.0 mg · L-1毒莠定（ PIC） + 0.2 mg · L-1萘乙酸（ NAA） ，體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基（ M2）為 MS + 0.5 mg · L-16芐氨基腺嘌呤（ 6-BA） 。所有培養(yǎng)基 pH 調(diào)至 5.8 并在 121 、 120 kPa 條件下滅菌20 min。 1.2 體細(xì)胞胚發(fā)生 取鱗莖直徑為 1 2 cm 的細(xì)葉百合和蘭州百合試管苗的鱗片用于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)。將鱗片切割為0.5 cm2，凹面朝上平鋪接種于 M1培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo) 45 d 后將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至 M2培養(yǎng)基中光培養(yǎng)（光照 16 h · d-1，黑暗 8 h · d-1，光照強(qiáng)度 36 mol · m-2· s-1），以獲得再生植株。 Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1138 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 1.3 多倍體誘導(dǎo) 以細(xì)葉百合試管苗鱗片和胚性愈傷組織為受體，分別采用浸泡法和混培法進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)。浸泡法指將鱗片和胚性愈傷組織分別于 0.01%、 0.05%和 0.1%秋水仙素水溶液（體積比）中浸泡 24、48 和 72 h 后，鱗片轉(zhuǎn)入 M1培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織；胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入 M2培養(yǎng)基中以獲得體細(xì)胞胚再生植株，蒸餾水處理作對(duì)照。混培法是將兩種百合試管苗鱗片和胚性愈傷分別接種于添加 0.05%、 0.1%和 0.5%秋水仙素的 M1和 M2培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 10、 20 和 30 d 后再分別接種于不添加秋水仙素的 M1培養(yǎng)基和 M2培養(yǎng)基中， 以常規(guī)培養(yǎng)基作對(duì)照， 篩選出細(xì)葉百合的最佳誘導(dǎo)處理，并用該處理誘導(dǎo)蘭州百合多倍體。每個(gè)處理 20 個(gè)外植體， 3 次重復(fù)，變異率（ %） = 變異植株 /再生植株總數(shù) × 100。 1.4 再生植株根尖染色體鑒定 取 1.3 獲得的再生植株幼嫩根尖置于 0.1%的秋水仙素溶液中 4 預(yù)處理 24 h； 轉(zhuǎn)移至卡諾氏固定液（乙醇 冰醋酸 = 3 1）中固定 12 h；于 5 mol · L-1HCl 中室溫下解離 4 min；最后置于卡寶品紅染液中染色 20 min。每個(gè)植株至少觀察 10 個(gè)清晰的分裂相，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)。 1.5 再生植株與多倍體植株的 ISSR 檢測(cè) 在未經(jīng)加倍處理的細(xì)葉百合和蘭州百合二倍體植株中分別選取 20 個(gè) ISSR 引物對(duì)（ A30、 A26、A37、 A59、 A50、 UBC811、 UBC814、 UBC815、 UBC820、 UBC825、 UBC835、 UBC842、 UBC843、UBC844、 UBC845、 UBC857、 UBC873、 UBC880、 UBC895） 進(jìn)行引物篩選 （ UBC 和 3A 系列， TaKaRa，Japan） 。母株和體細(xì)胞胚再生植株之間的遺傳穩(wěn)定性通過(guò)基于 PCR 的 ISSR 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)引物對(duì)隨機(jī)選取 10 株體細(xì)胞胚再生植株檢測(cè)。使用 Nuclean PlantGen DNA Kit（ Cwbiotech， Beijing，China）提取植株新鮮葉片組織 DNA，使用 Infinite 1200 PRO（ Tecan， Männedorf， Switzerland）檢測(cè) DNA 質(zhì)量。 使用 DNA Veriti Thermal Cycler（ Applied Biosystems， California， USA）進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。 ISSR反應(yīng)體系為： 40 ng 模板 DNA、 12.5 L TaqMix DNA 聚合酶、 1 L 引物、 10.5 L RNA Free Water，總體積為 25 L；擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 40 s， 52.8 退火 45 s， 72 延伸 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)；最后 72 延伸 7 min 30 s。 ISSR-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖凝膠上，于 3 5 V · cm-1的電場(chǎng)中電泳 30 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、照相并記錄。每次 ISSR 檢測(cè)進(jìn)行 3 次重復(fù)。 經(jīng)多倍體倍性鑒定后，將正常二倍體植株與加倍植株轉(zhuǎn)移到鱗莖膨大培養(yǎng)基中（添加 60 g · L-1蔗糖的 MS 培養(yǎng)基） ，繼代兩次（ 60 d） ，觀察小鱗莖和葉片情況。每種百合不同倍性植株各取 3 株，以葉片為材料再次進(jìn)行 ISSR 檢測(cè)，將二倍體植株作為對(duì)照，選取篩選出的條帶清晰可分的 ISSR 引物進(jìn)行 ISSR 檢測(cè)， 試驗(yàn)具體步驟同上。 多態(tài)性條帶變異率 （ %） = 多態(tài)性條帶數(shù) /總檢測(cè)條帶數(shù) × 100。 1.6 四倍體植株的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)觀察 在相同生長(zhǎng)條件下，觀察并利用游標(biāo)卡尺測(cè)量二倍體與四倍體植株鱗莖直徑、鱗片厚度、葉片寬度和葉柄直徑，觀察兩種百合試管苗移栽后的表型變化。氣孔觀察和葉綠素含量測(cè)定參照Widoretno（ 2016）和 Alsia 等（ 2016）的方法。 孫紅梅，付麟嵐，王志平，蓋美竹，王春夏 . 基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體誘導(dǎo)及鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 1139 2 結(jié)果與分析 2.1 細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體誘導(dǎo)及倍性鑒定 細(xì)葉百合鱗片和胚性愈傷組織經(jīng)秋水仙素浸泡和混培處理，與正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的相比，體胚萌發(fā)推遲了 20 d。在誘導(dǎo)過(guò)程中，無(wú)論是以鱗片還是胚性愈傷組織為受體，都伴隨有褐化或致死的現(xiàn)象，所有受體在處理 30 d 后全部死亡。綜合比較，以胚性愈傷組織為受體誘導(dǎo)更快，并且多倍體誘變率更高，最終確定細(xì)葉百合多倍體誘導(dǎo)的最佳處理方式為以胚性愈傷組織為受體， 0.1%秋水仙素浸泡處理 24 h，多倍體誘變率為 48%（表 1） 。利用這一誘導(dǎo)條件，也成功誘導(dǎo)培育了蘭州百合的多倍體植株。 表 1 細(xì)葉百合多倍體誘導(dǎo)結(jié)果 Table 1 Induction effects of colchicine concentration and treatment time on Lilium pumilum DC. Fisch. 處理 Treatment 秋水仙素 /% Colchicine 時(shí)間 Time 再生植株 Regeneration plant 變異株 Mutant 誘變率 /% Mutation rate 非整倍體 Aneuploid 四倍體 Tetraploid 鱗片 Scale 胚性愈傷 Embryo- genic callus鱗片Scale胚性愈傷 Embryo- genic callus鱗片 Scale 胚性愈傷 Embryo- genic callus鱗片Scale胚性愈傷 Embryo- genic callus 鱗片 Scale 胚性愈傷 Embryo- genic callus浸泡法 Colchicine immersion 0.01 24 h 18 8 3 0 16.67 0 3 0 0 0 48 h 7 5 0 1 0 20.00 0 0 0 1 72 h 2 6 0 2 0 33.33 0 2 0 0 0.05 24 h 25 15 2 1 8.00 6.67 1 1 1 0 48 h 20 8 5 0 25.00 0 1 0 4 0 72 h 5 10 1 4 20.00 40.00 1 3 0 1 0.10 24 h 13 25 0 12 0 48.00 0 8 0 4 48 h 4 7 1 2 25.00 28.57 1 1 0 1 72 h 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 混培法 Medium supplement with colchicine 0.05 10 d 10 14 2 0 20.00 0 2 0 0 0 20 d 5 9 0 4 0 44.44 0 2 0 2 30 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.10 10 d 9 13 2 1 22.22 7.69 1 1 1 0 20 d 7 3 3 1 42.85 33.33 2 1 1 0 30 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.50 10 d 4 6 1 2 25.00 33.33 0 1 1 1 20 d 4 1 2 1 50.00 100.00 2 0 0 1 30 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 總計(jì) Total 133 134 22 31 14 20 8 11 利用根尖染色體鑒定法對(duì)經(jīng)秋水仙素處理后得到的再生植株進(jìn)行鑒定（圖 1） ，細(xì)葉百合共得到214 株二倍體（ 2n = 2x = 24） ， 19 株四倍體（ 2n = 4x = 48）和 34 株非整倍體；蘭州百合共獲得再生植株 28 株，其中 6 株四倍體， 10 株非整倍體，多倍體誘變率為 57.14%。 2.2 經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生的再生植株與多倍體植株的 ISSR 分析 在細(xì)葉百合中篩選出了 8 個(gè)最為合適的引物為 A59、 A37、 A50、 A26、 UBC873、 UBC820、 UBC857和 UBC845， 蘭州百合篩選出了 8 個(gè)最為合適的引物為 A37、 UBC815、 UBC843、 UBC844、 UBC857、UBC873、 UBC825 和 UBC835。每個(gè)引物檢測(cè) 10 株體細(xì)胞胚再生植株，觀察多態(tài)性條帶。 在未經(jīng)加倍處理的兩種百合體胚再生植株中共檢測(cè) 3 270 條帶，基本上沒(méi)有出現(xiàn)變異條帶，說(shuō)明兩種百合體細(xì)胞胚發(fā)生的遺傳較為穩(wěn)定（圖 2） 。 Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1140 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 圖 1 細(xì)葉百合和蘭州百合染色體加倍情況 Fig. 1 Chromosome doubling in Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor 圖 2 細(xì)葉百合和蘭州百合二倍體植株體細(xì)胞胚的 ISSR 檢測(cè) M： 2 000 bp DNA marker； 1：母株； 2 11：再生植株。 Fig. 2 The ISSR detection for somatic embryogenesis in Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor M： 2 000 bp DNA marker； 1： Mother plant； 2 11： Regenerates plant. 孫紅梅，付麟嵐，王志平，蓋美竹，王春夏 . 基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體誘導(dǎo)及鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 1141 在經(jīng)秋水仙素處理的多倍體植株中， 細(xì)葉百合中選取的 8 個(gè) ISSR 引物對(duì)平均每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增 7個(gè)條帶。結(jié)果表明，與對(duì)照植株相比變異植株的 ISSR 檢測(cè)條帶發(fā)生了變化（圖 3） ，總檢測(cè)條帶數(shù)為 336 條，變異植株的 ISSR 條帶變異率為 15.48%。 蘭州百合中選取的 8 個(gè) ISSR 引物對(duì)平均每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增 6.63 個(gè)條帶。多倍體植株的檢測(cè)結(jié)果中同樣出現(xiàn)了多態(tài)性條帶（圖 3） ?？倷z測(cè)條帶數(shù)為 318 條， 31 條具有多態(tài)性，誘變植株的 ISSR 多態(tài)性條帶百分率為 9.75%。 圖 3 細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體植株 ISSR 檢測(cè) M： 2 000 bp DNA marker； C：對(duì)照植株； P：染色體加倍植株。 Fig. 3 ISSR used for early detection of polyploids in Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor M： 2 000 bp DNA marker； C： Control plants； P： Chromosome doubling plants. 2.3 四倍體植株的形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察 觀察在相同培養(yǎng)條件下的細(xì)葉百合和蘭州百合二倍體與四倍體試管苗，發(fā)現(xiàn)四倍體植株均呈現(xiàn)鱗莖增大、葉片寬厚、葉柄變粗、葉色加深的現(xiàn)象（圖 4） 。兩種百合二倍體與四倍體植株的氣孔頻度和大小差異顯著，通過(guò)顯微鏡微尺測(cè)量發(fā)現(xiàn)，兩種百合四倍體植株的氣孔孔徑、保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度均顯著大于二倍體植株，氣孔頻度均小于二倍體植株（表 2，圖 5） 。 Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1142 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 表 2 兩種百合二倍體植株（ 2x）與四倍體植株（ 4x）形態(tài)學(xué)及氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞的比較 Table 2 The morphological feature， stomata and guard cell in the diploid plant and the tetraploid plant of both Lilium species 材料 Sample 倍性 Ploidy 鱗莖周徑 /mm Bulb circumferential diameter 鱗片厚 /mm Scale thickness 葉片寬 /mm Leaf width 葉柄直徑 /mm Petiole diameter 細(xì)葉百合 Lilium pumilum DC. Fisch. 4x 25.89 ± 1.21 A 2.25 ± 0.24 A 5.06 ± 0.11 A 1.89 ± 0.60 A 2x 12.86 ± 0.43 B 1.25 ± 0.15 B 2.37 ± 0.18 B 1.03 ± 0.22 B 蘭州百合 Lilium davidii var. unicolor 4x 23.60 ± 0.36 A 2.64 ± 0.05 A 6.26 ± 0.17 A 2.06 ± 0.16 A 2x 11.57 ± 0.37 B 1.61 ± 0.14 B 2.84 ± 0.12 B 1.14 ± 0.10 B 材料 Sample 倍性 Ploidy 氣孔長(zhǎng) /m Stomatal length 氣孔頻度 Stomatal frequency 保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng) /m Guard cell length 保衛(wèi)細(xì)胞寬 /m Guard cell width 細(xì)葉百合 Lilium pumilum DC. Fisch. 4x 67.47 ± 2.05 A 10.00 ± 0.58 A 118.62 ± 2.32 A 16.82 ± 0.64 A 2x 39.48 ± 1.30 B 17.67 ± 0.88 B 78.58 ± 1.15 B 15.94 ± 0.36 B 蘭州百合 Lilium davidii var. unicolor 4x 51.67 ± 2.56 A 21.67 ± 0.67 A 93.95 ± 2.39 A 20.66 ± 0.86 A 2x 22.97 ± 1.85 B 21.67 ± 0.67 B 62.82 ± 1.54 B 17.49 ± 0.48 B 圖 4 細(xì)葉百合與蘭州百合二倍體植株（左）和四倍體植株（右）比較 Fig. 4 The comparison between diploid plant（ left） and tetraploid plant（ right） of Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor 孫紅梅，付麟嵐，王志平，蓋美竹，王春夏 . 基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合和蘭州百合多倍體誘導(dǎo)及鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 1143 圖 5 細(xì)葉百合和蘭州百合二倍體植株與四倍體植株在 40× 鏡下的氣孔情況 Fig. 5 The stomata of colchicine-induced diploid plants and the tetraploid under 40× mirror of Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor 葉綠素含量測(cè)定結(jié)果表明，細(xì)葉百合和蘭州百合四倍體植株的葉綠素含量分別為（ 1.490 ± 0.039）和（ 0.838 ± 0.110） mg · g-1，極顯著高于二倍體植株的（ 0.940 ± 0.108）和（ 0.749 ± 0.002）mg · g-1。四倍體植株移栽后均能正常存活并生長(zhǎng)，且比二倍體植株更易存活，長(zhǎng)勢(shì)更加健壯（圖 6） 。 圖 6 細(xì)葉百合和蘭州百合二倍體植株與四倍體植株移栽比較 Fig. 6 The comparison of transplanting Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1144 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1136 1146. 3 討論 隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)以植物體細(xì)胞胚為外植體誘導(dǎo)植株多倍體的研究逐漸增多。體細(xì)胞胚作為誘導(dǎo)受體除了可以獲得同源多倍體外，還可以提高植株再生效率，縮短誘導(dǎo)周期（ Sattler et al.， 2016） 。 秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)誘導(dǎo)百合多倍體的處理方法主要包括浸泡法 （ He et al.，2016a）和混培法（ Leila et al.， 2014）。本研究中發(fā)現(xiàn)，在不同濃度秋水仙素和不同處理方式下，都可以獲得兩種百合的染色體加倍植株，且以胚性愈傷組織為外植體的誘導(dǎo)效果更好。楊英杰等（ 2013）以細(xì)葉百合種子為受體，使用 0.05%、 0.1%和 0.2%的秋水仙素浸泡處理后成功獲得了多倍體植株，并發(fā)現(xiàn)在使用 0.2%的秋水仙素浸泡處理 48 h 后，所有種子死亡；當(dāng)使用 0.1%秋水仙素處理 24 h 時(shí)，誘變率（ 30%）相對(duì)較高。本研究中發(fā)現(xiàn)，相同處理濃度和處理時(shí)間，以胚性愈傷組織為受體的多倍體誘變率更高。 本試驗(yàn)中，兩種野生百合多倍體植株均出現(xiàn)小鱗莖增大、葉片增厚變寬、葉色加深、氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞增大、葉綠素含量升高等現(xiàn)象，符合多倍體植株器官“巨大”性的特點(diǎn)。百合鱗莖是由許多鱗片按照一定規(guī)律生長(zhǎng)抱合而成的一種變態(tài)莖，鱗片呈現(xiàn)為花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)。百合鱗片的生長(zhǎng)具有向線性，即在輪生過(guò)程中都向中心莖稈或生長(zhǎng)錐慢慢偏轉(zhuǎn)（戈振揚(yáng) 等， 2013）。本研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)葉百合個(gè)別四倍體植株小鱗莖的外層鱗片向外擴(kuò)張，成不抱合狀態(tài)，不符合正常百合鱗片的向線生長(zhǎng)趨勢(shì)，而蘭州百合多倍體中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。相對(duì)于整數(shù)倍加倍的植株來(lái)說(shuō)，非整倍體植株的形態(tài)變異更為復(fù)雜多樣。 植株離體發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的變異多數(shù)從外觀上難以分辨。近幾年發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)成為離體再生植株的遺傳穩(wěn)定分析的熱門技術(shù)手段。 ISSR（ Inter Simple Sequence Repeat）是分子標(biāo)記技術(shù)最常用的一種分子遺傳標(biāo)記（ Khateeb et al.， 2013），被廣泛用于植物體細(xì)胞胚的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)（ Bekheet et al.， 2015），如番石榴（ Rai et al.， 2012）、草決明（ Naz et al.， 2016）、羽衣甘藍(lán)（ Leroy et al.， 2000）和香蕉（李艷娜 等， 2010）等。本研究中，利用基于 PCR 的 ISSR 技術(shù)檢測(cè)體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的遺傳變化，在再生植株中基本沒(méi)有出現(xiàn)變異條帶，證實(shí)了通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生可以降低遺傳變異（ Hassan et al.， 2015），同時(shí)也為以體胚為材料能夠誘導(dǎo)穩(wěn)定遺傳的多倍體植株提供了佐證。 與形態(tài)學(xué)觀察相比，分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳穩(wěn)定性鑒定中可信度更高（ Mallick et al.， 2017） 。 ISSR技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用到了百合 （ Wang et al.， 2009） 、 馬鈴薯 （ Mcgregor et al.， 2000） 和葫蘆 （ Marzougui et al.， 2000）等植物的多倍體遺傳多樣性分析中。本研究中，兩種百合的多倍體植株在不同 ISSR引物的檢測(cè)下均檢測(cè)到了多態(tài)性條帶。在前期二倍體植株體細(xì)胞胚遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)的基礎(chǔ)上，從分子水平層面上說(shuō)明了加倍植株在遺傳上均發(fā)生了變化， 且這種遺傳變化是由于人工誘導(dǎo)加倍引起的，而非體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生的變異。 References Alsia I， Duma M， Dubova L， enberga A， Dais S. 2016 Comparison of different chlorophylls determination methods for leafy vegetables. 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