園藝學報， 2018， 45 (2)： 359 370. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0736； http： /www. ahs. ac. cn 359 收稿日期 ： 2017 10 24； 修回日期 ： 2018 01 08 基金項目 ： 國家自然科學基金項目（ 31471156） ；上海交通大學 Agri-X 基金項目（ Agri-X2015002） ；上海市研究生教育創(chuàng)新計劃項目（園藝學） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： cairunsjtu.edu.cn） 黃瓜蠟質(zhì)合成調(diào)控基因 CsWIN1 的克隆與功能初步分析 李 鋮，潘 健，連紅莉，王 剛，何歡樂，潘俊松，蔡 潤*（上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240） 摘 要： 從黃瓜中同源克隆了擬南芥中具有調(diào)控蠟質(zhì)合成與代謝功能的基因 WIN1/SHINE1，命名為CsWIN1。熒光定量 PCR 結(jié)果表明： CsWIN1 在黃瓜植株的葉片和幼果中高表達；通過在擬南芥中過表達CsWIN1，發(fā)現(xiàn)其與已報道的 WIN1/SHINE1 過表達株系表型相似。通過對 CsWIN1 轉(zhuǎn)基因株系的基因表達分析發(fā)現(xiàn)， 蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達受到了調(diào)控。 根據(jù)以上研究結(jié)果， 推測 CsWIN1 與擬南芥 WIN1/SHINE1在表皮蠟質(zhì)合成調(diào)控上的功能是保守的，通過調(diào)控下游蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達從而影響蠟質(zhì)的合成與代謝。 關(guān)鍵詞： 黃瓜；表皮蠟質(zhì)； CsWIN1；功能分析 中圖分類號： S 642.2 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 02-0359-12 Cloning and Functional Analysis of CsWIN1， a Transcription Factor Regulated the Wax Synthesis in Cucumber LI Cheng， PAN Jian， LIAN Hongli， WANG Gang， HE Huanle， PAN Junsong， and CAI Run*（ School of Agriculture and Biology， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China） Abstract： In Arabidopsis， WIN1/SHINE1 gene has the function of regulating wax synthesis and metabolism. In this study， a homologous gene of WIN1/SHINE1 was cloned from cucumber and named CsWIN1. The results of qRT-PCR showed that CsWIN1 expressed at high levels in the leaves and young fruits of cucumber. Subcellular localization analysis suggested that the CsWIN1 protein is located in the nucleus. The CsWIN1 overexpression in the transgenic plants of Arabidopsis thaliana caused a similar phenotype to WIN1/SHINE1 overexpressing lines of Arabidopsis. The expression analysis of CsWIN1 transgenic lines indicated that the expressions of the genes related to wax synthesis have been changed significantly. These results suggested that the function of CsWIN1 is conserved in the regulation of epidermal wax synthesis through regulating the expression of downstream genes related to wax synthesis to affect wax biosynthesis and metabolism. Keywords： cucumber； epicuticular wax； CsWIN1； functional analysis Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 360 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 植物表皮由沉積的角質(zhì)層和蠟質(zhì)共同組成（ Juniper & Jeffree， 1983） 。而蠟質(zhì)又可分為兩層，其中一層為嵌入在角質(zhì)層中的脂質(zhì)的無定形混合物，稱為內(nèi)蠟質(zhì)層；另一層是指形成晶體的表面脂質(zhì)或在角質(zhì)層外面的光滑膜，稱為外蠟質(zhì)層。 Barthlott 等（ 1998）調(diào)查了 13 000 多種植物表皮蠟質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其微觀形態(tài)不是固定的，在植物生長過程中因成分變化而相互轉(zhuǎn)化，并且能自我組裝成各種形態(tài)的蠟質(zhì)晶體，如桿狀、柱狀、管狀、絲狀、片狀、顆粒狀等，一些植物在特定的生長時期會出現(xiàn)肉眼可觀察到的白霜狀表型。不同植物的蠟質(zhì)成分和含量不同，同一植株不同器官及不同生長發(fā)育時期的蠟質(zhì)分布和組分也存在差異（ Susan et al.， 1997；倪郁和郭彥軍， 2008） 。植物表皮蠟質(zhì)形成了植物地上器官的疏水層， 是保護其免受機械損傷和病原體入侵的第一道屏障 （ Sieber et al.， 2000） 。 此外， 其在植物中還起多重作用， 包括調(diào)節(jié)表皮滲透性和防止水分流失 （ Lu et al.， 2009） ，抵御非生物和生物脅迫（ Steinmüller & Tevini， 1985； Seo & Park， 2010）等。 含有 AP2 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子最初發(fā)現(xiàn)于高等植物中 （ Jofuku et al.， 1994） 。 擬南芥 WIN1/SHINE1是一種具有 AP2 結(jié)構(gòu)域的乙烯應(yīng)答型轉(zhuǎn)錄因子， 也是第 1 個被鑒定為與植物脂質(zhì)代謝途徑緊密相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（ Magnani et al.， 2004； Kannangara et al.， 2007） 。在擬南芥中過表達 WIN1/SHINE1 后會形成更加有光澤的葉表面，而且葉莖表皮蠟質(zhì)積累量明顯增加,產(chǎn)生類似平盤狀、長約 1 2 m的蠟質(zhì)結(jié)晶,在一定程度上滲透性增強，且蠟質(zhì)積累量與 WIN1/SHINE1 在植株中的表達水平有關(guān)（ Broun et al.， 2004） 。有研究表明， WIN1/SHINE1 還能通過控制角質(zhì)層脂質(zhì)代謝，來改變果膠代謝和結(jié)構(gòu)蛋白，從而改變表皮細胞壁結(jié)構(gòu)（ Shi et al.， 2011） 。 黃瓜（ Cucumis sativus L.）表面覆蓋的蠟質(zhì)與植株生長和抗性關(guān)系密切。本研究中克隆了黃瓜中調(diào)控蠟質(zhì)合成相關(guān)基因 CsWIN1， 并分析了其基因結(jié)構(gòu)、 蛋白結(jié)構(gòu)和表達模式， 初步預(yù)測了 CsWIN1在調(diào)控黃瓜表皮蠟質(zhì)形成中的作用，為研究黃瓜表皮蠟質(zhì)形成的分子機制提供新的理論基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 材料 供試黃瓜材料為華北類型 9930、歐美加工型 Gy14 和本實驗室保存的華北型自交系 S94、歐洲溫室型自交系 S06。材料于 2016 年 3 月 25 日種植于上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院溫室內(nèi)，自然光照條件。擬南芥品系哥倫比亞野生型（ Columbia-0， Col-0）由本實驗室保存， gl2 無毛突變體（ CS65，gl2-1）購于 ABRC Stocks 網(wǎng)站。 TA-克隆載體 pEASY 購置于全式金公司。植物表達載體 pHB 與pHB-YFP 由復旦大學生命科學技術(shù)學院楊洪全老師饋贈。 1.2 CsWIN1 的克隆、測序及生物信息學分析 根據(jù)擬南芥 WIN1/SHINE1（ AT1G15360）編碼區(qū)序列及其編碼蛋白的氨基酸序列，從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（ http： /www.cucumber.genomics.org.cn）中 BLAST 比對，選序列相似性與得分最高的基因 Csa2G006270，命名為 CsWIN1。根據(jù) CsWIN1 基因的編碼區(qū)序列（ CDS）設(shè)計 PCR 引物。上游引物： 5-ATGGTGCCATCAAAGAAGTTTAGA-3，下游引物： 5-TTAGATTAGAGAGGGTAAAAAA GTTGGT-3。提取 9930 黃瓜葉片總 RNA（采用康為世紀 CWBIO OmniPlant RNA Kit） ，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA（采用康為世紀 HiFiScript cDNA Synthesis Kit） ，將其作為模板進行 CsWIN1 片段 PCR 擴增。反應(yīng)條件： 94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 s， 58 復性 30 s， 72 延伸 90 s， 35 個循環(huán)； 72 10 min。 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,用 DNA 凝膠回收試劑盒（天根）進行回收純李 鋮，潘 健，連紅莉，王 剛，何歡樂，潘俊松，蔡 潤 . 黃瓜蠟質(zhì)合成調(diào)控基因 CsWIN1 的克隆與功能初步分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 359 370. 361 化獲得所需的目的片段。將基因片段與全式金 pEASY 載體連接，根據(jù)試劑盒說明書篩選陽性克隆，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。 在 NCBI（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，使用 Blast 程序在 GenBank 搜索與 CsWIN1 蛋白同源性高的植物蛋白序列。通過 EMBOSS6.5.7 工具 sigcleave 預(yù)測信號肽，通過 BLASTp 獲得與CsWIN1 序列相似性較高的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用 Clustal W 程序（ Wang et al.， 2014）和Geneious 9.14 軟件進行序列的比對分析,用 Geneious 9.14 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（參數(shù)為： “ observed divergency” ， “ toss gaps” ，使用 1 000 次的 bootstrap 校驗） 。 1.3 實時熒光定量 PCR（ qRT-PCR） 從 9930 黃瓜植株上采集 2、 5 和 10 mm 長幼果、子葉，開花前一天的雌蕊、雄蕊、果肉、果皮、花瓣和萼片，四葉一心時期的真葉、根、莖、卷須等，分別提取總 RNA。取歐洲溫室型黃瓜 S06植株的完全伸展開真葉、 5 mm 長幼果和成熟果皮，分別提取總 RNA。所有樣品均設(shè) 3 個生物學重復。熒光定量 PCR 儀采用 Rotor-Gene Q（ Qiagen） ，試劑盒為 FastStart Essential DNA Green Master（ Roche） 。 CsWIN1 上游引物： 5-TCAAGCGGCCGTGTTAATGAGC-3，下游引物： 5-CGTTTGGCT CATCGGAAAGTTGG-3。所用內(nèi)參基因為 CsActin3，上游引物： 5-TCGTGCTGGATTCTGGTG-3，下游引物： 5-GGCAGTGGTGGTGAACAT-3。 PCR 反應(yīng)體系為： 2× mix 10 L，上游引物（ 10 mol · L-1） 0.5 L， 下游引物 （ 10 mol · L-1） 0.5 L， cDNA 模板 2 L， 最后加滅菌去離子水至 20 L。PCR 擴增程序為： 95 預(yù)變性 10 min； 95 變性 10 s， 55 復性 10 s， 72 延伸 20 s， 40 個循環(huán)。所有樣品設(shè)置 3 個技術(shù)重復， 3 個生物學重復。 CsWIN1 在不同發(fā)育時期、不同組織的相對表達量以在 2 mm 長幼果中的表達量為參照； CsWIN1 在不同黃瓜品種中的相對表達量以在 9930 成熟果皮中的表達量為參照。 1.4 CsWIN1-YFP 融合蛋白在煙草中的亞細胞定位及 CsWIN1 啟動子元件分析 將 CsWIN1 的 PCR 產(chǎn)物與 pHB-YFP 載體連接。 將構(gòu)建完畢的融合載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101 中，對幼嫩煙草葉片進行瞬時轉(zhuǎn)化，參照 Yang 等（ 2000）的方法。將處理過的煙草置于適宜條件下暗處理 48 h。通過 Leica TCS SP5II 激光共聚焦顯微鏡的 YFP 通道觀察 CsWIN1-YFP 融合蛋白的亞細胞定位信號。 在黃瓜全基因組網(wǎng)站（ http： /www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi）和 TAIR（ http： /www. arabidopsis.org/）上搜索 CsWIN1 和 WIN1/SHINE1 基因，獲得它們的啟動子序列（轉(zhuǎn)錄區(qū)前約 2 kb） ，然后用獲得的啟動子序列在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析網(wǎng)站（ http： /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）上得到每個基因啟動子區(qū)域所含的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 1.5 過表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥 選取測序正確的 pEASY-CsWIN1 菌液提取質(zhì)粒，用 BamH和 Sac進行雙酶切，同時植物表達載體 pHB 也用 BamH和 Sac進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,分別切取含外源目的基因 CsWIN1 片段和 pHB 酶切產(chǎn)物大片段的凝膠， DNA 回收純化后用 T4 連接酶連接，參照試劑盒說明書（唯地生物）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細胞， PCR 鑒定后的陽性菌液送生工測序。經(jīng)測序確認， 從含 pHB-CsWIN1 的菌液中提取質(zhì)粒， 用熱激的方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)細胞，PCR 方法鑒定后用攜帶 pHB-CsWIN1 的農(nóng)桿菌參照駱倩（ 2014）的轉(zhuǎn)化擬南芥方法對擬南芥野生型與 gl2 突變體進行轉(zhuǎn)化。 Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 362 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 收獲農(nóng)桿菌侵染過的 T0代擬南芥種子，進行陽性植株的篩選（駱倩， 2014） 。篩選至 T2代，獲取純合轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析， 野生型與 gl2 轉(zhuǎn)化體分別記為 35S:CsWIN1-WT 和 35S:CsWIN1-gl2。 1.6 CsWIN1 對其他蠟質(zhì)相關(guān)基因的調(diào)控 對擬南芥野生型、 gl2 突變體、 35S:CsWIN1-WT 和 35S:CsWIN1-gl2 4 種材料的整株幼苗和成熟蓮座葉進行 qRT-PCR 分析，鑒定蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達量差異。擬南芥內(nèi)參基因及蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的名稱與引物序列均參照 Oshima 等（ 2013）的。轉(zhuǎn)基因擬南芥相對野生型的表達差異倍數(shù)根據(jù) 2-CT法進行計算，差異倍數(shù)取對數(shù)后，導入熱圖（ heatmap）生成工具（ http： /www. omicshare. com/tools/index.php/）進行熱圖繪制。 2 結(jié)果與分析 2.1 CsWIN1 的結(jié)構(gòu)及編碼氨基酸序列分析 序列比對結(jié)果顯示，在黃瓜基因組中與擬南芥 WIN1/SHINE1 序列相似性最高的基因為Csa2G006270，將其命名為 CsWIN1。通過 RT-PCR 擴增產(chǎn)物的測序，獲得 9930 中 CsWIN1 的 cDNA編碼區(qū)序列。該基因序列全長為 1 456 bp，包含 2 個外顯子， 1 個內(nèi)含子， CDS 全長 741 bp，編碼247 個氨基酸（圖 1） 。氨基酸序列含有一個保守的 AP2 結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域或信號肽，分子量27 kD。 圖 1 CsWIN1 基因結(jié)構(gòu)示意圖 Fig. 1 CsWIN1 gene structure diagram 通過對歐洲溫室型自交系 S06、華北型 S94 和 9930 以及歐美加工型 Gy14 黃瓜材料的 CsWIN1基因擴增并測序，發(fā)現(xiàn)該基因在這 4 個果實表皮差異較大的黃瓜材料中無序列多態(tài)性。 2.2 系統(tǒng)進化樹分析 進化樹分析顯示，與黃瓜同為葫蘆科的甜瓜（ Cucumis melo， XP_008457550） 、苦 瓜（ Momordica charantia， XP_022143192）的 WIN1 基因與 CsWIN1 的親緣關(guān)系較近（圖 2） ，但尚未見生物學功能鑒定的報道。擬南芥的 WIN1/SHINE1 是功能研究較為深入的蠟質(zhì)合成調(diào)控基因。黃瓜 CsWIN1 與AtWIN1 的氨基酸序列相似性為 59%（圖 3） ，其中位于序列 N 端的 AP2 結(jié)構(gòu)域，以及位于基因中間和 C 端的兩個未知的結(jié)構(gòu)域（圖 3） ，在二級結(jié)構(gòu)上都很保守（圖 4） 。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)決定功能的原則，推測 CsWIN1 與擬南芥 WIN1/SHINE1 的基因功能可能相似。 李 鋮，潘 健，連紅莉，王 剛，何歡樂，潘俊松，蔡 潤 . 黃瓜蠟質(zhì)合成調(diào)控基因 CsWIN1 的克隆與功能初步分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 359 370. 363 圖 2 黃瓜 CsWIN1 與其他物種 WIN1 同源蛋白進化樹分析 數(shù)值代表氨基酸序列同源性的百分比。 Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of CsWIN1 and WIN1 homologs from other species The value represents the percentage of amino acid sequence homology. 圖 3 黃瓜 CsWIN1 與其他物種 WIN1 蛋白序列對比 圖中顯示的是 CsWIN1 的 1 225 個氨基酸序列，省略號部分為與多數(shù)序列相比該序列缺少的部分， AP2 結(jié)構(gòu)域標注在蛋白序列下方， Domain II、 Domain III 為兩個未知結(jié)構(gòu)域。 Pe：胡楊； Pt：毛果楊； Cm：甜瓜； Cs：香橙； Mc：苦瓜； At：擬南芥； Pb：白梨； Gh：陸地棉； Gr：棉花； Cc：柑橘； Cs：黃瓜； Hb：橡膠樹； Me：木薯； Rc：蓖麻； Jc：麻風樹； La：狹葉羽扇扁豆； Jr：胡桃； Cc：木豆。 Fig. 3 Sequence alignment of WIN1-like proteins in CsWIN1 and other species The figure shows the 1 225 amino acid sequence of CsWIN1. The ellipsis is part of the sequence that is missing from the sequence， and the AP2 domain is labeled below the protein sequence. Domain II and Domain III are two unknown domains. Pe： Populus euphratica； Pt： Populus trichocarpa； Cm： Cucumis melo； Cs： Citrus sinensis； Mc： Momordica charantia； At： Arabidopsis thaliana；Pb： Pyrus × bretschneideri； Gh： Gossypium hirsutum； Gr： Gossypium raimondii； Cc： Citrus clementina； Cs： Cucumis sativus； Hb： Hevea brasiliensis； Me： Manihot esculenta； Rc： Ricinus communis； Jc： Jatropha curcas； La： Lupinus angustifolius； Jr： Juglans regia； Cc： Cajanus cajan. Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 364 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 圖 4 黃瓜 CsWIN1 的蛋白序列分析 Fig. 4 Analysis of protein sequence of cucumber CsWIN1 2.3 CsWIN1 在黃瓜中的表達模式分析 黃瓜果實在表皮光澤上存在很大差異，選取 9930、 S06（歐洲溫室型自交系） 2 種表皮光澤差異較大的材料（圖 5） ，通過 qRT-PCR 進行基因表達分析，發(fā)現(xiàn)在葉片和果皮中 CsWIN1 基因表達無顯著差異（圖 6） ，說明歐洲溫室型黃瓜 S06 與華北型黃瓜 9930 果實表皮光澤差異很可能是由其他基因造成的。 選取華北型黃瓜 9930 的 2、 5 和 10 mm 長幼果，分析 CsWIN1 在這 3 個不同發(fā)育時期的表達差異。結(jié)果（圖 7）顯示， CsWIN1 在發(fā)育初期隨著果實的成熟表達量逐漸上升，但在開花前的各花器官相對低表達，說明 CsWIN1 可能在果實發(fā)育初期發(fā)揮功能，參與調(diào)控蠟質(zhì)代謝從而影響角質(zhì)層的形成。對其他組織部位的表達分析顯示 CsWIN1 在葉片中表達量最高；而在子葉、根、卷須、果刺中幾乎不表達。葉片的特異高表達說明 CsWIN1 可能在葉片表皮細胞發(fā)育過程中起重要作用。 圖 5 9930 與 S06 黃瓜果實 Fig. 5 Fruits of cucumber lines 9930 and S06 圖 6 CsWIN1 在不同黃瓜品種中的表達 Fig. 6 Expression of CsWIN1 in different cucumber cultivars 李 鋮，潘 健，連紅莉，王 剛，何歡樂，潘俊松，蔡 潤 . 黃瓜蠟質(zhì)合成調(diào)控基因 CsWIN1 的克隆與功能初步分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 359 370. 365 圖 7 CsWIN1 在 9930 黃瓜果實不同發(fā)育時期和不同組織的表達 1：根； 2：莖； 3：卷須； 4：果刺； 5：子葉； 6：葉片； 7： 2 mm 幼果； 8： 5 mm 幼果； 9： 10 mm 幼果； 10：果肉； 11：果皮； 12：雌蕊； 13：雄蕊； 14：花瓣和萼片。 Fig. 7 Expression of CsWIN1 in different fruit developmental stages and different tissues of 9930 cucumber 1： Root； 2： Stem； 3： Tendril； 4： Fruit thorn； 5： Cotyledon； 6： Leaf； 7： 2 mm fruitlet； 8： 5 mm fruitlet； 9： 10 mm fruitlet； 10： Pulp； 11： Peel； 12： Pistil； 13： Stamen； 14： Petals & sepal. 2.4 CsWIN1 的亞細胞定位和啟動子元件分析 亞細胞定位結(jié)果顯示， CsWIN1-YFP 融合蛋白在本氏煙葉表皮細胞中定位于細胞核（圖 8） ，說明 CsWIN1 蛋白符合轉(zhuǎn)錄因子特性，即作為一個相對較上游的轉(zhuǎn)錄因子在細胞核內(nèi)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。 圖 8 CsWIN1-YFP 融合蛋白在煙草中的亞細胞定位 A： CFP 通道； B： YFP 通道； C：白光通道； D：重疊通道。 Fig. 8 Subcellular localization of CsWIN1-YFP fusion proteins in tobacco A： CFP channel； B： YFP channel； C： The white light channel； D： Overlapping channel. Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 366 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 啟動子元件分析結(jié)果顯示，在 CsWIN1 啟動子區(qū)域中找到 25 個啟動子元件，與 WIN1/SHINE1基因的啟動子區(qū)域有 13 個相同的啟動子元件，即 5UTR Py-rich stretch、 ABRE、 Box4、 CAAT-box、G-Box、 G-box、 GAG-motif、 GCN4-motif、 GT1-motif、 MRE、 O2-site、 TATA-box、 Circadian。其中 ABRE 與脫落酸信號的響應(yīng)以及植物的抗逆性相關(guān)（孫曉麗 等， 2011） ； G-box 具有多重功能，包括接收與傳導光信號、調(diào)控厭氧代謝反應(yīng)、響應(yīng)乙烯、脫落酸、茉莉酸等植物激素信號等（薩其拉 等， 2003）。 2.5 CsWIN1 對其他蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的影響 CsWIN1 過表達擬南芥植株的葉表面比野生型的更加有光澤（圖 9） ，這與擬南芥 WIN1/SHINE1過表達植株表型一致。 圖 9 擬南芥 35S:CsWIN1-WT 轉(zhuǎn)化植株表型 A：轉(zhuǎn)基因植株； B：野生型植株； C：擬南芥蓮座葉片。 Fig. 9 Phenotypes of 35S:CsWIN1-WT transgenic plants in Arabidopsis A： 35S:CsWIN1 transgenic plant； B： Arabidopsis wild-type plant（ Ecotype Columbia） ； C： Arabidopsis thaliana leaves. 在黃瓜中， CsWIN1 在葉片中相對表達量最高（圖 7） ，證明其與葉片的發(fā)育相關(guān)，推測其在擬南芥葉片中行使著類似的功能。但是，在 gl2 無毛突變體中過表達 CsWIN1 則沒有明顯表型變化。 根據(jù)轉(zhuǎn)基因株系的 qRT-PCR 結(jié)果，計算差異表達倍數(shù)的對數(shù)值構(gòu)建熱圖（圖 10）過表達CsWIN1 擬南芥株系與野生型（ oxCsWIN1 vs WT）的差異；過表達 CsWIN1 的 gl2 突變體株系與 gl2突變體（ oxCsWIN1-gl2 vs gl2）的差異； gl2 突變體與野生型（ gl2 vs WT）的差異。 分析熱圖可以得出以下結(jié)果：蠟質(zhì)合成相關(guān)基因 CER1、 CYP86A4、 CYP86A7 在擬南芥無毛突變體 gl2 突變體中的表達量明顯比野生型低； CsWIN1 過表達的擬南芥蓮座葉（ oxCsWIN1）中各蠟質(zhì)合成相關(guān)基因較其野生型（ WT）中均呈上調(diào)表達，而在幼苗中則呈下調(diào)表達；在擬南芥 gl2 突變體幼苗中， CsWIN1 過表達后， GDSL、 CYP86A4、 CYP86A7 的表達被上調(diào)，而生長一段時間后，在成熟蓮座葉中，只有 CYP86A4 上調(diào)表達；在擬南芥野生型（ WT）中過表達 CsWIN1，發(fā)現(xiàn)蓮座葉中 CER1、 CER2、 KCS1 均上調(diào)表達。 這一結(jié)果與擬南芥 WIN1/SHINE1 過表達時 （ Oshima et al.， 2013）一致，即 CsWIN1 與擬南芥 WIN1/SHINE1 功能上是保守的。 李 鋮，潘 健，連紅莉，王 剛，何歡樂，潘俊松，蔡 潤 . 黃瓜蠟質(zhì)合成調(diào)控基因 CsWIN1 的克隆與功能初步分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 359 370. 367 圖 10 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與野生型及 gl2 突變體擬南芥植株中蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達量變化 oxCsWIN1 vs WT：過表達 CsWIN1 野生型擬南芥株系與野生型幼苗（蓮座葉）的蠟質(zhì)合成相關(guān)基因表達差異。 oxCsWIN1-gl2 vs gl2：過表達 CsWIN1 的 gl2 突變體株系與 gl2 突變體幼苗（蓮座葉）的蠟質(zhì)合成相關(guān)基因表達差異。 gl2 vs WT： gl2 突變體與野生型幼苗（蓮座葉）的蠟質(zhì)合成相關(guān)基因表達差異。 正數(shù)表示基因表達水平被上調(diào)；負數(shù)表示基因表達水平被下調(diào)。 Fig. 10 Fold changes of cuticle biosynthesis-related genes expression in transgenic Arabidopsis thaliana plants and wild-type（ WT） and gl2 mutant Arabidopsis plants oxCsWIN1 vs WT： The differences in expression of genes（ fold change） related to cuticle biosynthesis in 35S:CsWIN1 plants and wild-type seedlings（ rosette leaves） . oxCsWIN1-gl2 vs gl2： The differences in expression of genes（ fold change） related to cuticle biosynthesis in 35S:CsWIN1-gl2 plants and gl2 seedlings（ rosette leaves） . gl2 vs WT： The differences in expression of genes（ fold change） related to cuticle biosynthesis in gl2 and wild-type seedlings（ rosette leaves） . A positive number indicates that the gene expression level is up-regulated； a negative number indicates that the gene expression level is down-regulated. 3 討論 WIN1/SHINE1 與其同源基因已在多個物種中被報道具有保守的功能，如擬南芥（ Broun et al.，2004） 、番茄（ Shi et al.， 2013） 、大麥（ Taketa et al.， 2008） 、小麥（ Bi et al.， 2016） 、夏堇（ Oshima et al.， 2013） 、蘋果（ Lashbrooke et al.， 2015）等。目前在黃瓜中尚無 CsWIN1 基因突變體報道。采用同源克隆的方式對 CsWIN1 的基因功能進行研究， 在所選的 9930 和 S06 兩個材料中 CsWIN1 表達無差異，說明兩者果實表皮光澤差異很可能不是由 CsWIN1 造成，涉及其他基因。通過同源克隆與擬南芥轉(zhuǎn)基因功能驗證，初步證實 CsWIN1 具有 WIN1/SHINE1 類基因的功能，即通過調(diào)控下游蠟質(zhì)合成相關(guān)基因?qū)χ参锉砥そ琴|(zhì)層產(chǎn)生影響。但與 CsWAX1 和 CsCER2（王文嬌， 2015）等基因不同，CsWIN1 作為轉(zhuǎn)錄因子，其直接或間接調(diào)控著很多下游基 因，調(diào)控模式的保守性在自然群體中該基因的編碼區(qū)和表達穩(wěn)定性上有所體現(xiàn)。 通過基因表達分析證實 CsWIN1 在轉(zhuǎn)基因擬南芥中具有保守的調(diào)控模式，在此基礎(chǔ)上， CsWIN1Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 368 Acta Horticulturae Sinic