云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定.pdf
<p>園藝學(xué)報， 2018， 45 (3)： 552 560. Acta Horticulturae Sinica 552 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0735； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2017 12 12； 修回日期 ： 2018 02 28 基金項目 ： 國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研項目（ 201303028） ；湖南省科技計劃項目（ 2016RS2019） ；國家自然科學(xué)基金項目（ 31571981，31571982， 31501643） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： haoasliu163.com， xuguozhouuky.edu） 云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定 劉 微1，史曉斌2，唐 鑫2，張 宇2，張德詠2，周序國1,*，劉 勇2,*（1湖南大學(xué)研究生院隆平分院，長沙 410125；2湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長沙 410125） 摘 要： 在云南省元謀縣發(fā)現(xiàn)大量下部葉片褪綠黃化，頂葉卷曲畸形的番茄植株。將葉片采集帶回實(shí)驗室，采用番茄褪綠病毒（ Tomato chlorosis virus， ToCV）和番茄黃化曲葉病毒（ Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）的特異性引物分別擴(kuò)增得到 774 和 400 bp 的目標(biāo)條帶，測序比對發(fā)現(xiàn)其與 ToCV 的KR184676.1 和 TYLCV 的 FJ012359.1 序列相似度均為 99%，確認(rèn)這兩條帶對應(yīng)的兩種病毒分別為 ToCV和 TYLCV，明確該番茄植株被 ToCV 和 TYLCV 復(fù)合侵染。同時發(fā)現(xiàn)云南地區(qū)有 B 型和 Q 型兩種煙粉虱存在，且 Q 型的比例高于 B 型，二者均可攜帶 ToCV 和 TYLCV。 ToCV 首次在云南省發(fā)現(xiàn)，其由沿海向內(nèi)陸蔓延的過程中與 TYLCV 的復(fù)合侵染已蔓延至西南地區(qū)，值得高度重視和警惕。 關(guān)鍵詞： 番茄；番茄褪綠病毒；番茄黃化曲葉病毒；煙粉虱；復(fù)合侵染 中圖分類號： S 641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 03-0552-09 Molecular Identification of Tomato chlorosis virus and Tomato yellow leaf curl virus in Yunnan Province LIU Wei1， SHI Xiaobin2， TANG Xin2， ZHANG Yu2， ZHANG Deyong2， ZHOU Xuguo1,*， and LIU Yong2,*（1College of Longping， Graduate School of Hunan University， Changsha 410125， China；2Hunan Academy of Agricultural Sciences， Hunan Plant Protection Institute， Changsha 410125， China） Abstract： The tomato leaves that displayed symptoms of the chlorosis and yellowing on the lower leaves and symptoms of the curl and deformity on the upper leaves were found and collected in Yunnan. The target DNA band of Tomato chlorosis virus（ ToCV） and Tomato yellow leaf curl virus（ TYLCV） ，774 bp and 400 bp， respectively， was amplified using the special primer for virus. The target PCR products were sequenced and compared with the NCBI nucleotide database via the BLAST tools. The result showed that the sample had 99% similarity with the KR184676.1 of ToCV and the FJ012359.1 of TYLCV. We can confirm that the tomato was simultaneously infected by the ToCV and TYLCV. Meanwhile， we found that in Yunnan Province Bemisia tabaci B and Q coexisted， and the proportion of Q was higher than B. Both of B and Q could carry ToCV and TYLCV. This is the first report of ToCV in Yunnan Province. In the spread process from coast to interior areas， the co-infection of ToCV and TYLCV has transmitted to the Southwest of China， and we should pay high attention to the trend of the virus. 劉 微，史曉斌，唐 鑫，張 宇，張德詠，周序國，劉 勇 . 云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (3)： 552 560. 553 Keywords： tomato； Tomato chlorosis virus； Tomato yellow leaf curl virus； Bemisia tabaci；co-infection 番茄褪綠病毒（ Tomato chlorosis virus， ToCV）屬于長線形病毒科（ Closteroviridae） ，毛形病毒屬 （ Crinivirus） ， 是由煙粉虱傳播的雙分體單鏈 RNA 病毒。 ToCV 基因組由兩條 RNA 鏈組成， RNA1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白， RNA2 則編碼與運(yùn)動、侵染植物、病毒包裝以及介體傳播相關(guān)的蛋白（ Wisler et al.， 1998； Wintermantel et al.， 2005； Lozano et al.， 2006） 。 ToCV 在番茄上發(fā)病的典型癥狀包括下部葉片褪綠發(fā)黃，但葉脈保持綠色。除番茄外， ToCV 可以侵染南瓜、甜椒、煙草和茄子等 7 科 25 種植物（ Wintermantel & Wisler， 2006； Sun et al.， 2016） 。 ToCV 最早在佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)（ Wisler et al.， 1998） ，隨后在歐洲（ Lozano et al.， 2007） 、以色列（ Segev et al.， 2004） 、日本（ Hirota et al.， 2010） 、韓國（ Kil et al.， 2015）和巴西（ Barbosa et al.， 2008）等地被報道，中國于2004 年首次在臺灣（ Tsai et al.， 2004）發(fā)現(xiàn)，隨后在北京、河北、河南、山東等地也檢測到了 ToCV（宋晰 等， 2013； Zhao et al.， 2013， 2014；鄭慧新 等， 2016） 。且 ToCV 發(fā)病率高，傳播迅速（周濤 等， 2014） 。 番茄黃化曲葉病毒（ Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）屬于雙生病毒科（ Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（ Begomovirus） 。 TYLCV 是由煙粉虱傳播的單鏈 DNA 病毒。番茄被 TYLCV侵染后表現(xiàn)為葉片卷曲、整株矮化，產(chǎn)量降低。 TYLCV 最早在以色列被發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)分布在世界各大洲蔬菜種植區(qū)（ Picó et al.， 1996） 。 TYLCV 仍是番茄生產(chǎn)上最具毀滅性的病毒。中國于 2006年首次在上海檢測到 TYLCV（ Wu et al.， 2006） ，隨后其向北擴(kuò)散到江蘇省、浙江省、山東省、北京市和河北省等地， 2009 2010 年在江蘇、河南、山東等地嚴(yán)重爆發(fā)（宋晰 等， 2013） ，給番茄種植造成巨大的損失。 ToCV 和 TYLCV 都不能靠摩擦接種，只能由韌皮部接種，所以具有刺吸式口器的煙粉虱在這兩種病毒的傳播過程中發(fā)揮著重要作用（ Gilbertson et al.， 2015） 。 ToCV 早期癥狀容易與缺素癥混淆；病毒侵染初期癥狀不明顯，難以及時發(fā)現(xiàn)（鄭慧新 等， 2016） ；媒介昆蟲難以防治；中間寄主雜草難以控制；無抗病番茄品種這 5 個主要原因使得 ToCV 不斷在新蔬菜種植區(qū)被發(fā)現(xiàn)，并且難以治理，而 TYLCV 仍在許多地區(qū)爆發(fā)危害，這兩種病害的復(fù)合侵染導(dǎo)致病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重。在云南的番茄采樣調(diào)查中，筆者發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在番茄種植地大量聚集，同時發(fā)現(xiàn)番茄上兩種病毒大面積復(fù)合侵染，二者之間存在著密切的聯(lián)系。 1 材料與方法 1.1 材料 供試植物：表現(xiàn)出感病癥狀的羅拉番茄葉片取自云南省元謀縣番茄種植基地。該品種對TYLCV 為抗病，而對 ToCV 的抗性沒有報道。采集番茄樣品 15 份用于病毒鑒定。 供試?yán)ハx：煙粉虱取自種植基地發(fā)病的番茄葉片。 1.2 番茄 ToCV 的鑒定 每個番茄樣品取 0.2 g 用于提取 RNA， 步驟參照華越洋植物多糖多酚植物 RNA 提取試劑盒操作說明書。 RNA 提取后置于 80 保存， 以備后續(xù)試驗使用。 RNA 提取后反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 置于 20 Liu Wei， Shi Xiaobin， Tang Xin， Zhang Yu， Zhang Deyong， Zhou Xuguo， Liu Yong. Molecular identification of Tomato chlorosis virus and Tomato yellow leaf curl virus in Yunnan Province. 554 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 552 560. 保存。 PCR 采用 ToCV 特異性引物 R（ 5-AAAGCTTTTAGCAACCAGTTATCGATGC-3）和 F（ 5-GGG ATCCATGGAGAACAGTGCTGTTGCA-3） 。 引物為自己設(shè)計， 對應(yīng) ToCV RNA 2 號鏈， 擴(kuò)增 ToCV CP（ Coat protein）基因全長序列，擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為 774 kb。 PCR 體系為 20 L： mix 10 L，上、下游引物各 1 L，模板 1 L， dd H2O 7 L。 PCR 程序為：94 預(yù)變性 5 min，隨后 94 變性 15 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 1 min， 35 次循環(huán)，最后 72 延伸 10 min。取 5 L 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物純化回收送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序分析。 1.3 番茄 TYLCV 的鑒定 每個番茄樣品取 0.2 g 用于植物 DNA 的提取，提取方法參照十六烷基三甲基溴化銨（ CTAB）法操作。 DNA 提取后置于 20 保存用于后續(xù)試驗。 PCR 過程采用 TYLCV 特異性引物 R（ 5-AG TCACGGGCCCTTACA-3）和 F（ 5-ATACTTGGACACCTAATGGC-3） 。引物為自己設(shè)計，對應(yīng)TYLCV 的 AV 2 基因（ Shi et al.， 2016） 。 PCR 體系為 20 L： mix 10 L，上、下游引物各 1 L，模板 1 L， ddH2O 7 L。 PCR 程序為： 95 預(yù)變性 3 min，隨后 94 變性 15 s， 60 1 min， 72 延伸 1 min， 30 次循環(huán)，最后 72 延伸 15 min。取 5 L 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測， PCR 產(chǎn)物純化回收送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序分析。 1.4 煙粉虱 ToCV 的檢測 單頭煙粉虱 RNA 提取采用 TRIzol 法并略有改動。取單頭煙粉虱置于 RNase free 離心管中，使用已去 RNase 的研磨棒充分研磨后加入 1 mL TRIzol 并振蕩 15 s，室溫下靜置 5 min，然后加入 300 L 氯仿，振蕩 1 min 之后置于冰上靜置 2 min， 4 12 000 r · min-1離心 15 min。取上清液 400 L移到新的去除 R Nase 的新離心管中，并加入等體積的異丙醇輕輕顛倒混勻 4 6 次， 20 靜置 30 min 后 12 000 r · min-1離心 10 min。倒掉上清液，用新配的 75%乙醇溶液清洗管壁后 8 000 r · min-1離心 3 min，重復(fù)操作 1 次。最后將離心管倒置于室溫下晾干 5 min。取 10 L 經(jīng) DEPC 處理過的水溶解 RNA，將 RNA 提取完成后采用康為反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA，并置于 20 保存?zhèn)溆谩? PCR 過程采用 ToCV 特異性引物 R（ 5-AAAGCTTTTAGCAACCAGTTATCGATGC-3）和 F（ 5-GGGATCCATGGAGAACAGTGCTGTTGCA-3）進(jìn)行擴(kuò)增，取 5 L 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 PCR 產(chǎn)物純化回收送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序分析。 1.5 煙粉虱 TYLCV 的檢測 煙粉虱單頭 DNA 提取采用蛋白酶 K 法，取 3 L 蛋白酶 K 于封口膜上，每只煙粉虱置于膜上研磨成勻漿后移至 PCR管加入 10 mg · mL-1的樹脂溶液混勻， 然后置于 37 孵育 1 h， 96 10 min。 PCR 體系采用 TYLCV 特異性引物 R（ 5-AGTCACGGGCCCTTACA-3）和 F（ 5-ATACTTGG ACACCTAATGGC-3）。 PCR 體系為 20 L： mix 10 L，上、下游引物各 1 L，模板 1 L， dd H2O 7 L。 PCR 程序為： 95 預(yù)變性 3 min，隨后 94 變性 15 s， 60 1 min， 72 延伸 1 min， 30 次循環(huán)，最后 72 延伸 15 min。取 5 L 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測， PCR 產(chǎn)物純化回收送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序分析。 1.6 煙粉虱生物型鑒定 利用煙粉虱線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因（ mtCOI）設(shè)計的一對引物，經(jīng) PCR 擴(kuò)增后酶切，根據(jù)劉 微，史曉斌，唐 鑫，張 宇，張德詠，周序國，劉 勇 . 云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (3)： 552 560. 555 酶切結(jié)果，可分為 B 型與 Q 型，能被切開且電泳圖有兩個條帶的即為 Q 型煙粉虱， 不能被切開在電泳圖上只有 1 個條帶的即為 B 型煙粉虱。 煙粉虱單頭 DNA 的提?。喝?3 L 蛋白酶 K 于封口膜上，每只煙粉虱置于膜上研磨成勻漿后移至 PCR 管加入 10 mg · mL-1的樹脂溶液混勻，然后置于 37 孵育 1 h， 96 10 min。 PCR 體系為20 L： mix 10 L，上、下游引物各 1 L，模板 1 L， ddH2O 7 L。 PCR 程序： 95 預(yù)變性 5 min；隨后 95 變性 15 s， 53 45 s， 72 延伸 1 min， 35 次循環(huán)，最后 72 延伸 10 min。 PCR 產(chǎn)物取5 L 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 酶切體系：酶（ Ase） 0.5 L，緩沖液（ NEBuffer 3.1） 2 L， ddH2O 7.5 L， PCR 產(chǎn)物 10 L，混勻后置于 37 3 4 h。取 5 L 酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 煙粉虱每次取 50 頭進(jìn)行檢測，重復(fù) 3 次。 1.7 ToCV 與 TYLCV 基因進(jìn)化分析 經(jīng)凝膠電泳檢測后，將 ToCV 和 TYLCV 的 PCR 產(chǎn)物純化回收后送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序分析，測序后在 NCBI 上進(jìn)行 BLAST 比對后選取云南以外其他區(qū)域病毒分離物采用MEGA 5 軟件構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系樹。 2 結(jié)果與分析 2.1 番茄植株田間發(fā)病癥狀 在元謀縣番茄種植基地發(fā)病田間觀察到，已開花的番茄植株，果實(shí)坐果數(shù)量明顯減少；已坐果的果實(shí)，成熟時間延長，許多果實(shí)出現(xiàn)畸形；果實(shí)成熟期觀察到植株頂部葉片尖端向內(nèi)卷曲，并且皺縮畸形，植株下部葉片葉脈間出現(xiàn)褪綠黃化現(xiàn)象。同時觀察到番茄植株的葉片背面煙粉虱聚集很多，并且可以看到煙粉虱的若蟲。番茄株間、行間、田塊周邊的雜草很多，一部分雜草表現(xiàn)出葉片黃化，并且能觀察到煙粉虱的活動。 綜合以上情況，可以初步判斷番茄植株已經(jīng)感染 ToCV 和 TYLCV 中的一種或兩種。 2.2 番茄 ToCV 的鑒定 采自田間的帶病征的 15 株番茄葉片樣品，經(jīng) RT-PCR 檢測，均檢測出 774 bp 的 ToCV 目標(biāo)條帶（圖 1），說明 ToCV 感染率 100%。 圖 1 云南 15 株番茄樣品（ 1 15） RT-PCR 鑒定 ToCV 結(jié)果 M： DNA marker； N：陰性對照； P：陽性對照。 Fig. 1 RT-PCR amplification of ToCV in tomato samples（ 1 15） from Yunnan M： DNA marker； N： Negative control； P： Positive control. 2.3 番茄 TYLCV 的鑒定 采自田間的帶病征的 15 株番茄葉片樣品經(jīng) PCR， 均檢測出 400 bp 的 TYLCV 目標(biāo)條帶 （圖 2） ，Liu Wei， Shi Xiaobin， Tang Xin， Zhang Yu， Zhang Deyong， Zhou Xuguo， Liu Yong. Molecular identification of Tomato chlorosis virus and Tomato yellow leaf curl virus in Yunnan Province. 556 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 552 560. 說明 TYLCV 感染率 100%。 圖 2 云南 15 株番茄樣品（ 1 15） TYLCV 的 PCR 鑒定結(jié)果 M： DNA marker； N：陰性對照； P：陽性對照。 Fig. 2 PCR amplification of TYLCV in tomato samples（ 1 15） from Yunnan M： DNA marker； N： Negative control； P： Positive control. 2.4 煙粉虱 ToCV 的鑒定 從田間取回的煙粉虱中隨機(jī)取 8 頭，經(jīng) RT-PCR 鑒定（圖 3） ， 8 頭煙粉虱中有 3 頭具有明顯的目標(biāo)（ ToCV）條帶（ 774 bp） 。 圖 3 云南田間煙粉虱（ 1 8） ToCV 的 RT-PCR 鑒定結(jié)果 M： DNA marker； N：陰性對照； P：陽性對照。 Fig. 3 RT-PCR amplification of ToCV in whitefly（ 1 8） from Yunnan M： DNA marker； N： Negative control； P： Positive control. 2.5 煙粉虱 TYLCV 的鑒定 從田間取回的煙粉虱中隨機(jī)取 8 頭經(jīng) PCR 鑒定（圖 4） ， 8 頭煙粉虱中能觀察到 6 頭煙粉虱具有明顯的目標(biāo)（ TYLCV）條帶（ 400 bp） 。 圖 4 云南田間煙粉虱（ 1 8） TYLCV 的 PCR 鑒定結(jié)果 M： DNA marker； N：陰性對照； P：陽性對照。 Fig. 4 PCR amplification of TYLCV in whitefly（ 1 8） from Yunnan M： DNA marker； N： Negative control； P： Positive control. 2.6 煙粉虱生物型鑒定 煙粉虱經(jīng) PCR 擴(kuò)增后的酶切鑒定結(jié)果顯示，該基地的煙粉虱為混合發(fā)生。對此次調(diào)查中的煙粉虱隨機(jī)取樣調(diào)查生物型，每組 50 頭， 3 次重復(fù)， B 型煙粉虱的數(shù)量分別是： 20、 15、 18 頭； Q 型煙粉虱的數(shù)量分別是 30、 35、 32 頭。統(tǒng)計表明該基地?zé)煼凼?B 型煙粉虱占比約為 35%， Q 型煙粉虱占比約為 65%（表 1） ，可以初步推測該基地 Q 型煙粉虱為優(yōu)勢種群。 根據(jù) B 型和 Q 型煙粉虱的 mtCOI 基因擴(kuò)增后能被 Ase酶切的差異來快速鑒定 B 型和 Q 型煙粉虱。 B 型煙粉虱 mtCOI 擴(kuò)增后酶切鑒定圖如圖 5 所示，其酶切后條帶仍為單一條帶； Q 型煙粉虱mtCOI 擴(kuò)增后酶切鑒定圖如圖 6 所示，其酶切后具有兩條大小不同條帶。圖 5 和圖 6 的酶切鑒定圖都是選取了具有目的條帶的，各 20 頭煙粉虱。 劉 微，史曉斌，唐 鑫，張 宇，張德詠，周序國，劉 勇 . 云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (3)： 552 560. 557 表 1 云南煙粉虱樣品生物型鑒定 Table 1 The statistics table of the whitefly biotype from Yunnan 分組 Trait 總數(shù) Total B 型煙粉虱的數(shù)量The number of B Q 型煙粉虱的數(shù)量 The number of Q B 型比例 /% The ratio of B Q 型比例 /% The ratio of Q 1 50 20 30 40 60 2 50 15 35 30 70 3 50 18 32 36 64 平均值 Average value 50 18 32 35 65 圖 5 云南 B 型煙粉虱（ 1 20）生物型鑒定結(jié)果 M： DNA marker； N：陰性對照； P：陽性對照。 Fig.5 The detection result of the B biotype whitefly（ 1 20） from Yunnan M： DNA marker； N： Negative control； P： Positive control. 圖 6 云南 Q 型煙粉虱生物型鑒定結(jié)果 M： DNA marker； N：陰性對照； P：陽性對照。 Fig. 6 The detection result of the Q biotype from Yunnan M： DNA marker； N： Negative control； P： Positive control. 2.7 云南番茄 ToCV 基因進(jìn)化分析 由圖 7 可以看出，云南番茄 ToCV 分離物與中國山東（ KC812623.1） 、北京（ KT751008.1）等省市、日本（ AB513443.1） 、葡萄牙（ DQ335134.1） 、希臘（ HG380090.1）等國家分離物的親緣關(guān)系較近，共同形成一個大的分支。番茄侵染性褪綠病毒（ TICV）與 ToCV 為同屬病毒，二者的癥狀表現(xiàn)十分相似，很難區(qū)分，需要通過鑒別寄主進(jìn)行區(qū)別（ Hanssen et al.， 2010） ，目前在國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)TICV 的報道（吳淑華 等， 2016） 。 圖 7 采用 MEGA 5 軟件構(gòu)建的云南 ToCV 的基因進(jìn)化樹 Fig. 7 Phylogenetic tree of CP genes of ToCV isolates from Yunnan， using MEGA 5 software Liu Wei， Shi Xiaobin， Tang Xin， Zhang Yu， Zhang Deyong， Zhou Xuguo， Liu Yong. Molecular identification of Tomato chlorosis virus and Tomato yellow leaf curl virus in Yunnan Province. 558 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 552 560. 2.8 云南番茄 TYLCV 基因進(jìn)化分析 由圖 8 可見，云南番茄 TYLCV 分離物獨(dú)立形成 1 個分支，與中國上海（ HM222427.1） 、墨西哥（ FJ012359.1）的 TYLCV 親緣關(guān)系較近，并且位于同一個大的分支。豆矮花葉病毒（ BDMV）與 TYLCV 同屬不同種，屬于 DNA 病毒，在感染的不同階段對植物造成不同的影響，會造成嚴(yán)重的發(fā)育遲緩以及植株矮化，葉片歪曲、花葉的現(xiàn)象，造成大面積減產(chǎn)。 圖 8 采用 MEGA 5 軟件構(gòu)建的云南 TYLCV 的基因進(jìn)化樹 Fig. 8 Phylogenetic tree of AV2 gene of TYLCV isolates from Yunnan using MEGA 5 software 3 討論 此次試驗檢測到云南省番茄存在 ToCV 和 TYLCV 復(fù)合侵染的情況，且復(fù)合侵染比例為 100%。TYLCV 發(fā)病迅速，前期癥狀明顯（ Picó et al.， 1996） ，若能及時除去發(fā)病幼苗，可降低損失，但是ToCV 前期癥狀不明顯（周濤 等， 2014） ，與植物缺素癥狀類似，在早期并不能表現(xiàn)出明顯的癥狀，在番茄進(jìn)入開花結(jié)實(shí)期才能觀察到明顯的染病情況， 此時 ToCV 病毒粒子已經(jīng)在植株體內(nèi)積聚很多，同時在媒介昆蟲存在的情況下已經(jīng)完成對周邊植株的侵染，給病害早期防治帶來很大困難（ Orfanidou et al.， 2016） 。 媒介昆蟲是植物病毒的傳播載體，昆蟲病毒植物之間具有復(fù)雜的連系（ Dietzgen et al.，2016） 。感病植物能吸引昆蟲取食（ Fang et al.， 2013； Moreno-Delafuente et al.， 2013） ，同時 TYLCV與煙粉虱互作能降低植株防御能力， 有利于煙粉虱的取食和病毒的傳播 （ Shi， 2013， 2014a， 2014b） 。在海南的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)感染 ToCV 葉片上的主要為 Q 型煙粉虱，且?guī)Ф韭瘦^高（ Tang et al.， 2017） 。本試驗中除了發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)合侵染之外，還發(fā)現(xiàn)在云南 B 型和 Q 型煙粉虱同時存在，二者均可攜帶并傳播病毒，且 Q 型煙粉虱的比例高于 B 型煙粉虱。已有研究表明，農(nóng)藥的使用是造成 Q 型煙粉虱在中國大爆發(fā)的原因之一（ Pan et al.， 2015） ，因此在防治番茄病毒病的過程中，對煙粉虱的防治應(yīng)注意農(nóng)藥的合理使用，煙粉虱抗藥性的產(chǎn)生將會加大對病毒病的防治難度。 鄭慧新等（ 2016）報道，在中國 ToCV 已經(jīng)由山東、北京、河北為中心向周圍輻射的趨勢傳播到各地。親緣關(guān)系樹分析顯示，云南 ToCV 和 TYLCV 分別與山東的和上海的有較近的親緣關(guān)系，推測云南的 ToCV 和 TYLCV 可能與山東和上海的種苗調(diào)運(yùn)有關(guān)。 TYLCV 和 ToCV 的復(fù)合侵染 2014年在山東首次發(fā)現(xiàn)（趙黎明 等， 2014） ， 2016 年在江蘇再次發(fā)現(xiàn)（吳淑華 等， 2016） 。在不到兩年的時間， TYLCV 和 ToCV 的復(fù)合侵染已經(jīng)迅速從華東地區(qū)擴(kuò)散到西南地區(qū)，除了煙粉虱的傳播之劉 微，史曉斌，唐 鑫，張 宇，張德詠，周序國，劉 勇 . 云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (3)： 552 560. 559 外，這種復(fù)合侵染快速傳播的現(xiàn)象可能與農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)交流活動相關(guān)。 當(dāng)前，中國已經(jīng)展開 TYLCV 的抗性育種工作，得到了高抗病性品種，對減輕 TYLCV 造成的損失有明顯的效果； ToCV 的抗病性育種工作正在開展，但目前還沒有抗 ToCV 的品種。所以加強(qiáng)對 ToCV 的預(yù)防和檢測，控制煙粉虱的數(shù)量仍然是控制 ToCV 爆發(fā)的關(guān)鍵。病毒的復(fù)合侵染通常表現(xiàn)出協(xié)生作用（ Gil-Salasa et al.， 2012） ，例如 TSWV 和 ToCV 同時侵染番茄時存在協(xié)生現(xiàn)象（ García-Cano et al.， 2006） ，但是對于 TYLCV 和 ToCV 的復(fù)合侵染后是否存在協(xié)生的情況， ToCV的侵染會不會造成寄主植株對 TYLCV 的抗性減弱，存在協(xié)生的情況下所造成的損失嚴(yán)重與否，這些并未見報道，其潛在的威脅值得研究。 本研究中發(fā)現(xiàn) ToCV 和 TYLCV 的復(fù)合侵染已經(jīng)擴(kuò)散到云南省。云南省是重要的育種和種植基地，生態(tài)、生物多樣性豐富， ToCV 和 TYLCV 寄主廣泛，能在雜草寄生并進(jìn)行循環(huán)侵染。降低媒介昆蟲數(shù)量、控制田間雜草數(shù)量仍是目前治理植物病毒病的重要方式，對做好病毒病的防控工作十分重要。 References Barbosa J C， Teixeira A P M， Moreira A G， Camargo L E A， Bergamin Filho A， Kitajima E W， Rezende J A M. 2008. 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