轉(zhuǎn)Cry1Ac青花菜回交后代鑒定方法研究.pdf

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轉(zhuǎn)Cry1Ac青花菜回交后代鑒定方法研究.pdf

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 97 108. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0617； http： /www. ahs. ac. cn                                                   97 收稿日期： 2017 10 19；修回日期： 2017 12 01   基金項(xiàng)目： “十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題項(xiàng)目（ 2013BAD01B04）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（ CARS-23-A）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： liuyumeicaas.cn）  轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代鑒定方法研究  李占省，張黎黎，張小麗，舒金帥，蘇彥賓，孫繼峰，劉玉梅*，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊  木，張揚(yáng)勇，呂紅豪  （中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京  100081）  摘  要：轉(zhuǎn) Bt 基因青花菜在遺傳分離后代中的鑒定方法，對(duì)于準(zhǔn)確篩選陽性單株和抗蟲材料具有重要影響。利用 5 份青花菜材料、 1 份陽性對(duì)照（轉(zhuǎn) Cry1Ac 基因純合材料）和 5 份回交父本（陰性對(duì)照）為試驗(yàn)對(duì)象，在基因水平上對(duì) Cry1Ac 進(jìn)行普通 PCR 擴(kuò)增，蛋白水平上采用 Bt-Cry1Ab/1Ac 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條測(cè)定，表觀上采用小菜蛾離體飼蟲試驗(yàn)進(jìn)行抗性鑒定，比較闡明了 3 種方法的鑒定效果和優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果表明， 3 種方法分別從 5 份青花菜回交材料的 159 個(gè)分離單株中檢測(cè)到 82、 77 和 75 份陽性株，經(jīng)卡方顯著性檢驗(yàn)，各材料陽性單株與非陽性單株分離后代均符合孟德爾遺傳規(guī)律。分析表明，小菜蛾離體飼蟲試驗(yàn)對(duì)于鑒定轉(zhuǎn) Cry1Ac 后代抗蟲效果準(zhǔn)確可靠，但需要很好地控制實(shí)驗(yàn)條件； Bt-Cry1Ab/1Ac 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條靈敏度高，可快速觀察到 Bt 毒蛋白的實(shí)際表達(dá)量，基本不受條件限制，但必須控制人為誤差；普通 PCR 擴(kuò)增能夠鑒定陽性株，但不能反映實(shí)際抗蟲效果，必須結(jié)合小菜蛾飼蟲試驗(yàn)或 Bt 毒蛋白水平上的檢測(cè)才能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定。  關(guān)鍵詞：青花菜；轉(zhuǎn)基因； Cry1Ac；小菜蛾；遺傳  中圖分類號(hào)： S 635.9       文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A        文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 01-0097-12 Studies on Identification Methods in Backcross Generation of Cry1Ac- transgenic Broccoli   LI Zhansheng， ZHANG Lili， ZHANG Xiaoli， SHU Jinshuai， SU Yanbin， SUN Jifeng， LIU Yumei*，F(xiàn)ANG Zhiyuan， YANG Limei， ZHUANG Mu， ZHANG Yangyong， and Lü Honghao  （ Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences； Key Laboratory of Biological and Genetic Improvement of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture， Beijing 100081， China）  Abstract： Its important for separation offspring in transgenic Bt gene broccoli to identify positive plant lines and resistant materials accurately by different methods. In the study， five backcross materials based on four to five generations， one homozygous material as positive control and five inbred lines as negative controls were used for analysis of the insect-resistant effectiveness of Cry1Ac in transgenic broccoli from the levels of gene， protein and appearance. The gene of Cry1Ac was carried out by PCR amplification， protein was carried out by determination of Bt-Cry1Ab/1Ac test strip， and appearance was carried out by feeding test of diamondback moth in vitro. At the same time， the advantages of three Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， Lü Honghao. Study on identification methods in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 98                                                                         Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 97 108. methods were evaluated and stated. The result showed that a total of 82， 77 and 75 positive strains were divided from 159 strains of five backcross materials. According to chi-square test at the level of 5%， the positive and none positive strains of 1 1 were calculated and in accordance with mendelian inheritance. By comparisons of three methods， we found that the feeding trial of diamondback moth in vitro was accurate and reliable， but the experimental conditions must to be well controlled. The Bt-Cry1Ab/1Ac test strip was sensitive， fast and can observe the actual Bt protein expression， but it must control human errors. The normal PCR amplification could be used to identify the positive strains， but it can not reflect the actual anti-insect effect， so it needs to be together with the test of feeding diamondback moth or the test of Bt protein， which could provide an accurate result. Keywords： broccoli； transgene； Cry1Ac； diamondback moth； heridity  青花菜（ Brassica oleracea var. italica）的害蟲主要是小菜蛾（ Plutella xylostella L.）和菜粉蝶（ Pieris rapae L.）。轉(zhuǎn) Bt 基因作物作為現(xiàn)代技術(shù)的一種產(chǎn)物，兼顧殺蟲效果和減少環(huán)境污染，廣泛受到重視和普遍應(yīng)用。 1987 年，第 1 個(gè)轉(zhuǎn) Bt 基因煙草出現(xiàn)以后， Bt 基因相繼被轉(zhuǎn)入其它作物中（ Barton， 1995）。 2013 年，全球轉(zhuǎn) Bt 作物種植面積在 7 000 萬 hm2以上，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的26%，中國(guó)棉花種植中 90%以上為 Bt 抗蟲棉，種植面積為 420 萬 hm2（李晨和劉博林， 2015）。  目前使用的主要有蘇云金芽孢桿菌（ Bt）基因、蛋白酶抑制劑基因、外源凝集素基因，其中 Bt基因（ Cry1Ab/Ac、 Cry2A、 Cry3A、 Cry1C、 Cry1Ia8、 Cry1Ba3、 cry9C/Bar 等）是應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因，現(xiàn)已在棉花、水稻、大豆和玉米等大田作物育種上成功應(yīng)用（ Shah et al.， 2017； Wang et al.，2017）。 Cry1Ac 是轉(zhuǎn) Bt 基因作物中應(yīng)用最廣泛的基因，在玉米、水稻、棉花、大豆、茄子、番茄和白楊等作物中成功轉(zhuǎn)育，在部分國(guó)家已獲得商業(yè)化許可（ James， 2008）。  Bt 基因即蘇云金芽胞桿菌（ Bacillus thuringiensis， Bt）基因，該基因的表達(dá)能夠使得植物體內(nèi)生成一種毒蛋白內(nèi)毒素，為 130 160 kD 的多肽（ Liu et al.， 2016），對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲有殺傷作用，具有高效、安全等優(yōu)點(diǎn)。其殺蟲原理為當(dāng)害蟲吞食轉(zhuǎn) Bt 基因的植物后，在伴孢晶體內(nèi)以原毒素形式存在的毒蛋白，在體外堿性條件下或在害蟲腸道內(nèi)被水解成 55 75 kD 或更小的多肽，這些多肽能夠與昆蟲體內(nèi)中腸上緣刷狀細(xì)胞上的特異受體位點(diǎn)結(jié)合，破壞上皮細(xì)胞滲透壓平衡，造成細(xì)胞裂解，最終殺死害蟲（ Sayyed et al.， 2000）。  外源基因能夠在轉(zhuǎn)基因作物中高頻整合、穩(wěn)定遺傳和高效表達(dá)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)運(yùn)用的關(guān)鍵。外源基因在宿主內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)片段丟失、重排和異常重組等現(xiàn)象（ Guo et al.， 2001）。但多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物證實(shí) Bt 基因在宿主內(nèi)符合孟德爾遺傳規(guī)律。 Cooley 等（ 1995）證實(shí)了外源基因可以整合到宿主基因組兩個(gè)不同位點(diǎn)上，作為兩個(gè)不連鎖的顯性基因，在轉(zhuǎn)基因單株自交后代中表現(xiàn)出 15 l 的孟德爾遺傳規(guī)律（ Cooley et al.， 1995）。 Wang 等（ 2002）通過轉(zhuǎn) Bt 基因水稻分析了其在回交后代和 F2代中的分離比，發(fā)現(xiàn)回交群體符合 1 1 的分離比， F2符合 3 1 的分離比，證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株后代同樣符合孟德爾方式遺傳（ Wang et al.， 2002）。 Fabrick 和 Tabashnik（ 2012）和 Campagne 等（ 2017）通過多年觀察，表明轉(zhuǎn) Bt 基因作物能夠穩(wěn)定遺傳，保持抗蟲性，轉(zhuǎn) Bt 基因的遺傳規(guī)律在甘藍(lán)、辣椒和玉米等作物上也得到了證實(shí)（ Jin et al.， 2001； Dutta et al.， 2012； Chen et al.， 2016； Guo et al.，2016）。  轉(zhuǎn) Bt 基因后代材料在利用過程中往往存在分離現(xiàn)象，因其多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律，所以在材料創(chuàng)新過程中往往存在回交轉(zhuǎn)育和分離的問題，而準(zhǔn)確鑒定分離單株是否帶有 Bt 基因和具有穩(wěn)定的李占省，張黎黎，張小麗，舒金帥，蘇彥賓，孫繼峰，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊  木，張揚(yáng)勇，呂紅豪 . 轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代鑒定方法研究 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 97 108.                                                                                       99 殺蟲效果就成了問題的關(guān)鍵。本試驗(yàn)中以青花菜 5 份回交分離材料分離后代為研究對(duì)象，從基因、蛋白和表觀水平上對(duì) PCR 擴(kuò)增， Bt 毒蛋白表達(dá)量和小菜蛾離體飼蟲試驗(yàn) 3 種方法進(jìn)行了抗蟲效果比較，闡明了各方法的準(zhǔn)確性和優(yōu)缺點(diǎn)，為有效篩選轉(zhuǎn) Bt 基因分離單株提供依據(jù)和方法，保證回交后代和新品種選育后的植株抗蟲效果。  1  材料與方法  1.1  試驗(yàn)材料  試驗(yàn)于 2016 年 8 月 2017 年 2 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。青花菜回交材料 5份（ B801 B805），是分別由 5 份自交 14 代以上純合自交系 B1 B5 先與轉(zhuǎn) Bt Cry1Ac 純合系 B800雜交獲得 F1代， F1材料再分別與 5 份純合自交系材料（父本）連續(xù)回交獲得的回交 4 5 代材料（表1），均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育。轉(zhuǎn) Bt 原始親本為轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜純合材料，為陽性對(duì)照，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李漢霞老師惠贈(zèng)； B1 B5 為純合自交系材料（回交父本），為陰性對(duì)照，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育。  所有材料于 2016 年 8 月中旬定植于溫室內(nèi)，每份材料設(shè)置 3 次重復(fù)，每重復(fù)種植 12 株，行間距為 40 cm × 50 cm。 2016 年 10 月初花球成熟時(shí)對(duì)試驗(yàn)材料的葉片進(jìn)行取樣提取 DNA、 PCR 擴(kuò)增、Bt 蛋白鑒定和小菜蛾離體飼蟲試驗(yàn)。  小菜蛾由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所植保室昆蟲組惠贈(zèng)。  1.2  飼蟲試驗(yàn)鑒定  利用葉片采集器采集葉片，每重復(fù)采樣 10 11 株，放置于直徑為 6 cm 的培養(yǎng)皿中進(jìn)行抗蟲性鑒定：每片葉接種 10 頭 2 齡小菜蛾，培養(yǎng)皿內(nèi)放置濾紙，并滴入少量蒸餾水保持濕度，用封口膜封口，置于（ 25 ± 1）  光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，光照 /黑暗為 16 h/8 h，相對(duì)濕度為 65%。分別在 1、3 和 5 d 后調(diào)查小菜蛾生長(zhǎng)情況和葉片損傷程度（李漢霞  等， 2010）。  死亡率（ %） = 死亡數(shù) /（死亡數(shù)  + 活蟲數(shù)） × 100；校正死亡率（ %） =（處理死亡率對(duì)照死亡率） /（ 1對(duì)照死亡率） × 100；化蛹率（ %） = 化蛹數(shù) /（化蛹數(shù)  + 活蟲數(shù)） × 100。當(dāng)對(duì)照組死亡率超過 20%時(shí)視為無效，需再次進(jìn)行測(cè)定。  葉片損傷程度分為 4 級(jí)。 0 級(jí)：葉面積幾乎無損傷； 1 級(jí)：約 1/4 葉面積損傷； 3 級(jí)： 1/4 1/2葉面積損傷； 5 級(jí)： 1/2 3/4 葉面積損傷； 7 級(jí)：大于 3/4 葉面積損傷。  蟲態(tài)分為以下幾種健碩：發(fā)育正常，運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)；活潑：發(fā)育正常，能夠正常運(yùn)動(dòng)；慵懶：發(fā)育延緩，不愛運(yùn)動(dòng)；萎靡：發(fā)育受阻，幾乎不運(yùn)動(dòng)；死亡：身體發(fā)黑或變色，無生命。  1.3  Bt 基因鑒定  青花菜成株期后，采用 CTAB 法提取幼嫩葉片基因組 DNA（李占省  等， 2012）。  Bt 基因擴(kuò)增引物采用李漢霞等（ 2010）報(bào)道的雙向引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），Cry1Ac-FW：（ 5 3） ATGGACAACAACCCAAACAT； Cry1Ac-RW：（ 5 3） TAAACTCGGGCCCG CTGAAT。  反應(yīng)體系（ 20 L）： Taq 2X Master Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司） 10 L，正向引物（ 10 mol · L-1） 0.5 L，反向引物（ 10 mol · L-1） 0.5 L， DNA 模板（ 60 ng） 1 L，雙蒸水 8 L。  Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， Lü Honghao. Study on identification methods in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 100                                                                         Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 97 108. PCR 擴(kuò)增條件： 95 預(yù)變性 5 min；循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為 95  30 s， 72  45 s； 72  45 s， 35個(gè)循環(huán)； 72 延伸 10 min， 4 終止。  PCR 擴(kuò)增結(jié)果采用 1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳儀（北京六一生物科技有限公司）恒定電壓為 120 V，電泳時(shí)間 25 min 后，伯樂凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) Bio-Rad）采集和編輯圖片。  1.4  Bt 毒蛋白鑒定  采用 Bt-Cry1Ab/1Ac 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條鑒定 Bt 毒蛋白美德華生（北京）檢測(cè)技術(shù)有限公司。在飼蟲試驗(yàn)取樣單株上采集葉片，用打孔器采集，大小為 0.5 cm2圓片，放入 1.1 mL 8 聯(lián)排管中（ Simport，加拿大），最后放入 96 孔板中，加入用酒精清洗過的鋼珠（直徑 0.4 cm） 2 粒，加入適量提取液（試劑盒配帶） 0.5 mL，打樣機(jī)震蕩 30 s，按照要求將試紙條放入勻漿中，液體高度不超過指示線， 1 min 左右可查看結(jié)果，雙帶（質(zhì)控線和檢測(cè)線）為 Bt 毒蛋白陽性株，只有一條帶（質(zhì)控線）為非陽性株。  1.5  數(shù)據(jù)處理  采用 Excel 2003 進(jìn)行基本數(shù)據(jù)處理，方差分析和卡方檢驗(yàn)采用 SPSS 10.0 軟件，試驗(yàn)結(jié)果為平均值  ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（ mean ± SD， n = 3）， one-way ANOVA 用于顯著性檢驗(yàn)，多重比較采用 Duncans 新復(fù)極差法分析（ P < 0.05）。  2  結(jié)果與分析  2.1  轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代的基因 PCR 鑒定  經(jīng) PCR 擴(kuò)增， Cry1Ac 陽性株可擴(kuò)增出 1 200 bp 的片段（圖 1）。轉(zhuǎn) Bt 青花菜原始親本（陽性對(duì)照）后代遺傳率達(dá)到了 100%，表明該基因能夠穩(wěn)定遺傳。 5 份轉(zhuǎn) Bt 基因（ Cry1Ac）青花菜材料在回交轉(zhuǎn)育后代中陽性株所占比例為 46.8% 56.2%（表 1），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，陽性株和非陽性株分離比不顯著，符合孟德爾 1 1 的遺傳分離規(guī)律。  表 1  轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代和對(duì)照 PCR 鑒定結(jié)果  Table 1  The PCR results of gene Cry1Ac in the backcross offspring and the control lines of broccoli 品系  Strain 總株數(shù)  Total plant 陽性株  Positive plant 陽性株比例 /% Proportion of positive plant 卡方檢驗(yàn)（ 2）  Chi-squared test P 值  P value 顯著性  Significance B800 Cry1Ac 32 32 100 7.02 0.008 * B1 32 0 0 8.51 0.003 B2 8. 0.003 * B3 32 0 0 8.51 0.003 B4 8. 0.003 * B5 32 0 0 8.51 0.003 B801 （ B1× Bt Cry1Ac） × B1 32 17 53.1 0.04 0.832  B802（ B2× Bt Cry1Ac） × B2 32 17 53.1 0.04 0.832  B803 （ B3× Bt Cry1Ac） × B3 31 15 48.4 0.02 0.896  B804 （ B4× Bt Cry1Ac） × B4 32 15 46.8 0.02 0.896  B805 （ B5× Bt Cry1Ac） × B5 32 18 56.2 0.15 0.702  注： B1 B5 為純合自交系， *代表極顯著差異（ P < 0.01）。  Note： B1 to B5 represented inbred lines， and * showed extreme significance at the level of 1%. 李占省，張黎黎，張小麗，舒金帥，蘇彥賓，孫繼峰，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊  木，張揚(yáng)勇，呂紅豪 . 轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代鑒定方法研究 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 97 108.                                                                                       101 圖 1  轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜原始親本 B800 和與 B1 回交后代（ B801）單株 PCR 擴(kuò)增結(jié)果  B800 為陽性對(duì)照 Bt 原始親本； B1 為陰性對(duì)照。  Fig. 1  The PCR result of transgenic broccoli（ Cry1Ac） of initial parent B800 and backcross generation B801 B800 was the positive control standing for the initial Bt parent； B1 was the negative control. 2.2  轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代對(duì)小菜蛾的離體抗性鑒定  調(diào)查顯示， 5 份轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交材料在轉(zhuǎn)育后代中均出現(xiàn)了分離，轉(zhuǎn) Bt 材料和對(duì)照材料喂食小菜蛾結(jié)果呈現(xiàn)出顯著的差異，陽性株抗蟲效果明顯優(yōu)于對(duì)照（圖 2）。  圖 2  轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交材料 B801、 B802 和 B803 陽性株與相應(yīng)對(duì)照材料 B1、 B2 和 B3 在小菜蛾離體飼喂 5 d 時(shí)的表現(xiàn)  Fig. 2  The performance of feeding test of diamondback moth in vitro happened to transgenic broccoli of backcross generation B801，B802 and B803 and corresponding control of inbred lines B1， B2 and B3 after 5 days 從表 2 可以看出，轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜喂食 1 d 后的小菜蛾多數(shù)發(fā)育遲緩或未發(fā)育（保持 2 齡幼蟲體態(tài)），葉片未受損傷或損傷極少；陰性對(duì)照喂食的材料則發(fā)育正常，已經(jīng)生長(zhǎng)至 3 齡，葉片受損明顯，達(dá)到了 1 級(jí)。 3 d 時(shí)，轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜喂食后的小菜蛾表現(xiàn)毒害反應(yīng)，多數(shù)死亡，而對(duì)照則發(fā)Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， Lü Honghao. Study on identification methods in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 102                                                                         Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 97 108. 育正常，已成為 3 4 齡幼蟲，葉片受損達(dá)到了 3 級(jí)。 5 d 時(shí)，轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜喂食后小菜蛾全部死亡，葉片輕微受損或無損傷，而陰性對(duì)照則生長(zhǎng)為 4 齡以上幼蟲或化蛹，葉片受損嚴(yán)重，達(dá)到了5 7 級(jí)。  表 2  各青花菜材料小菜蛾離體飼蟲試驗(yàn)表現(xiàn) Table 2  The performance of all broccoli materials in feeding test of diamondback moth in vitro 飼蟲 / d Feeding  days 品系  Strain 葉片損傷程度  Damage of leaves 校正死亡率 /% Corrected  mortality 蟲態(tài)  Insect status 蟲齡  Insect size 化蛹率 /% Pupation  rate 1 B800 Cry1Ac 0 ± 0 b 0 ± 0 a 活潑或慵懶  Living or languid 2 ± 0 b 0 ± 0 a B1 1 ± 0 a 0 ± 0 a 活潑或健碩  Living or strong 3 ± 0 a 0 ± 0 a B2 1 ± 0 a 0 ± 0 a 活潑或健碩  Living or strong 3 ± 0 a 0 ± 0 a B3 1 ± 0 a 0 ± 0 a 活潑或健碩  Living or strong 3 ± 0 a 0 ± 0 a B4 1 ± 0 a 0 ± 0 a 活潑或健碩  Living or strong 3 ± 0 a 0 ± 0 a B5 1 ± 0 a 0 ± 0 a 活潑或健碩  Living or strong 3 ± 0 a 0 ± 0 a B801（ B1× Bt ry1Ac） × B1 0 ± 0 b 0 ± 0 a 活潑或慵懶  Living or languid 2 ± 0 b 0 ± 0 a B802（ B2× Bt ry1Ac） × B2 0 ± 0 b 0 ± 0 a 活潑  Living 2 ± 0 b 0 ± 0 a B803（ B3× Bt ry1Ac） × B3 0 ± 0 b 0 ± 0 a 慵懶  Languid 2 ± 0 b 0 ± 0 a B804（ B4× Bt ry1Ac） × B4 0 ± 0 b 0 ± 0 a 活潑  Living 2 ± 0 b 0 ± 0 a B805（ B5× Bt ry1Ac） × B5 0 ± 0 b 0 ± 0 a 活潑或慵懶  Living or languid 2 ± 0 b 0 ± 0 a 3  B800 Cry1Ac 0 ± 0 c 100 ± 0 a 死亡  Death 2 ± 0 c 0 ± 0 a B1 3 ± 0 a 0 ± 0 d 活潑或健碩  Living or strong 3.3 ± 0.6 b 0 ± 0 a B2 3 ± 0 a 0 ± 0 d 活潑或健碩  Living or strong 3.7 ± 0.6 a 0 ± 0 a B3 3 ± 0 a 0 ± 0 d 活潑或健碩  Living or strong 3.7 ± 0.6 a 0 ± 0 a B4 3 ± 0 a 0 ± 0 d 活潑或健碩  Living or strong 3.7 ± 0.6 a 0 ± 0 a B5 3 ± 0 a 0 ± 0 d 活潑或健碩  Living or strong 3.7 ± 0.6 a 0 ± 0 a B801（ B1× Bt ry1Ac） × B1 0 ± 0 c 100.0 ± 0 a 死亡 Death 2 ± 0 c 0 ± 0 a B802（ B2× Bt ry1Ac） × B2 1 ± 0 b 86.7 ± 11.5 c 死亡或萎靡  Death or weak 2 ± 0 c 0 ± 0 a B803（ B3× Bt ry1Ac） × B3 0 ± 0 c 100.0 ± 0 a 死亡  Death 2 ± 0 c 0 ± 0 a B804（ B4× Bt ry1Ac） × B4 1 ± 0 b 93.3 ± 5.8 b 死亡或萎靡  Death or weak 2 ± 0 c 0 ± 0 a B805（ B5× Bt ry1Ac） × B5 0 ± 0 c 100.0 ± 0 a 死亡 Death 2 ± 0 c 0 ± 0 a 5  B800 Cry1Ac 0.0 ± 0 e 100 ± 0 死亡 Death  2 ± 0 c 0 ± 0 d B1 5.7 ± 1.2 c 0 活潑或健碩  Living or strong 3.7 ± 0.6 b 0 ± 0 d B2 6.3 ± 1.2 b 0 活潑 Living 4.0 ± 0 a 16.7 ± 5.8 aB3 7.0 ± 0 a 0 活潑 Living 4.0 ± 0 a 13.3 ± 5.8 bB4 7.0 ± 0 a 0 活波 Living 4.0 ± 0 a 0 ± 0 d B5 6.3 ± 1.2 b 0 活潑 Living 4.0 ± 0 a 6.7 ± 5.7 cB801（ B1× Bt ry1Ac） × B1 0.0 ± 0 e 100 死亡 Death 2 ± 0 c 0 ± 0 d B802（ B2× Bt ry1Ac） × B2 0.7 ± 0.1 d 100 死亡 Death 2 ± 0 c 0 ± 0 d B803（ B3× Bt ry1Ac） × B3 0.0 ± 0 e 100 死亡 Death 2 ± 0 c 0 ± 0 d B804（ B4× Bt ry1Ac） × B4 0.7 ± 0.6 d 100 死亡 Death 2 ± 0 c 0 ± 0 d B805（ B5× Bt ry1Ac） × B5 0.0 ± 0 e 100 死亡 Death 2 ± 0 c 0 ± 0 d 注： B1 B5 為純合自交系，數(shù)值呈現(xiàn)為平均值  ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（平均  ± SD， n = 3），不同小寫字母表示各材料間的顯著性檢驗(yàn)（ P < 0.05）。  Note： B1 to B5 represented inbred lines， and the value was presented as mean ± standard error（ n = 3）， and different lowercase letters indicated the significance test of each material at the level of 5%. 李占省，張黎黎，張小麗，舒金帥，蘇彥賓，孫繼峰，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊  木，張揚(yáng)勇，呂紅豪 . 轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代鑒定方法研究 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 97 108.                                                                                       103 經(jīng)卡方檢驗(yàn)，轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代陽性株與非陽性株比例符合 1 1 孟德爾遺傳分離規(guī)律（表 3）。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（表 3）顯示，經(jīng)小菜蛾離體飼蟲試驗(yàn)鑒定轉(zhuǎn) Cry1Ac 原始親本表現(xiàn)出對(duì)小菜蛾幼蟲的抗性，陰性對(duì)照（ B1 B5）均不抗小菜蛾，轉(zhuǎn) Cry1Ac 回交材料（ B801 B805）陽性株均表現(xiàn)出抗性，陽性株所占比例為 43.7% 53.1%。  表 3  青花菜離體飼蟲試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（ 5 d）  Table 3  The statistical result of all broccoli materials in feeding test of diamondback moth in vitro after five days 品系  Strain 總株數(shù)  Total plant 陽性株  Positive plant陽性株比例 /% Proportion of positive plant卡方檢驗(yàn)（ 2）  Chi-squared test P 值  P value 顯著性  SignificanceB800 Cry1Ac 32 32 100 7.02 0.008 * B1 32 0 0 8.51 0.003 B2 8. 0.003 * B3 32 0 0 8.51 0.003 B4 8. 0.003 * B5 32 0 0 8.51 0.003 B801（ B1× Bt Cry1Ac） × B1 32 17 53.1 0.04 0.832  B802（ B2× Bt Cry1Ac） × B2 32 14 43.7 0.05 0.823  B803（ B3× Bt Cry1Ac） × B3 31 15 48.4 0.02 0.896  B804（ B4× Bt Cry1Ac） × B4 32 13 40.6 0.22 0.636  B805（ B5× Bt Cry1Ac） × B5 32 16 50.0 0 0.968  注： B1 B5 為純合自交系， *代表極顯著差異（ P < 0.01）。  Note： B1 to B5 represented inbred lines， and * showed extreme significance at the level of 1%. 2.3  轉(zhuǎn) Cry1Ac 青花菜回交后代的 Bt 毒蛋白鑒定  Bt-Cry1Ab/1Ac 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條鑒定結(jié)果表明，該方法能夠在 50 60 s 內(nèi)檢測(cè)出 Bt 毒蛋白陽性條帶（檢測(cè)線）是否出現(xiàn)（圖 3）。  圖 3  B802 材料 Bt 毒蛋白鑒定部分結(jié)果 Fig. 3  The partial result of backcross material B802 by Bt toxin protein test Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， Lü Honghao. Study on identification methods in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 104                                                                         Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 97 108. 將回交分離材料的試紙條鑒定結(jié)果（表 4）與 PCR 擴(kuò)增結(jié)果（表 1）相比， B801 和 B803 與 PCR擴(kuò)增結(jié)果一致， B802、 B804 和 B805 陽性株數(shù)量分別比 PCR 擴(kuò)增結(jié)果少 2、 2 和 1 個(gè)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，5 份回交材料 B801 B805 的分離后代 B</p>

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