園藝學報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0766； http： /www. ahs. ac. cn 1929 收稿日期 ： 2018 07 03； 修回日期 ： 2018 09 22 基金項目 ： 國家自然科學基金項目（ 31201642， 31471895） ；國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金項目（ CARS-25） ；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（ 1610102016026， IVF-BRF2018011） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： fqscaas163.com， wanghuaisongcaas.cn） 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達與功能分析 張瑞騰1,2，呂建春1，周夢迪1，劉靜霖3，李 仁3，郭仰東3，王懷松1,*，付秋實1,*（1中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2山西農業(yè)大學園藝學院，山西太谷 030801；3中國農業(yè)大學園藝學院，北京 100193） 摘 要： 甜瓜（ Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖（ Raffinose Family Oligosaccharides， RFOs）轉運型植物。肌醇半乳糖苷合成酶（ GAS）是催化 RFOs 合成的關鍵酶。甜瓜 CmGAS1 基因（ GenBank 登錄號為 AY077642.1） 的 cDNA 全長為 1 903 bp， 開放閱讀框 （ ORF） 為 996 bp， 編碼 331 個氨基酸。 CmGAS1蛋白分子量約為 38 kD，理論等電點（ pI）為 4.81。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明， CmGAS1 氨基酸序列與黃瓜（ AAO84915.1）親緣關系最近，同源性為 98.79%，與西瓜（ Cla009222）同源性為 97.58%。熒光定量結果表明，甜瓜葉片從幼葉（庫）至成熟葉（源） CmGAS1 的表達顯著升高，第 5 節(jié)位葉片達到最大值。 去掉 50%葉片植株與對照相比， 完全展開功能葉片的 CmGAS1 表達量明顯升高。 應用 CmGAS1特異性啟動子構建 CmGAS1 的過表達載體，并采用農桿菌介導進行甜瓜遺傳轉化，獲得了 PCR 陽性轉化植株，轉化植株完全展開功能葉片的凈光合速率以及葉片中的蔗糖、棉子糖、水蘇糖含量與野生型相比均有所提高。推測 CmGAS1 在甜瓜葉片棉子糖系列寡糖合成過程中起重要作用。 關鍵詞： 甜瓜；肌醇半乳糖苷合成酶；基因表達；遺傳轉化 中圖分類號： S 652 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 10-1929-12 Expression and Function Analysis of CmGAS1 in Melon ZHANG Ruiteng1,2， LÜ Jianchun1， ZHOU Mengdi1， LIU Jinglin3， LI Ren3， GUO Yangdong3， WANG Huaisong1,*， and FU Qiushi1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；2College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801， China；3College of Horticulture， China Agricultural University， Beijing 100193， China） Abstract： Melon belongs to a group of plants that mainly transport Raffinose Family Oligosac- charides（ RFOs） . Galactinol synthase（ GAS） is the key enzyme of RFOs synthesis. The aim of this study was to explore the function of CmGAS1 in melon. The full-length cDNA of CmGAS1（ accession number：AY077642.1） was 1 903 bp， and the open reading frame（ ORF） was 996 bp， encoding 331 amino acids. The molecular weight of CmGAS1 protein was about 38 kD， and the theoretical isoelectric point（ pI） Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1930 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. was 4.81. Amino acid sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the amino acid sequences of CmGAS1 had the closest genetic relationship with cucumber（ AAO84915.1） ， and the homology with cucumber was 98.79%. Homology with watermelon（ Cla009222） was 97.58%. RT-qPCR analysis showed that the expression of CmGAS1 gene increased significantly from young leaves（ sink） to mature leaves（ source） . Expression of the fifth leaf reached the maximum value. Compared with the control， gene expression of the fully expanded functional leaves increased distinctly when 50% leaves were removed. The over expression vector of CmGAS1 was constructed with the specific promoter. The genetic transformation of melon was mediated by Agrobacterium. The positive plants were obtained by PCR identification. The net photosynthetic rates， the content of sucrose， raffinose and stachyose all increased in positive plants compared with the wild type. These results suggested that CmGAS1 played an important role in RFOs synthesis in melon leaves. Keywords： melon； galactinol synthase； gene expression； genetic transformation 光合同化產物是果實產量與品質形成的基礎，光合同化產物在光合器官的合成、韌皮部裝載以及在維管束中的運輸是影響果實發(fā)育的主要因素（ Fu et al.， 2010， 2011b） 。同化物向韌皮部的裝載是同化物長距離運輸?shù)拈_始，裝載物質的成分、濃度及裝載機制等與植物的生長發(fā)育密切相關。 光合同化產物的韌皮部裝載可以通過共質體途徑（ symplastic pathway） ，也可以通過質外體途徑（ apoplastic pathway） （ Fu et al.， 2011a） 。蔗糖的裝載有 3 種機制：分別為擴散型裝載（ diffusion） 、聚合物陷阱（ polymer trapping）和質外體裝載（ apoplastic loading） （ Rennie & Turgeon， 2009； Fu et al.， 2011a） 。擴散型裝載和聚合物陷阱都屬于共質體裝載（ Reidel et al.， 2009； Rennie & Turgeon，2009； Turgeon， 2010a） 。同化物在韌皮部運輸?shù)闹饕问绞翘穷悾计渌\干物質的 90%以上。大多數(shù)高等植物以蔗糖作為光合產物體內運輸?shù)闹饕问?。但自然界中尚有一些植物以棉子糖系列寡糖?Raffinose Family Oligosaccharides ， RFOs ）作為光合產物的主要運輸形式，如葫蘆科（ Cucurbitaceae） 、唇形科（ Lamiaceae） 、木犀科（ Oleaceae）中的許多植物（ Turgeon et al.， 2001；Rennie & Turgeon， 2009； Cao， 2010； Fu et al.， 2011a） 。 甜瓜（ Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖轉運型植物的典型代表（ Haritatos et al.， 2000； Vo l k et al.， 2003） 。 甜瓜韌皮部裝載策略采用 “聚合物陷阱” 機制。 肌醇半乳糖苷合成酶 （ Galactinol Synthase，GAS）催化棉子糖系列寡糖生物合成反應的第一步，催化合成肌醇半乳糖苷。肌醇半乳糖苷是目前所知的唯一的半乳糖基供體，進而合成棉子糖、水蘇糖等寡糖（李芳和汪曉峰， 2008） 。 GAS 在棉子糖系列寡糖合成過程中起關鍵性的作用。 目前關于 GAS 的研究主要集中在逆境脅迫下該酶的活性及其基因表達量的變化。一些豆科（ Leguminosae）和禾本科（ Gramineae）植物的種子在成熟過程中迅速積累棉子糖系列寡糖，被認為在種子脫水過程中起保護作用（ Peterbauer et al.， 2001；宗梅和蔡永萍， 2005） 。此外，不少在非生物脅迫條件下體內不含棉子糖系列寡糖或含量極低的植物，受到低溫或其他滲透脅迫后該類物質迅速積累，植物的抗逆性也迅速增強，在番茄（ Downie et al.，2003） 、水稻（ Tacahashi et al.， 1994） 、苜蓿（ Cunningham et al.， 2003） 、辣椒（繆旻珉 等， 2008）等植物中都存在類似的生理現(xiàn)象。擬南芥轉基因植株中， AtGAS 高效表達引起肌醇半乳糖苷和棉子糖系列寡糖水平增高，表現(xiàn)為葉片耐脫水性增加（ Taji et al.， 2002） 。以上研究表明逆境誘導的 GAS在積累肌醇半乳糖苷和棉子糖系列寡糖從而抵抗非生物脅迫的過程中發(fā)揮著極其關鍵的作用，并且通過轉入 GAS 基因的方法來提高植物的抗逆性是可行的。 張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達與功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1931 由于 GAS 是催化棉子糖系列寡糖合成反應第一步的酶，因此它可能控制著同化物的合成和運輸，但是在這方面的研究極少?？紤]到如果能夠將碳水化合物有效地從植物的葉片中轉運出去，二氧化碳同化和光合速率則都會增加，隨之作物的產量和品質都會提高。改變 GAS 基因的表達很可能會改變源（葉）以及韌皮部中的棉子糖系列寡糖代謝模式，從而達到從根本上調控果實產量與品質形成的目標。因此，本研究中以典型的棉子糖系列寡糖轉運型植物甜瓜為試材，探索通過提高甜瓜體內 CmGAS1 基因的表達來增強碳水化合物的合成和外運，從而提高其品質和產量，并通過基因工程獲得甜瓜轉 CmGAS1 基因新種質，為葫蘆科作物的遺傳育種研究進行理論方面的探索。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 試驗于 2015 年 7 月 2017 年 10 月在中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組實驗室完成，甜瓜材料為 IVF 05 。 大腸桿菌菌株 DH5 購自天根生化科技（北京）有限公司，含有基因啟動子的載體 pSG8E 及表達載體 Pcambia2300，根癌農桿菌菌株 C58 為中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組實驗室保存。 1.2 甜瓜 CmGAS1 的生物信息學分析 利用 DNAMAN 軟件進行 GAS 相關序列的同源性分析； 利用 ProtParam 預測甜瓜 CmGAS1 序列編碼蛋白質的分子量、理論等電點及親疏水性等信息；利用 MEGA6.0 構建系統(tǒng)進化樹。 1.3 應用 CmGAS1 基因特異性啟動子構建過表達載體 含有 CmGAS1基因啟動子的載體 pSG8E由康奈爾大學 Robert Turgeon教授實驗室惠贈 （ Haritatos et al.， 2000）。利用限制性內切酶（北京冰達生物科技有限公司） EcoR酶切質粒 pSG8E。反應條件： 37 溫浴 16 h；反應體系： pSG8E 1 g， 10× Buffer 5 L，內切酶 1 L， ddH2O 補至 50 L。利用瓊脂糖凝膠電泳（ 1%）分離酶切產物并利用 DNA 凝膠回收試劑盒（北京酷來搏科技有限公司）回收目的條帶。利用限制性內切酶 EcoR酶切表達載體質粒 Pcambia2300。反應條件： 37 溫浴12 h，反應體系： Pcambia2300 1 L， 10× Buffer 5 L，內切酶 1 L， ddH2O 補至 50 L。利用 DNA回收試劑盒回收產物，利用 T4 連接酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）連接目的基因及表達載體。反應條件： 16 溫浴 16 h；反應體系：目的基因產物 10 L， Pcambia2300 3 L， T4 連接酶 1 L，ddH2O 補齊至 25 L。將連接產物回收后，轉化大腸桿菌感受態(tài)，涂板（卡那抗性）后挑單克隆搖菌，利用菌液 PCR 及酶切驗證載體構建結果。 1.4 表達載體轉化農桿菌及其轉化甜瓜 將構建完成的表達載體通過電擊轉化法轉化到農桿菌感受態(tài)中，涂板挑單克隆后，利用菌液PCR 驗證載體轉化是否成功。 PCR 反應程序： 94 預變性 10 min； 94 變性 30 s， 56 退火 30 s，72 延伸 45 s， 35 個循環(huán)； 72 延伸 5 min。以甜瓜材料 IVF 05子葉為外植體，利用農桿菌介導進行甜瓜遺傳轉化（毛娟 等， 2013） 。 Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1932 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1.5 CmGAS1 實時熒光定量 PCR 從上至下摘取甜瓜植株 1、 3、 5、 7、 9、 15 節(jié)位展開葉片，用來測定從幼葉（庫）至成熟葉（源）中 CmGAS1 表達量的變化。在甜瓜果實膨大期（授粉后 15 d 左右） ，選取長勢一致的植株，以不去葉為對照，去掉 50%葉片為去葉處理，用來測定源庫變化對 CmGAS1 表達量的影響。以甜瓜總 RNA為模板， 使用 TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒合成 cDNA， 根據(jù) TaKaRa熒光定量說明書及 Roche LightCycler 480 熒光定量 PCR 儀操作要求進行實時熒光定量 PCR。 以甜瓜CmGAS1 基因序列設計熒光定量引物。上游引物 QF： 5-GTGAAGAAATGGTGGGAAGT-3，下游引物 QR： 5-TCAGCCTCAGACAGAACAGA-3。選擇甜瓜 Actin 為內參基因，上游引物 CmactinF：5-TGAAGCACCACTCAACCCG-3，下游引物 CmactinR： 5-TGTCCGACCACTGGCATAGA-3。反應體系共 20 L： 1 L cDNA 模板， 10 L SYBR Green I， 0.4 L 上游引物 QF， 0.4 L 下游引物 QR，8.2 L ddH2O。反應程序： 95 預變性 3 min， 94 變性 30 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 1 min，35 個循環(huán)。設置 3 個生物學重復， 3 個技術重復，用 2-Ct法對樣本基因進行表達差異相對定量分析（ Schmittgen & Livak， 2008；劉培培 等， 2012） 。 1.6 甜瓜轉化苗葉片光合速率及糖含量的測定 光合速率測定：采用 LI-6400 型光合儀（ LI-COR， USA） ，于上午 9： 00 11： 00 測定完全展開葉的凈光合速率 （ Pn） 。 糖含量的測定： 取完全展開功能葉片 0.5 g， 用 5 mL 80%乙醇研碎， 于 80 下浸提 30 min， 4 000 r · min-1離心；收集上清液，再用 5 mL 80%乙醇清洗殘渣，同樣浸提、離心；取上清液，合并提取液，搖勻后取 2 mL 蒸干，用 1 mL 重蒸水溶解過濾后供色譜測定。蔗糖、棉子糖、水蘇糖均采用高效液相色譜（ HPLC）測定。采用日本島津 CLC-NH2柱，工作條件：柱 40 ，流速 l.0 mL · min-1，檢測器 RID-10A 示差折光檢測器，流動相為乙腈 水 = 70 30（體積比） ，每次進樣體積為 6 L， Class-vp 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。根據(jù)樣品峰高和各種糖的標準曲線計算糖含量。 2 結果與分析 2.1 甜瓜 CmGAS1 生物信息學分析 在 GenBank 中搜索，甜瓜 CmGAS1 基因的登錄號為 AY077642.1。開放閱讀框為 996 bp，編碼331 個氨基酸，編碼蛋白分子式為 C1755H2630N422O503S17，分子量為 38 kD，理論等電點（ pI）為 4.81。帶負電的氨基酸 （ Asp + Glu） 47 個， 帶正電的氨基酸 （ Arg + Lys） 31 個， 脂肪族氨基酸指數(shù)為 80.39，親水性平均系數(shù)（ GRAVY）為 0.287。 通過 NCBI 數(shù)據(jù)庫和葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫（ CGD， http： /www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/ index.cgi）上 BLAST 與甜瓜 CmGAS1 氨基酸的同源序列，同時在 DNAMAN 軟件上進行氨基酸同源性比對，甜瓜 CmGAS1 與黃瓜（ AAO84915.1） 、西瓜（ Cla009222） 、土瓶草（ GAV71663.1） 、蓖麻（ EEF43147.1） 、葡萄（ ARS22082.1） 、石榴（ OWM62885.1） 、圓果種黃麻（ OMO64056.1） 、長果種黃麻 （ OMO82198.1） 、 麻瘋樹 （ XP_012082953.1） 、 擬南芥 （ NP_176053.1） 、 兵豆 （ ALO17645.1） 、可可（ EOX95367.1） 、番茄（ NP_001234668.2） 、木薯（ AIE11286.1） 、煙草（ NP_001312500.1） 、油菜（ ADG03603.1） 、甘藍（ XP_013637398.1） 、辣椒（ NP_001311705.1） 、紫苜蓿（ AAM97493.1） 、大豆（ AAM96867.1） 、胡蘿卜（ XP_017224651.1） 、玉米（ AAQ07248.1） 、丹參（ ACT34765.1） 、小麥（ BAF51565.1） 、紫毛蕊花（ ABQ12640.1）和匍匐筋骨草（ CAB51533.1） GAS 氨基酸序列相似張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達與功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1933 性分別為 98.79%、 97.58%、 77.34%、 77.04%、 75.68%、 75.07%、 74.85%、 74.85%、 74.78%、 73.73%、73.73%、 73.59%、 73.08%、 72.92%、 72.30%、 71.93%、 71.93%、 71.51%、 70.69%、 69.73%、 69.23%、68.90%、 68.55%、 68.37%、 68.28%和 67.16%（圖 1） 。 Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1934 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 圖 1 甜瓜與其他植物 GAS 氨基酸序列比對 Fig. 1 Alignment of amino acid of GAS from melon and other plants 利用 MEGA6.0 構建系統(tǒng)進化樹（圖 2） ，比較甜瓜 CmGAS1 氨基酸序列與不同物種間的親緣關系，發(fā)現(xiàn)甜瓜 CmGAS1 氨基酸序列與黃瓜（ AAO84915.1）和西瓜（ Cla009222）聚為一類，表明它們的親緣關系最近，與土瓶草（ GAV71663.1）和蓖麻（ EEF43147.1）親緣關系次之，與紫毛蕊花（ ABQ12640.1）和匍匐筋骨草（ CAB51533.1）等的親緣關系較遠。 圖 2 甜瓜 CmGAS1 與其他植物 GAS 的進化樹分析 Fig. 2 A phylogenetic tree of GAS1 from melon and GAS from other plants 張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達與功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1935 2.2 源庫變化對 CmGAS1 表達的影響 從上至下摘取甜瓜植株 1、 3、 5、 7、 9、 15 節(jié)位展開葉片，用來測定從幼葉（庫）至成熟葉（源）中 CmGAS1 表達量的變化。從圖 3 中可以看出，第 5 節(jié)位完全展開功能葉片 CmGAS1 表達量最高，為第 1 節(jié)位幼葉的 42.03 倍； 第 9 節(jié)位葉片 CmGAS1 基因的表達與第 5 和 7 節(jié)位葉片相比顯著下降，第 15 節(jié)位葉片（衰老葉片）基因的表達又有所回升。 在甜瓜果實膨大期（授粉后 15 d 左右）進行去葉處理。與對照相比，去 50%葉片植株的完全展開功能葉片的 CmGAS1 表達量有明顯升高（圖 3） 。 圖 3 不同節(jié)位甜瓜葉片以及去葉處理對甜瓜 CmGAS1 表達的影響 Fig. 3 CmGAS1 relative expression of different node leaves and source reducing treatments 2.3 過表達載體構建 使用限制性內切酶 EcoR酶切質粒 pSG8E，經瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，獲得了長度為 6 kb 左右包含特異性啟動子的甜瓜 CmGAS1 目的基因條帶（圖 4） ，利用膠回收試劑盒回收目的條帶并保存。利用 T4 連接酶將目的基因與表達載體連接，構建 Pcambia2300-CmGAS1 質粒載體（圖5） 。 圖 4 含有特異性啟動子的目的基因 CmGAS1 酶切結果 M： Marker S Plus； 1 6：含有特異性啟動子的目的基因 CmGAS1。Fig. 4 Results of enzymatic digestion of target gene CmGAS1 with specific promoter M： Marker S Plus； 1 6： Target gene CmGAS1 with specific promoter.圖 5 Pcambia2300-CmGAS1 質粒載體構建 M： Marker DL2000； 1 2： Pcambia2300 質粒載體； 3： Pcambia2300-CmGAS1 質粒載體。 Fig. 5 Construction of Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector M： Marker DL2000； 1 2： Pcambia2300 plasmid vector； 3： Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector. Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1936 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 將連接產物回收后，將含有 Pcambia2300-CmGAS1 質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)，菌液 PCR 驗證，結果顯示載體中含有目的基因（圖 6） 。 EcoR酶切驗證結果如圖 7 所示， 載體 Pcambia2300-CmGAS1 被酶切為 Pcambia2300 質粒和目的基因兩條帶。經過菌液 PCR 及酶切驗證表明載體構建成功。 圖 6 Pcambia2300-CmGAS1 質粒菌液 PCR 結果 M： Marker ； 1 2： Pcambia2300-CmGAS1 的大腸桿菌菌液 PCR 產物； 3： pSG8E 質粒； 4： Pcambia2300 空載體。 Fig. 6 PCR amplified product of Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector M： Marker ； 1 2： PCR products of Escherichia coli from Pcambia2300-CmGAS1； 3： pSG8E plasmid； 4： Pcambia2300 empty plasmid vector. 圖 7 載體 Pcambia2300-CmGAS1 的 EcoR酶切驗證 M： 1 kb plus marker； 1：未酶切 Pcambia2300-CmGAS1； 2 3：用 EcoR酶切后的 Pcambia2300-CmGAS1 質粒（上條帶為質粒 Pcambia2300，下條帶為目的基因） ； 4：空載體。 Fig. 7 Restriction enzyme analysis of Pcambia2300-CmGAS1 vector M： 1 kb plus marker； 1： Non-enzymatic digestion； 2 3： Enzymatic digestion（ The upper strip was plasmid Pcambia2300 and the next stripe was the target gene） ； 4： Empty plasmid vector. 2.4 表達載體轉化農桿菌 將構建好的 Pcambia2300-CmGAS1表達載體轉化到農桿菌中，經菌液 PCR 驗證，表明農桿菌菌液中含有甜瓜 CmGAS1 目的基因，載體已成功轉入農桿菌中（圖 8） ，可以進行后期的農桿菌介導的遺傳轉化試驗。 2.5 甜瓜遺傳轉化 采用甜瓜 IVF 05子葉為外植體（圖 9，A），利用含有 Pcambia2300-CmGAS1 的農桿菌菌液侵染（ OD600 = 0.25） 15 min 后，接種于MS 誘導分化培養(yǎng)基（ MS + 1.0 mg · L-16-BA + 1.0 mg · L-1ABA）上進行共培養(yǎng) 2 3 d（圖 9，B）。然后轉移至分化抗性培養(yǎng)基（ MS + 1.0 mg · L-1 6-BA + 1.0 mg · L 1ABA + 300 mg · L-1 Cef）中，約 4 周左右即可分化出抗性不定芽（圖 9， C），長到 1 2 cm 時將不定芽切下，分株移入 MS 生根培養(yǎng)基（ MS + Cef 100 mg · L-1），約兩周左右即可生根（圖 9， D）。以 100 mg · L-1卡那霉素篩選轉化體，獲得了完整的轉化植株（圖 9， E）。 圖 8 轉農桿菌 PCR 結果 M： Marker ； 1： Pcambia2300 空載體； 2： pSG8E 質粒； 3 4：轉化農桿菌。 Fig. 8 Results of Agrobacterium tumefaciens PCR M： Marker ； 1： Pcambia2300 empty plasmid vector； 2： pSG8E vector； 3 4： Transferred into Agrobacterium tumefaciens. 張瑞騰，呂建春，周夢迪，劉靜霖，李 仁，郭仰東，王懷松，付秋實 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表達與功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1937 圖 9 轉化苗的獲得 A：甜瓜種子萌發(fā)； B：共培養(yǎng)； C：誘導不定芽； D：幼苗生根； E：轉化苗移栽。 Fig. 9 Results of transformation seedlings A： Melon seed germination； B： Co-cultivation； C： Shoot regeneration； D： Root formation； E： Transplanted seedlings. 2.6 甜瓜轉化植株 T0代 PCR 及 qRT-PCR 鑒定 提取生根后移栽成活的轉化植株葉片的 DNA 進行 PCR 檢測。以 pSG8E 質粒為陽性對照，野生型植株 DNA 為陰性對照進行 PCR 擴增，結果表明轉化株和陽性對照均擴增出目的條帶且大小一致，而陰性對照無擴增條帶。 8 株轉化株葉片中的 CmGAS1 的表達均顯著高于野生型，尤其是轉化苗 2、 3、 4（圖 10） 。 圖 10 轉化苗的 PCR 及 qRT-PCR 檢測 M： Marker 2000； 1 8：轉化株； 9：質粒； WT：野生型植株。 Fig. 10 Detection of transformed melon plants by PCR and qRT-PCR M： Marker 2000； 1 8： Transformed plant； 9： Plasmid； WT： Wild type plant. Zhang Ruiteng， Lü Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1938 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 2.7 甜瓜轉化苗光合速率及糖含量的測定 選取 CmGAS1 表達量較高的轉化苗 2、 3、 4 進行檢測，與野生型相比，陽性轉化株完全展開功能葉片的凈光合速率顯著升高，葉片中的蔗糖、棉子糖、水蘇糖均有所提高，但其中轉化苗 4 中的棉子糖，轉化苗 2 中的水蘇糖與野生型無顯著差異（表 1） 。 表 1 葉片光合速率及糖含量 Table 1 Photosynthetic rates and sugar content in melon leaves 材料 Material Pn/（ mol · m-2· s-1） 蔗糖 /（ mg · g-1） Sucrose 棉子糖 /（ mg · g-1） Raffinose 水蘇糖 /（ mg · g-1） Stychose 野生型 Wild type 10.86 ± 0.24 b 1.86 ± 0.02 c 0.53 ± 0.03 b 0.89 ± 0.03 b 轉化苗 2 Transformed seedling 2 13.31 ± 0.