甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)基因BoPLL的克隆、定位與表達(dá)分析.pdf
<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 85 96. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0389； http： /www. ahs. ac. cn 85 收稿日期 ： 2017 08 12； 修回日期 ： 2017 11 08 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31572127） ；西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（ XDJK2016E079） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zhuliquanswu.edu.cn） 甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)基因 BoPLL 的克隆、定位與表達(dá)分析 羅紹蘭1，蒲 敏1，曾 靜1，施松梅2，廉小平2，王玉奎1，白曉璟1，張賀翠1，朱利泉1,*（1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716；2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400716） 摘 要： 對(duì)高度自交不親和甘藍(lán)柱頭進(jìn)行自花授粉和異花授粉處理后，取柱頭進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)譜的比較研究，獲得一種受自花授粉誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，異花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的蛋白，命名為 BoPLL。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)， BoPLL 在自花授粉 0 30 min 上調(diào)表達(dá)， 30 60 min 下調(diào)表達(dá)，而在異花授粉 0 60 min 一直上調(diào)表達(dá)?？寺～@得 cDNA 為 1 212 bp，編碼含 403 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì) BoPLL。序列分析發(fā)現(xiàn) BoPLL 含有高度保守的 PASTA 結(jié)構(gòu)域和 CMM-10 結(jié)構(gòu)域、中度保守的 PbH1 結(jié)構(gòu)域、低度保守的 HYDRO 結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明該蛋白是典型的 PLL 家族蛋白。染色體定位結(jié)果表明，該基因與自交不親和性相關(guān)基因不連鎖。進(jìn)化分析表明，甘藍(lán) BoPLL 與擬南芥 AtPLL 親緣關(guān)系最近，與苜蓿 MtPLL 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 RT-PCR 發(fā)現(xiàn)， BoPLL 在甘藍(lán)花粉和柱頭中表達(dá)，且柱頭中的表達(dá)量明顯低于花粉，在葉片、花蕾、萼片和花瓣中均沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)。 熒光定量 PCR 結(jié)果顯示， BoPLL 在自花授粉和異花授粉 15 60 min的表達(dá)變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè) BoPLL 可能是一種參與甘藍(lán)自交不親和反應(yīng)過(guò)程的基因。 關(guān)鍵詞： 甘藍(lán)； BoPLL 基因；基因克??；定位；表達(dá)分析 中圖分類(lèi)號(hào)： S 635 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 01-0085-12 Molecular Cloning ， Location and Expression Analysis of BoPLL in Self-incompatibility Brasscia oleracea LUO Shaolan1， PU Min1， ZENG Jing1， SHI Songmei2， LIAN Xiaoping2， WANG Yukui1， BAI Xiaojing1，ZHANG Hecui1， and ZHU Liquan1,*（1College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400716， China；2College of Horticulture and Landscape Architecture， Southwest University， Chongqing 400716， China） Abstract： The stigmas were from collected self-pollination and cross-pollination of Brassica oleracea L. var. capitata L. and were used to analyze protein expression profiles. We obtained a protein that was down-regulation expression in self-pollination and up-regulation in cross-pollination treatments， which was named BoPLL. Moreover， transcriptomic analysis also showed BoPLL was up-regulated at 0 30 min and down-regulated at 30 60 min in self-pollination process， while it was up-regulated in cross-pollination Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 86 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 85 96. process. The CDS of BoPLL was 1 212 bp in length， encoding 403 amino acids of BoPLL. Sequence analysis found BoPLL contained a high conserved PASTA domain and a CMM-10 domain， moderate conserved PbH1 domain， and a low conserved HYDRO domain， indicating it was a typical PLL protein. Chromosomal location displayed that BoPLL is not linked with S locus genes. Phylogenetic tree analysis showed that Brassica oleracea L. BoPLL was more close to Arabidopsis thaliana AtPLL rather than Medicago truncatula MtPLL. RT-PCR analysis found BoPLL was predominantly expressed in pollen and stigma， with lower expression level of BoPLL in pistil than pollen， and no expression in leaf， flower bud，sepal and petal. qRT-PCR analysis revealed that the mRNA in 1560 min expression patterns of BoPLL was similar with the RNAseq analysis. Based on those results， we speculated that BoPLL was involved in SI response in B. oleracea. Keywords： Brassica oleracea； BoPLL； gene cloning； location； expression analysis 自交不親和性（ self-incompatibility， SI）甘藍(lán)柱頭能特異性識(shí)別、排斥自花花粉，接受異花花粉。甘藍(lán) SI 涉及柱頭和花粉相互識(shí)別引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。甘藍(lán)自交不親和性的產(chǎn)生不僅與 S 位點(diǎn)基因編碼蛋白有關(guān) （ Goring et al.， 1993； Nasrallah et al.， 1994） ， 同時(shí)還受其他蛋白的調(diào)控， 如 ARC1、THL1/THL2、 MLPK 等（朱利泉和 周燕 ， 2015） ，這些蛋白的編碼基因雖然不與 S 位點(diǎn)連鎖，但對(duì)于自交不親和至關(guān)重要，它們也是 SI 的功能分子。目前對(duì)于這些蛋白元件在自交不親和反應(yīng)中的功能研究較多，而通過(guò)影響花粉管生長(zhǎng)進(jìn)而調(diào)控自交不親和的分子機(jī)制尚不清楚?；ǚ墼谥^上萌發(fā)過(guò)程中，降解果膠質(zhì)的酶具有水解花粉和柱頭細(xì)胞壁，促進(jìn)花粉在柱頭上萌發(fā)的作用（ Suen et al.，2003； Jiang et al.， 2014a） ；在花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，這些酶具有破壞花粉管細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)花粉管伸長(zhǎng)的作用（ Suen & Huang， 2007； Jiang et al.， 2014b） 。但是這些降解果膠質(zhì)的酶是否在甘藍(lán) SI過(guò)程中發(fā)揮作用，相互間是否存在聯(lián)系，都值得深入研究。 本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì) SI 甘藍(lán)柱頭進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)譜的比較研究， 克隆得到 BoPLL（ Brassica oleracea Pectate Lyase Like）基因，進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、生物信息學(xué)分析、染色體定位和 QRT-PCR分析，旨在為深入研究 SI 信號(hào)傳導(dǎo)途徑提供新的內(nèi)容。 1 材料與方法 1.1 材料 甘藍(lán)自交不親和系 A4和 F1由西南大學(xué)十字花科研究所提供，種植在實(shí)驗(yàn)基地隔離網(wǎng)內(nèi)。2016 年 3 月底至 4 月初，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的 A4花蕾，于開(kāi)花當(dāng)天人工去雄，用成熟的 A4和 F1花粉對(duì) A4進(jìn)行自花和異花授粉處理。分別取未授粉柱頭和自花、異花授粉 3 5、 15、 30和 60 min 的柱頭，立刻放入液氮速凍保存。同時(shí)取葉片、花蕾、萼片、花瓣、花藥和柱頭于 80 保存?zhèn)溆谩? 1.2 蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜鑒定 利用非線性 IPG 固相膠條 （ 17 cm， pH 3 10） 對(duì)甘藍(lán) A4 自花授粉和異花授粉 3 5 和 60 min后柱頭總蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳。采用 TCA/丙酮法提取柱頭總蛋白質(zhì)（ Zou et al.， 2009） ，參照陳松等（ 2013）方法分離蛋白質(zhì)，銀染后掃描。選取 3 張重復(fù)性較好的 2-DE 圖像，利用 PDQuest 8.0 軟羅紹蘭，蒲 敏，曾 靜，施松梅，廉小平，王玉奎，白曉璟，張賀翠，朱利泉 . 甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)基因 BoPLL 的克隆、定位與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 85 96. 87 件（ Bio-Rad 公司）分析和篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，根據(jù) PDQuest 軟件中 Quantity table report 值統(tǒng)計(jì) 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)圖像的平均值，計(jì)算相對(duì)變化量。從 SDS-PAGE 膠上切下差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)送北京華大基因公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 1.3 SI 甘藍(lán)自花、異花授粉后柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 根據(jù)蛋白質(zhì)譜結(jié)果，進(jìn)一步采用授粉處理 60 min 之內(nèi)的柱頭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。分別將未授粉柱頭和自花授粉后 15、 30 和 60 min；異花授粉后 15、 30 和 60 min 的柱頭提取總 RNA，送北京百邁克公司用 HiSeq 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序， 利用 Trinity軟件對(duì)各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行 Unigenes組裝， 通過(guò) RPKM值（ Reads per kilo bases per million reads，每百萬(wàn) reads 中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的 reads 數(shù)）來(lái)反映 Uigenes 表達(dá)豐度， 使用 IDEG6 軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的檢測(cè)， 以 log2（不同時(shí)期 RPKM 比值）絕對(duì)值大于等于 1 為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)基因，通過(guò) Blast 軟件將差異表達(dá) Unigenes 序列與 NR、 NT、GO、 COG、 KEGG、 SwissProt 和 TrEMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得 Unigenes 注釋信息，通過(guò)檢索蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)（網(wǎng)址 http： /brassica.nbi.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html）找到其同源基因序列，并在差異表達(dá)基因中找到 BoPLL 基因 ， 分析其在自花、異花授粉 0、 15、 30 和 60 min 的表達(dá)量變化情況。 1.4 BoPLL 的克隆 根據(jù)蛋白質(zhì)雙向電泳和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的 cDNA 序列， 結(jié)合蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù) （網(wǎng)址 http： /brassica. nbi.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html） ，用 Primer primer6.0 軟件設(shè)計(jì)引物： BoPLL-F、 BoPLL-R（表1） 。分別以甘藍(lán)葉片 gDNA 和自花授粉 30 min 柱頭 cDNA 為模板，利用 PrimerSTAR Max DNA Polymerase（ TaKaRa，北京） 25 µL 反應(yīng)體系 PCR 擴(kuò)增 BoPLL 的編碼序列。反應(yīng)程序： 98 預(yù)變性 2 min； 98 10 s， 60 15 s， 72 延伸 55 s， 35 個(gè)循環(huán)； 72 終延伸 5 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1 × 104 mg · L-1瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后與 pEASY®-Blunt 克隆載體（全式金，北京）連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5，經(jīng)菌落 PCR 鑒定后挑取陽(yáng)性克隆送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。 表 1 基因克隆及其熒光定量 PCR 分析所用引物 Table 1 Primers used for gene cloning and analysis of real-time PCR 用途 Use 引物名稱(chēng) Primer name 引物序列 Primer sequence（ 5 3） 擴(kuò)增 cDNA 全長(zhǎng) For the full length cDNA BoPLL-F ATGACTTGCATTGCTTCTGC BoPLL-R TCAGTTCAGGCAATGCTGAG 熒光定量 PCR 引物 Primers for real-time PCR RT-PCR-F CTTCTCATCGTGTCTTAAACACAT RT-PCR-R CGTTCCTTTCGGTACGTAGAT 擴(kuò)增內(nèi)參基因 For the internal control Actin3-F GAGTAGAAAATGGCTGATGGTGAAG Actin3-R TCATCTTCTCACGGTTAGCCTTTG 1.5 BoPLL 的染色體定位 將 BoPLL 中保守性較高的序列區(qū)段作為探針，在甘藍(lán)全基因組進(jìn)行掃描，查找是否有 BoPLL的靶結(jié)合序列，以此來(lái)判定該基因在染色體上的位置。進(jìn)一步在該基因兩側(cè)尋找與之連鎖的基因。用相同的方法依次尋找與 SI 相關(guān)的 S 位點(diǎn)糖蛋白（ S-locus glycoprotein， SLG） 、 S 位點(diǎn)受體激酶（ S-locus receptor kinase， SRK） 、 SCR/SP11（ S-locus cysteine-rich protein/S-locus protein 11） 、類(lèi)硫氧還蛋白 1/2（ Thioredoxin-like protein 1/2， THL1/2） 、 M 位點(diǎn)蛋白激酶 （ M-locus protein kinase， MLPK） 、Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 88 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 85 96. 臂重復(fù)蛋白 1（ Arm repeat containing 1， ARC1）和 Exo70A1 的靶結(jié)合序列，確定它們?cè)谌旧w上的位置。以此來(lái)判斷 BoPLL 基因是否與 SI 相關(guān)的基因連鎖。 1.6 BoPLL 的生物信息學(xué)分析 利用 GSDS 在線工具（ http： /gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因組結(jié)構(gòu)；利用在線工具 ProtParam分析 BoPLL 基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；利用 Signalp 4.1 server 軟件預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；利用 TMHMM Server v.2.0在線軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)； 利用在線工具 SOPMA軟件分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用 Netphos 2.0 server 軟件預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；運(yùn)用 ProtScale 在線分析軟件預(yù)測(cè)疏水性 /親水性；利用 SMART 網(wǎng)站（ http： /smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域；利用 Cell-PLoc 在線工具（ http：/ /www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；使用 DNAMAN Version 6.0 軟件將 BoPLL 與甘藍(lán)型油菜 BnPLL（ XP 013681553.1） 、 白菜型油菜 BrPLL（ XP 009133429.1） 、 蘿卜RsPLL（ XP 018475341.1） 的氨基酸序列比對(duì)分析； 用 MEGA6 軟件結(jié)合 NCBI 網(wǎng)站 （ http： /www.ncbi. nlm.nih.gov/）上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建 BoPLL 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 1.7 BoPLL 的表達(dá)分析 通過(guò) QRT-PCR 技術(shù)檢測(cè) BoPLL 在葉片、花蕾、萼片、花瓣、花粉和柱頭等組織中的表達(dá)量，Samuel 等（ 2009）和 Chandna 等（ 2012）對(duì)候選內(nèi)參基因的評(píng)價(jià)分析結(jié)果，以 Actin3 作為內(nèi)參（表1） ， 具體操作按照高保真 DNA 聚合酶 PrimeSTAR 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 PCR 擴(kuò)增參數(shù)為： 98 預(yù)變性 2 min；98 10 s； 56 5 s； 72 延伸 6 s； 30 個(gè)循環(huán)； 72 延伸 5 min； 4 保存。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1 × 104 mg · L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 根據(jù)獲得的 BoPLL 序列設(shè)計(jì)熒光定量 PCR 特異性引物： RT-PCR-F、 RT-PCR-R（表 1） ，以未授粉柱頭，自花授粉 15、 30 和 60 min 和異花授粉 15、 30 和 60 min 的柱頭 cDNA 為模板， Actin3為內(nèi)參。 Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix 為熒光定量 PCR 染料，反應(yīng)體系為 10 µL，在 Bio-Rad CFX-1000 熒光定量 PCR 儀上對(duì)目的基因進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)。 反應(yīng)參數(shù)： 95 30 s； 95 10 s；57 10 s； 72 10 s； 40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)。 40 個(gè)循環(huán)后 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析。 反應(yīng)完成后利用 Bio-Rad CFX Manager Software 和 Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 甘藍(lán) BoPLL 蛋白的分離與質(zhì)譜鑒定 將蛋白質(zhì)點(diǎn) 6324 肽指紋圖譜與擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與擬南芥 AtPLL（ LOC106333535）匹配性最高， 相似性為 40.2%， 將該蛋白質(zhì)命名為 Brassica oleracea Pectate Lyase Like（簡(jiǎn)稱(chēng) BoPLL） 。雙向電泳結(jié)果顯示 BoPLL 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約 45 kD， pI 約為 8.9。 PDQuest 軟件統(tǒng)計(jì) BoPLL 蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量顯示自花授粉 3 5 min 的平均值為 1 086.1， 60 min時(shí)為 331.9；異花授粉 3 5 min 的平均值為 430.7， 60 min 時(shí)為 1 009.1。 BoPLL 蛋白質(zhì)在自花授粉后 60 min 的表達(dá)量相對(duì)于 3 5 min 的表達(dá)量明顯減少， 而在異花授粉后 60 min 的表達(dá)量相對(duì)于 3 5 min 的表達(dá)量顯著增加，與自花授粉后的變化趨勢(shì)剛好相反（圖 1） 。 羅紹蘭，蒲 敏，曾 靜，施松梅，廉小平，王玉奎，白曉璟，張賀翠，朱利泉 . 甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)基因 BoPLL 的克隆、定位與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 85 96. 89 圖 2 甘藍(lán)柱頭內(nèi) BoPLL 響應(yīng)自花和異花授粉后表達(dá)模式 Fig. 2 Expression pattern of BoPLL in stigmas in response to self-pollination and cross-pollination 圖 3 甘藍(lán) BoPLL gDNA 和 cDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖 Fig. 3 The agrose gel electrophoresis of gDNA and cDNA PCR product of Brassica oleracea BoPLL 圖 1 BoPLL 蛋白雙向電泳圖（左）和自花、異花授粉誘導(dǎo)甘藍(lán)柱頭 BoPLL 蛋白差異表達(dá)（右） 箭頭所指為 BoPLL 蛋白所在位置。 Fig. 1 The 2-DE electrophoresis of BoPLL protein（ left） and differential expression of protein BoPLL in Brassica oleracea stigma after self-pollination and cross-pollination（ right） The arrows indicated the location of protein BoPLL. 2.2 BoPLL 的轉(zhuǎn)錄水平分析 根據(jù)雙向電泳結(jié)果， BoPLL 蛋白在自花和異花授粉后變化趨勢(shì)相反，為了進(jìn)一步驗(yàn)證BoPLL 蛋白響應(yīng)自交不親和反應(yīng)過(guò)程，以甘藍(lán) A4未授粉柱頭和自花和異花授粉處理的柱頭為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。結(jié)果顯示BoPLL 在自花授粉 0 30 min 持續(xù)顯著上調(diào)表達(dá)，而在 30 60 min 急劇下降；在異花授粉0 15 min 也是顯著上調(diào)表達(dá)， 15 30 min 無(wú)明顯變化， 30 60 min 繼續(xù)顯著上調(diào)表達(dá)（圖2） 。 2.3 BoPLL 的克隆 對(duì)甘藍(lán) BoPLL 的克隆結(jié)果表明， BoPLL gDNA PCR 產(chǎn)物大小約 1 800 bp， cDNA PCR產(chǎn)物約 1 200 bp（圖 3） 。 測(cè)序結(jié)果表明 PCR 擴(kuò)增所獲得的 BoPLL gDNA 序列長(zhǎng)度為 1 796 bp， cDNA 序列長(zhǎng)度為1 212 bp，包含了 BoPLL 完整的編碼框。 2.4 BoPLL 的染色體定位 將 BoPLL 中保守性較高的序列區(qū)段作為探針，在甘藍(lán)全基因組進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)唯一的靶結(jié)合序列，表明該基因位于 3 號(hào)染色體上，與之緊密連鎖的基因有 LOC106331600、LOC106328192、 LOC106331914、 LOC106335979、 LOC106336284、 LOC106331557、 LOC106332625、LOC106336028、 LOC106329208、 LOC106335956、 LOC106329557、 LOC106332152、 LOC106332233、Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 90 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 85 96. LOC106332234、 LOC106335288、 LOC106329166、 LOC106328188、 LOC106335790、 LOC106330019、LOC106330020。 蕓薹屬作物與 SI 相關(guān)的基因 SLG、 SRK、 SCR/SP11、 THL1/2、 MLPK、 ARC1 和 Exo70A1 在染色體上的位置如圖 4 所示，只有 MLPK 與 BoPLL 同在 3 號(hào)染色體上，但是相距甚遠(yuǎn)，說(shuō)明 BoPLL不與甘藍(lán) SI 相關(guān)的基因緊密連鎖，表明其可能是參與 SI 過(guò)程的反式作用因子。 圖 4 甘藍(lán) BoPLL 和 SI 相關(guān)基因在染色體上的分布 Fig. 4 Genomic distribution of BoPLL and SI releted gene in chromosomes of Brassica oleracea 2.5 BoPLL 生物信息學(xué)分析 Clustal 件比對(duì)分析 BoPLL gDNA 和 cDNA 序列，發(fā)現(xiàn)該基因由 4 個(gè)外顯子（分別為 147、 310、519 和 232 bp）和 3 個(gè)內(nèi)含子（分別為 82、 232 和 95 bp）組成（圖 5） 。 內(nèi)含子剪切位點(diǎn)完全遵守經(jīng)典的 GT-AG 法則。 BoPLL 的 ORF 全長(zhǎng) 1 212 bp，編碼 403 個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量為 43.7 kD，理論等電點(diǎn)（ pI）為 8.87，與柱頭總蛋白質(zhì)雙向電泳分析中蛋白質(zhì)點(diǎn) 6324 的相對(duì)分子質(zhì)量大小和等電點(diǎn)基本一致， 證明擴(kuò)增的 BoPLL 就是蛋白質(zhì)點(diǎn) 6324 的編碼序列，BoPLL 的 Gene ID： 106333535。 圖 5 甘藍(lán) BoPLL gDNA 的結(jié)構(gòu)圖 Fig. 5 The gene structure of Brassica oleracea BoPLL gDNA 羅紹蘭，蒲 敏，曾 靜，施松梅，廉小平，王玉奎，白曉璟，張賀翠，朱利泉 . 甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)基因 BoPLL 的克隆、定位與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 85 96. 91 由圖 6 可以看出，在氨基酸組成中， Asn 和 Gly 出現(xiàn)頻率較高，分別占氨基酸總數(shù)的 9.93%和9.43%，而氨基酸 Trp、 Tyr、 Met 和 Gln 分別僅占氨基酸總數(shù)的 1.0%、 1.7%、 1.7%和 2.2%。帶負(fù)電荷的氨基酸（ Asp + Glu）殘基有 32 個(gè)，帶正電荷的氨基酸（ Arg + Lys）殘基有 42 個(gè)。 BoPLL 屬于疏水性蛋白質(zhì)。 BoPLL 蛋白質(zhì)包含 5 個(gè) N 糖基化位點(diǎn)， 9 個(gè) N豆蔻?；稽c(diǎn)， 5個(gè)蛋白質(zhì)激酶 C 磷酸化位點(diǎn)， 3 個(gè)酪蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)， 1 個(gè) ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)， 1 個(gè)多聚半乳糖醛酸酶活性位點(diǎn)。 圖 6 甘藍(lán) BoPLL gDNA 結(jié)構(gòu)圖及其推導(dǎo)的氨基酸序列 實(shí)線框?yàn)?N糖基化位點(diǎn)，虛線框?yàn)?N豆蔻?；稽c(diǎn)，橢圓為蛋白激酶 C 磷酸化位點(diǎn)， 虛線橢圓為酪蛋白磷酸化位點(diǎn)，下劃線為 ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)， 點(diǎn)線為聚半乳糖醛酸酶活性位點(diǎn)。 Fig. 6 The gene structure of Brassica oleracea BoPLL and its deduced amino acid sequence The box was N-glycosylation site， the dashed box for N-myristoylation site， the oval for protein kinase C phosphorylation site， the dashed oval for casein kinase phosphorylation site， the underline for ATP/GTP-binding site， the spot for polygalacturonase active site. Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 92 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 85 96. 通過(guò)分析發(fā)現(xiàn) BoPLL 蛋白質(zhì) N端有跨膜結(jié)構(gòu)域和一段潛在的位號(hào)肽段，屬于疏水性蛋白，定位于胞內(nèi)近膜側(cè)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)含有 螺旋 6.95%、無(wú)規(guī)則卷曲 53.35%和延伸鏈 39.70%。BoPLL 具有 PLL 基因家族典型的功能域，包含 4 個(gè) PbH1 結(jié)構(gòu)域、 HYDRO 結(jié)構(gòu)域、 PASTA 結(jié)構(gòu)域和 CMM-10 結(jié)構(gòu)域。通過(guò) GO 功能注釋?zhuān)?PLL 基因家族蛋白主要作用是降解植物細(xì)胞壁、導(dǎo)致植物組織軟化。在植物生殖發(fā)育過(guò)程中， PLL 基因家族蛋白與花粉壁生長(zhǎng)相關(guān)，主要在植物花粉發(fā)育、授粉和受精過(guò)程中起作用。通過(guò) NCBI 網(wǎng)站 Blast 檢索表明 BoPLL 與 AtPLL 的核苷酸序列及氨基酸序列的一致性最高，分別為 85%和 84%（圖 7）。 利用 MEGA 軟件構(gòu)建 BoPLL 遺傳進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn) BoPLL 與 AtPLL 親緣關(guān)系最近， 與 EsPLL 親緣關(guān)系次之，與 MtPLL 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖 8）。 圖 7 BoPLL 蛋白與同源蛋白序列多重比對(duì) 括弧代表 PbH1 結(jié)構(gòu)域，圓點(diǎn)代表 HYDRO 結(jié)構(gòu)域，方形點(diǎn)代表 PASTA 結(jié)構(gòu)域，實(shí)線代表 CBM-10 結(jié)構(gòu)域。 Fig. 7 The multiple sequence alignment of BoPLL with homologous proteins The PbH1-domain， HYDRO-domain， PASTA-domain and CBM-10-domain are marked with parentheses， dots， square point and solid line， respectively. 羅紹蘭，蒲 敏，曾 靜，施松梅，廉小平，王玉奎，白曉璟，張賀翠，朱利泉 . 甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)基因 BoPLL 的克隆、定位與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 85 96. 93 圖 8 甘藍(lán) BoPLL 及其同源氨基酸序列關(guān)系分析 Fig. 8 The phylogenetic relationship of amino acid sequences between Brassica oleracea BoPLL with its homologous proteins 2.6 BoPLL 的表達(dá)分析 半定量 RT-PCR 分析結(jié)果（圖 9）表明， BoPLL 主要在甘藍(lán)花粉和柱頭中表達(dá)，在柱頭中的表達(dá)量明顯低于花粉中表達(dá)量。而在葉片、花蕾、萼片以及花瓣中均沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。 圖 9 甘藍(lán) BoPLL 在不同組織中的表達(dá)檢測(cè) Fig. 9 Expression analysis of BoPLL in different organs of Brassica oleracea 另外一方面，在自花和異花授粉后不同時(shí)間的表達(dá)結(jié)果（圖 10）表明，該基因在自花授粉過(guò)程中， 0 15 min 下調(diào)表達(dá)，在授粉 30 min 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，隨后表達(dá)量一直下降；在異花授粉過(guò)程中， 0 15 min BoPLL 也是下調(diào)表達(dá)，在授粉 15 min 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低，隨后上調(diào)表達(dá)。即在自花和異花授粉 30 min 以后 BoPLL 基因表達(dá)趨勢(shì)完全相反，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致。 圖 10 甘藍(lán)柱頭內(nèi) BoPLL 響應(yīng)自花和異花授粉后表達(dá)模式 Fig. 10 Expression pattern of BoPLL in stigmas in response to self-pollination and cross-pollination of Brassica oleracea Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 94 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 85 96. 3 討論 甘藍(lán)是典型的孢子體型自交不親和植物（ Whitehouse， 1978） ?；ǚ酆椭^相互作用的過(guò)程包括花粉粘附、水合、萌發(fā)及隨后花粉管穿入柱頭等過(guò)程</p>
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