基于萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā).pdf
<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 159 167. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0166； http： /www. ahs. ac. cn 159 收稿日期 ： 2017 05 15； 修回日期 ： 2017 12 11 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ 31572166） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zghhzpx163.com） 基于萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的 SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā) 張華麗1，叢日晨1，王茂良1，董愛(ài)香1，辛海波1,*，義鳴放2，郭 華3,*（1北京市園林科學(xué)研究院，綠化植物育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞園藝與園林系，北京 100193；3河南省泌陽(yáng)縣森林病蟲(chóng)害防治檢疫站，河南泌陽(yáng) 463721） 摘 要： 萬(wàn)壽菊（ Tagetes erecta L.）花蕾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得 48 953 條 Unigene，利用 MISA 軟件檢測(cè)出 20 666 個(gè) SSR 位點(diǎn)，分布于 13 849 條 Unigene 中，出現(xiàn)頻率為 28.29%，平均分布距離為 2.51 kb。優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)槿塑账?、四核苷酸，分別占總 SSR 位點(diǎn)的 50.16%和 20.94%。 ATG/ATG 和 AAAC/GTTT分別是三核苷酸、四核苷酸的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，占總 SSR 重復(fù)類型的 13.82%和 3.66%。隨機(jī)選取不同主導(dǎo)重復(fù)基元類型并合成 SSR 引物 36 對(duì)，以 20 份萬(wàn)壽菊自交系的基因組 DNA 為模板，對(duì)引物有效性和多態(tài)性進(jìn)行了驗(yàn)證， 30 對(duì)引物可以擴(kuò)增到清晰穩(wěn)定的目標(biāo)條帶，有效擴(kuò)增率為 80.56%；其中 13 對(duì)引物具有多態(tài)性，平均 He和 PIC 分別為 0.275 和 0.608。以上結(jié)果表明，萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的 Unigene 信息可作為開(kāi)發(fā) SSR 標(biāo)記的有效來(lái)源，獲得的大批量 SSR 標(biāo)記可為萬(wàn)壽菊的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供可靠的標(biāo)記選擇。 關(guān)鍵詞： 萬(wàn)壽菊； SSR；轉(zhuǎn)錄組 中圖分類號(hào)： S 682.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 01-0159-09 Development of SSR Molecular Markers Based on Transcriptome Sequencing of Tagetes erecta ZHANG Huali1， CONG Richen1， WANG Maoliang1， Dong Aixiang1， XIN Haibo1,*， YI Mingfang2，and GUO Hua3,*（1Beijing Institute of Landscape Architecture， Beijing Key Laboratory of Greening Plants Breeding， Beijing 100102，China；2Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture， China Agricultural University， Beijing 100193， China；3Biyang Forest Diseases and Insect Pests Quarantine Station in Henan Province， Biyang， Henan 463721，China） Abstract： A total of 48 953 Unigenes were obtained by transcriptome sequencing of flower buds of Tagetes erecata. MISA found 20 666 SSRs located in 13 849 unigenes with the frequency of 28.29% and a mean distance of 2.51 kb per one. Trinucleotide and tetranucleotide were major types with the percentages of 50.16% and 20.94%， respectively. ATG/ATG and AAAC/GTTT were most frequent motifs in trinucleotide and tetranucleotide repeats， accounting for 13.82% and 3.66%， respectively. Based on different dominant motifs types， 36 primers were chosen randomly and verified with 20 different inbred lines of Tagetes erecta. The results showed that 30 primers were effective with a valid rate of 80.56%， and 13 primers showed polymorphism with He and PIC mean values of 0.275 and 0.608， respectively. These Zhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 160 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. data indicated that the Unigenes generated from transcriptome sequencing can be used as an effective source to develop SSR markers， and the large quantities of SSR markers will provide reliable resources for analysis on genetic polymorphism and constructing genetic map in Tagetes erecta. Keywords： Tagetes erecta L.； SSR； transcriptome 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ Simple sequence repeat， SSR）也叫微衛(wèi)星（ Microsatellites） ，廣泛地存在于真核生物基因組。 SSR 標(biāo)記數(shù)量豐富、遍布整個(gè)基因組、多態(tài)性高，具有擴(kuò)增位點(diǎn)專一、呈共顯性和多等位性的特點(diǎn)，且操作技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)便，并且 SSR 位點(diǎn)在屬間和屬內(nèi)種間具有保守性（ Thomas & Scott， 1992） 。 SSR 技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系研究等方面。 萬(wàn)壽菊（ Tagetes erecta L.）為菊科萬(wàn)壽菊屬植物，種內(nèi)具有豐富的多樣性，株高、頭狀花序的花形、花色等都有豐富的類型；萬(wàn)壽菊不僅可以用于園林綠化，還可以提取色素，吸收土壤中的重金屬鎘，提取殺蟲(chóng)劑等。截至目前，僅見(jiàn)菊花的 EST-SSR 標(biāo)記在萬(wàn)壽菊上的可轉(zhuǎn)移性研究（張華麗 等， 2016）。本研究中基于前期工作中對(duì)萬(wàn)壽菊花蕾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā) SSR 標(biāo)記，為萬(wàn)壽菊種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 本試驗(yàn)于 2014 年 12 月至 2016 年 6 月在北京市園林科學(xué)研究院進(jìn)行。 1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源 萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于北京市園林科學(xué)研究院萬(wàn)壽菊課題組 2014 年 12 月對(duì)萬(wàn)壽菊雄性不育系 S-121 花蕾進(jìn)行 Illumina 高通量深度測(cè)序。測(cè)序取 3 個(gè)發(fā)育時(shí)期的花蕾： （ 1）現(xiàn)蕾前，取可見(jiàn)花蕾之前的莖分生組織； （ 2）花序發(fā)育期，取直徑 1.5 mm 的花蕾； （ 3）花器官分化期，取直徑 2 3 mm 的花蕾。委托廣州市銳博生物科技有限公司進(jìn)行 RNA-seq 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并通過(guò) De novo 方法組裝得到 Unigene，作為背景數(shù)據(jù)。 1.2 植物材料及其 DNA 提取 植物材料為本課題組收集和選育的 20 個(gè)表型性狀各異的萬(wàn)壽菊自交系（表 1） ?；ㄉ捎糜?guó)皇家園藝學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)比色卡測(cè)定。 基因組 DNA 提取采用天根生物公司植物基因組提取試劑盒（ DP320） ，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 1.3 轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點(diǎn)鑒別及 SSR 引物設(shè)計(jì) 采用 MISA 程序查找 SSR 位點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)為：二核苷酸（ Dinucleotide） 、三核苷酸（ Trinucleotide） 、四核苷酸（ Tetranucleotide） 、五核苷酸（ Pentanucleotide）和六核苷酸（ Hexanucleotide）的重復(fù)次數(shù)分別 7、 5、 4、 4 和 4。 采用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，標(biāo)準(zhǔn)為：引物長(zhǎng)度 18 24 bp， GC 含量 40% 60%，理論退火溫度（ Tm） 55.0 65.0 ，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度在 150 300 bp 之間。 張華麗，叢日晨，王茂良，董愛(ài)香，辛海波，義鳴放，郭 華 . 基于萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的 SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā) . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 159 167. 161 表 1 萬(wàn)壽菊自交系信息 Table 1 Information of marigold（ Tagetes erecta L.） inbred lines 編號(hào) No. 來(lái)源 Locality 株高 / cm Height 冠幅 / cm Crown cover 花色（ RHSCC） Flower color 花徑 / cm Flower diameter 播種到開(kāi)花天數(shù) / d Days from sowing to flowering 1 赤峰 Chifeng 35 40 桔紅 Tangerine（ 23A） 6.0 100 2 赤峰 Chifeng 35 50 桔黃 Orange（ 17A） 6.0 85 3 赤峰 Chifeng 35 35 黃 Yellow（ 7A） 7.0 85 4 赤峰 Chifeng 35 35 黃 Yellow（ 6A） 5.5 95 5 赤峰 Chifeng 30 35 黃 Yellow（ 6A） 3.0 80 6 赤峰 Chifeng 45 45 黃 Yellow（ 6A） 6.0 69 7 赤峰 Chifeng 36 38 黃 Yellow（ 5A） 6.5 82 8 自育 Independent 35 40 黃 Yellow（ 5A） 6.5 82 9 自育 Independent 38 46 金黃 golden（ 9A） 6.5 82 10 自育 Independent 35 40 金黃 golden（ 9A） 6.5 74 11 自育 Independent 40 45 金黃 golden（ 9A） 7.0 82 12 自育 Independent 38 42 黃 Yellow（ 5A） 7.0 82 13 自育 Independent 50 45 金黃 golden（ 7A） 6.5 82 14 自育 Independent 28 36 桔黃 Orange（ 17A） 2.0 74 15 越南 Vietnam 69 66 黃 Yellow（ 5C） 6.0 116 16 越南 Vietnam 66 桔紅 Tangerine（ N25B） 6.0 116 17 赤峰 Chifeng 55 58 桔紅 Tangerine（ N25C） 8.0 87 18 赤峰 Chifeng 120 45 桔紅 Tangerine（ N25B） 8.0 92 19 赤峰 Chifeng 24 31 白色 White（ 2D） 5.0 110 20 北京花仙子園藝公司 Beijing Huaxianzi Gardening Co. LTD 45 40 桔紅 Tangerine（ 21A） 7.0 95 1.4 EST-SSR 引物篩選及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 隨機(jī)選取 36 對(duì) EST-SSR 引物，以 20 份萬(wàn)壽菊自交系材料為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR 采用 10 L 反應(yīng)體系，包括 4.1 L 雙蒸滅菌 H2O， 5 L 2 × Taq PCR MasterMix（天根生化） ， 20 mol L-1的上、下游引物各 0.2 L， DNA 模板 0.5 L。 PCR 反應(yīng)采用 Biometra Gradient（德國(guó)） ，反應(yīng)條件為： 94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 s，合適的退火溫度下退火 30 s， 72 延伸 45 s， 35 個(gè)循環(huán)；72 延伸 5 min。各引物對(duì)的最適退火溫度通過(guò)梯度 PCR 試驗(yàn)確定。 用 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠， 150 V 電壓條件下電泳 55 min，對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。電泳后參照 Bassam 等（ 1991）的方法進(jìn)行銀染顯色，用 Canon IXUS 相機(jī)拍照記錄。 （ 1） SSR 出現(xiàn)頻率 fc（ %） = c/n × 100， c 為搜索到的 SSR 數(shù)量， n 為無(wú)冗余 EST 數(shù)量；（ 2）SSR 平均分布距離 fN = N/c， N 為無(wú)冗余 EST 數(shù)量的總堿基數(shù)。采用 Popgene 軟件計(jì)算各 SSR 位點(diǎn)平均等位基因數(shù)、預(yù)期雜合度和理論雜合度；多態(tài)信息含量 計(jì)算，其中， Pi為第 i 個(gè)基因出現(xiàn)的頻率， n 為等位基因數(shù)。 2 結(jié)果與分析 2.1 轉(zhuǎn)錄組中 SSR 的分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 通過(guò)對(duì)萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組的 48 953 條 Unigene（序列總長(zhǎng)約 51 818 161 kb）序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)其中 20 666 條 Unigene 序列中含有 13 849 個(gè) SSR 位點(diǎn)， 其中 4 299 條 Unigene 含有 1 個(gè)以上 EST-SSRZhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 162 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. 位點(diǎn)。 SSR 發(fā)生頻率為 28.29%，平均每 2.51 kb 存在 1 個(gè) SSR 位點(diǎn)。 萬(wàn)壽菊花蕾轉(zhuǎn)錄組序列中的 SSR 類型較豐富，二核苷酸至六核苷酸總共 45 個(gè)重復(fù)類型。其中三核苷酸和四核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢(shì)，分別占總 SSR 的 50.16%和 20.94%；二核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的 9.29%、 9.57%和 10.04%（表 2） 。所有 SSR 中，以4 次重復(fù)的 SSR 最多， 占 37.83%， 3 次重復(fù)的占 32.10%， 5 次和 6 次重復(fù)的分別占 12.06%和 10.27%（表 2） 。 萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組 SSR 重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在 3 27 次之間，其中 3 10 次重復(fù)的 SSR 位點(diǎn)有 20 593 個(gè)，占總個(gè)數(shù)的 99.65%； 11 20 次重復(fù)的有 72 個(gè)，占 0.35%； 20 次重復(fù)以上的有 1 個(gè)。 表 2 萬(wàn)壽菊 EST-SSR 基元及其重復(fù)數(shù)量的變異分析 Table 2 Analyses on repeat motif and its number variation in EST-SSR of Tagetes erecta L. 重復(fù)基元長(zhǎng)度 Repeat motif length 重復(fù)次數(shù) Repeat number 總數(shù) In total 比例 / % Percentage 3 4 5 6 7 8 9 10 > 10 二核苷酸 Dinucleotide 855 501 272 148 81 64 1 921 9.29 三核苷酸 Trinucleotide 6 385 2 249 1 218 486 25 3 10 366 50.16 四核苷酸 Tetranucleotide 3 439 658 186 40 0 3 2 4 328 20.94 五核苷酸 Pentanucleotide 1 469 464 38 1 3 2 1 977 9.57 六核苷酸 Hexanucleotide 1 726 310 19 8 3 4 4 2 074 10.04 總數(shù) In total 6 634 7 817 2 492 2 122 993 306 148 81 73 20 666 100.00 百分比 /% Percentage 32.10 37.83 12.06 10.27 4.80 1.48 0.72 0.39 0.35 2.2 轉(zhuǎn)錄組 SSR 基序重復(fù)類型和頻率特征 由表 3 可知，二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸的重復(fù)基序類型總計(jì) 14 694 個(gè)，占 SSR 位點(diǎn)總數(shù)的 71.10%，二核苷酸的重復(fù)次數(shù)集中在 6 次以上，三核苷酸重復(fù)次數(shù)集中在 4 7 次之間，重復(fù) 8 次較少；四核苷酸重復(fù)次數(shù)集中在 3 4 次之間，沒(méi)有出現(xiàn) 7 次重復(fù)，重復(fù) 8 次極少。 從萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組 SSR 核苷酸基序類型來(lái)看，其 20 666 個(gè) SSR 位點(diǎn)包含 370 種重復(fù)基元，二核苷酸至六核苷酸，重復(fù)分別有 3、 10、 32、 86 和 239 種。 從分布頻率來(lái)看（表 3），二核苷酸中出現(xiàn)最多 的重復(fù)基元是 AG/CT（ 864 個(gè)，占 4.18%） ，占二核苷酸重復(fù)總數(shù)的 44.98%。 三核苷酸中 出現(xiàn)最多的重復(fù)基元是 ATC/ATG（ 2 857 個(gè)，占 13.82%），占三核苷酸總數(shù)的27.56%，其次是 AAG/CTT（ 1 960 個(gè)，占 9.48%）、 ACC/GGT（ 1 926 個(gè)，占 9.32%）和 AAC/GTT（ 1 486 個(gè)， 7.19%） ，這 4 種基元占三核苷酸重復(fù)總數(shù)的 79.39%，在三核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率最小的是 CCG/CGG（ 89 個(gè)， 0.43%） （表 3）。 在四核苷酸重復(fù)基元中，以 AAAC/GTTT、 AAAG/CTTT、 AATC/ATTG 和 ACAT/ATGT 為主（表 3），分別占四核苷酸總數(shù)的 17.47%、 11.62%、 10.37%和 10.19%。 五核苷酸中以 AAAAC/GTTTT 和 AACAC/GTGTT 出現(xiàn)頻率最高，分別占其總數(shù)的 8.19%和8.14%； 六核苷酸中出現(xiàn)頻率最高的是 AAGATG/ATCTTC 和 AAACAC/GTGTTT，分別占其總數(shù)的7.18%和 4.15%。 張華麗，叢日晨，王茂良，董愛(ài)香，辛海波，義鳴放，郭 華 . 基于萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的 SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā) . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 159 167. 163 表 3 萬(wàn)壽菊 EST-SSR 中二、三、四堿基重復(fù)基元的類型及頻率 Table 3 Dinucleotide,trinucleotide and tetranucleotide EST-SSR repeat motifs and their frequency in ESTs of Tagetes erecta L. 重復(fù)基元類型 Repeat motif type 重復(fù)次數(shù) Repeat number 總計(jì) Total 頻率 /% Frequency 3 4 5 6 7 8 > 8 AC/GT 318 198 91 42 697 3.37 AG/CT 343 215 130 90 864 4.18 AT/AT 194 88 51 176 360 1.74 AAC/GT 907 344 168 62 5 1 486 7.19 AAG/CTT 1 214 417 218 108 2 1 1 960 9.48 AAT/ATT 374 166 106 24 4 2 676 3.27 ACC/GGT 1 201 417 223 81 4 1 926 9.32 ACG/CGT 94 21 7 1 123 0.60 ACT/AG 66 29 20 4 119 0.58 AGC/CTG 514 181 100 30 5 830 4.02 AGG/CCT 214 49 28 7 2 300 1.45 ATC/ATG 1 735 608 343 168 3 2 857 13.82 CCG/CGG 66 17 5 1 89 0.43 AAAC/GTTT 620 99 28 9 756 3.66 AAAG/CTTT 392 79 27 4 1 503 2.43 AAAT/ATTT 292 35 7 4 338 1.64 AACC/GGTT 124 19 4 1 1 149 0.72 AACG/CGTT 22 1 23 0.11 AACT/AGTT 43 11 7 61 0.30 AAGC/CTTG 80 19 5 1 1 106 0.51 AAGG/CCTT 67 12 79 0.38 AAGT/ACTT 19 9 4 2 34 0.16 AATC/ATTG 350 75 18 6 449 2.17 AATG/ATTC 243 50 13 3 309 1.50 AATT/AATT 113 14 127 0.61 ACAG/CTGT 29 7 1 37 0.18 ACAT/ATGT 298 90 48 5 441 2.13 ACCC/GGGT 48 5 1 54 0.26 ACCG/CGGT 13 13 0.06 ACCT/AGGT 25 7 32 0.15 ACGC/CGTG 5 5 0.02 ACGT/ACGT 29 12 41 0.20 ACTC/AGTG 90 13 6 3 112 0.54 ACTG/AGTC 20 4 2 26 0.13 AGAT/ATCT 101 18 6 1 126 0.61 AGCC/CTGG 16 3 19 0.09 AGCG/CGCT 13 2 1 16 0.08 AGCT/AGCT 93 20 5 118 0.57 AGGC/CCTG 27 18 1 46 0.22 AGGG/CCCT 48 2 50 0.24 ATCC/ATGG 76 11 2 89 0.43 ATCG/ATCG 77 13 90 0.44 ATGC/ATGC 46 10 2 58 0.28 CCCG/CGGG 8 1 9 0.04 CCGG/CCGG 12 12 0.06 總計(jì) Total 3 439 7 043 2 435 1 258 486 28 5 14 694 71.10 頻率 /% Frequency 16.64 34.08 11.78 6.09 2.35 0.14 0.02 71.10 Zhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 164 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. 2.3 萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組 SSR 引物的有效性和多態(tài)性檢測(cè) 為了驗(yàn)證引物的有效性，隨機(jī)挑選 36 對(duì) EST-SSR 引物（包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重復(fù)基元的 SSR 位點(diǎn)，重復(fù)次數(shù)在 5 9 次），以 20 個(gè)性狀不同的萬(wàn)壽菊自交系基因組 DNA 為模板進(jìn)行了 PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，其中編號(hào)為 5、 12、 26、 28、 30 和 35 的 6 條引物為無(wú)效引物；其余 30 對(duì)引物均可以擴(kuò)增到預(yù)期產(chǎn)物。 通過(guò) 30 對(duì)有效引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析表明， 13 對(duì)引物呈現(xiàn)出多態(tài)性（圖 1，表 4） ，占有效引物的 43.33%。 圖 1 多態(tài)性標(biāo)記在 20 個(gè)萬(wàn)壽菊自交系材料中的擴(kuò)增情況 Fig. 1 Amplification of polymorphic markers using 20 marigold varieties as templates 表 4 13 對(duì)萬(wàn)壽菊多態(tài)性 SSR 引物信息 Table 4 Information of 13 pairs of polymorphic primers developed from T. erecta L. 編號(hào) No. 重復(fù)基元 Motifs 引物序列（ 5 3） Primer sequence 退火溫度 / Annealing temperature GC 含量 /% GC content 產(chǎn)物預(yù)期大小 /bp Expected size 2 （ TCTC）5F： CCATACACACATCAGCAGAC 52 50 203 R： GAGCAGGTGATTGTGTGTGT 52 50 3 （ AAT）6F： GGAGCATAGGGTATCTGCTT 52 50 177 R： CGAAGCCTCCTCTTCAGATA 52 50 4 （ TTGT）6F： CACAAGAATGCTATCGCCAC 52 50 157 R： ATTGGCTAAAGCACAGACCG 52 50 6 （ GTAGG）5F： TCCATGGGCATACAAGGTGT 52 50 231 R： ACGACCTGCGAAGCATATTC 52 50 7 （ CACACG）7F： ATGCTCTCGATGGTGCCTTT 52 50 213 R： GACCAACTAATAGCTCTGTG 50 45 8 （ TGA）5， （ CAT）5F： CATCATCACCATTGGTCCTG 52 50 234 R： CCGCCTTATCTCGGAATGTA 52 50 10 （ TCC）5， （ GCT）5， （ TA）7F： TGAAGATGGTGAGGAAGAAG R： CAATTGCTAGCTAGATCCAC 50 50 45 45 279 張華麗，叢日晨，王茂良，董愛(ài)香，辛海波，義鳴放，郭 華 . 基于萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的 SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā) . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (1)： 159 167. 165 續(xù)表 4 編號(hào) No. 重復(fù)基元 Motifs 引物序列（ 5 3） Primer sequence 退火溫度 / Annealing temperature GC 含量 /% GC content 產(chǎn)物預(yù)期大小 /bp Expected size 15 （ GA）8F： AAAGAACCAAGAGGGAGGCT 52 50 111 R： TCTAGTCCATACATCCCATC 50 45 18 （ CA）7： TCGTCGGTTGCTTGGATTTG 52 50 188 R： GAGTATGATTCAAAGCCACC 50 45 21 （ AT）6F： CACACGGTAACAATCCCTAG 52 50 201 R： GCTGAGGATTGTCTGATAAC 50 45 29 （ GTTTA）7F： TCATCCCATGATTTAGGCTC 50 45 242 R： CCAGAACCAGAAGAGAAGCA 52 50 33 （ GATGTA）6F： TGCTGGAACAGGTGAATCAC 52 50 242 R： CTTCTTCAAGCTCGCTTGCA 52 50 36 （ CCATCT）5F： GTAAGTGCACCATCACCATC 52 50 224 R： GAGTTTTGAGATGGAGGAGG 52 50 2.4 多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)多樣性分析 使用 13 個(gè)多態(tài)性標(biāo)記對(duì) 20 份萬(wàn)壽菊自交系遺傳多樣分析，擴(kuò)增到 26 個(gè)等位基因；各 SSR 位點(diǎn)之間的有效等位基因數(shù)平均值為 1.477， 變化范圍為 1.051（ SSR7、 SSR8 和 SSR33） 1.980（ SSR10） ；香農(nóng)多樣性指數(shù)平均值為 0.408，變化范圍為 0.117 0.692；觀察雜合度和期望雜合度的平均值分別為 0.342 和 0.275，變化范圍分別為 0 0.900 和 0.05 0.512；各位點(diǎn)多態(tài)信息含量平均值為 0.608，變化范圍為 0.524 0.772（表 5） 。 表 5 13 對(duì)多態(tài)性引物多樣性分析 Table 5 Diversity of 13 pairs of polymorphic primers SSR 位點(diǎn) SSR locus 有效等位基因數(shù) Effective number of alleles 香農(nóng)多樣性指數(shù) Shannons diversity index 觀察雜合度 Observed heterozygosity 期望雜合度 Expected heterozygosity 多態(tài)信息含量 Polymorphism information content SSR2 1.995 0.692 0.850 0.512 0.569 SSR3 1.782 0.631 0.650 0.450 0.772 SSR4 1.923 0.673 0.800 0.492 0.580 SSR6 1.105 0.198 0.100 0.097 0.545 SSR7 1.051 0.117 0.050 0.050 0.524 SSR8 1.051 0.117 0.050 0.050 0.524 SSR10 1.980 0.688 0.900 0.508 0.697 SSR15 1.219 0.325 0.000 0.185 0.590 SSR18 1.956 0.682 0.850 0.501 0.564 SSR21 1.105 0.199 0.100 0.097 0.707 SSR29 1.105 0.198 0.000 0.097 0.569 SSR33 1.051 0.117 0.050 0.050 0.524 SSR36 1.882 0.662 0.050 0.481 0.734 平均值 Average 1.477 0.408 0.342 0.275 0.608 3 討論 菊屬植物 SSR 標(biāo)記對(duì)萬(wàn)壽菊具有通用性（張華麗 等， 2016） ，但標(biāo)記的數(shù)量和質(zhì)量遠(yuǎn)不能滿足研究需要。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成為 SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā)的重要途徑（ Dutta et al.， 2011；王麗鴛 等， 2014； Zhai et al.， 2014；李榮華 等， 2016；宗宇 等， 2016） ，但基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的萬(wàn)壽菊 SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā)仍無(wú)相關(guān)報(bào)道。 已有報(bào)道，各類植物間 EST 的 SSR 分布頻率大不相同，頻率較低的種類包括：蝴蝶蘭（ 3.19%）Zhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 166 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. （張水明 等， 2012） 、百合（ 5.98%） （楊素麗 等， 2008） 、砂梨（ 7.2%） （ Yue et al.， 2014） 、鷹嘴豆 （ 7.6%） （ Dutta et al.， 2011） 和辣椒 （ 7.83%） （劉峰 等， 2012） ； 頻率較高的種類有： 刺梨 （ 20.37%）（鄢秀芹 等， 2015） 、柑橘（ 21.74%） （ Jiang et al.， 2006）和蘿卜（ 23.79%） （ Wang et al.， 2012） ；處于中等頻率的有：紅掌（ 12.17%） （郁永明 等， 2015） 、蠟梅（ 12.35%） （李響 等， 2013） 、茶樹(shù)（ 14.7%） （ Wu et al.， 2013）和中國(guó)櫻桃 （ 15.62%） （宗宇 等， 2016） 。本研究中利用萬(wàn)壽菊雄性不育系 S-121 花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì) 48 953 條 Unigene（序列總長(zhǎng)約 51 818 161 kb）序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有 13 849 個(gè) SSR 位點(diǎn)， SSR 位點(diǎn)頻率為 28.29%，處于較高水平，這種差異可能源于兩個(gè)原因： 1）與物種、 SSR 位點(diǎn)搜索標(biāo)準(zhǔn)以及序列大小等有關(guān)（劉峰 等； 2012；鄢秀芹 等， 2015） ； 2）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于特定時(shí)期和特定器官，缺乏對(duì)物種整個(gè)基因組序列特征的代表性。 在各重復(fù)類型的 SSR 位點(diǎn)中，三和四核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢(shì)，分別占總 SSR 的 50.16%和20.94%； 二核苷</p>
京公網(wǎng)安備 11010502048994號(hào)
個(gè)人主頁(yè)