園藝學(xué)報， 2018， 45 (11)： 2164 2176. Acta Horticulturae Sinica 2164 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0361； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2018 08 01； 修回日期 ： 2018 11 16 基金項目 ： 福建省重大科技專項 （ 2015NZ0002-1） ； 閩江學(xué)者獎勵計劃項目 （ MJJZ13-003） ； 福建省高原學(xué)科建設(shè)經(jīng)費項目 （ 102/71201801101） ；福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新基金項目（ CXZX2017189） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： xxuhan163.com； laizx01163.com） 文心蘭 RFNR 的克隆、 亞細(xì)胞定位及其與 LFNR不同的脅迫響應(yīng)機制研究 李 蓉1，吳曉佩1，王雪晶1，陳裕坤1，郭容芳1，林玉玲1，賴鐘雄1,*，徐 涵1,2,*（1福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002；2法國圖盧茲綜合科學(xué)研究所（ IRIT-ARI） ，法國 31300） 摘 要： 以小櫻桃文心蘭為材料克隆了鐵氧還蛋白氧化還原酶（ FNR）兩種類型基因 RFNR（ Root-type Ferredoxin-NADP+ oxidoreductase）和 LFNR（ Leaf-type Ferredoxin-NADP+oxidoreductase） 。生物信息學(xué)分析表明， RFNR 與 LFNR 都屬于 FNR-like 超家族，具有黃素腺嘌呤二核苷酸（ flavin adenine dinucleotide， FAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide， NAD）功能結(jié)合域，在進化過程中比較保守； 兩種類型的 FNR 在氨基酸組成、 蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)型方面存在明顯差異， RFNR 比 LFNR有更強的保守性。 FNR 蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明文心蘭 FNR 蛋白都定位于葉綠體。實時熒光定量 PCR分析表明， LFNR 和 RFNR 具有器官表達特異性： LFNR 更多地在葉中表達 ， RFNR 更多地在根中表達；在軟腐病脅迫下 LFNR 下調(diào)響應(yīng)， RFNR 上調(diào)響應(yīng)；兩種類型的 FNR 在鹽脅迫以及高溫脅迫處理時上調(diào)響應(yīng)，但 RFNR 響應(yīng)較快且強度更大； LFNR 和 RFNR 在水楊酸（ salicylic acid， SA）處理時輕微波動，茉莉酸甲酯（ methyl jasmonate， MeJA）處理時呈現(xiàn)單峰反應(yīng)。文心蘭兩種類型的 FNR 基因在不同類型的脅迫中顯示相似的和有區(qū)別的表達特性，表明其具有不同的脅迫響應(yīng)分子機理。 關(guān)鍵詞： 文心蘭；鐵氧還蛋白氧化還原酶；脅迫；亞細(xì)胞定位；基因表達 中圖分類號： S 682.3 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 11-2164-13 Cloning and Subcellular Localization of RFNR and the Mechanisms of Stress Induced Response of RFNR and LFNR in Oncidium LI Rong1， WU Xiaopei1， WANG Xuejing1， CHEN Yukun1， GUO Rongfang1， LIN Yuling1， LAI Zhongxiong1,*， and XUHAN Xu1,2,*（1Institute of Horticulture of Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China；2Institut de la Recherche Interdisciplinaire de Toulouse， Toulouse， 31300， France） Abstract： Two types of FNR genes（ Root-type Ferredoxin-NADP+oxidoreductase， RFNR and Leaf-type Ferredoxin-NADP+oxidoreductase， LFNR） were cloned from Little Cherry Oncidium. The bioinformatics analysis showed that they both belonged to the FNR-like super-family with flavin adenine dinucleotide（ FAD） and nicotinamide adenine dinucleotide（ NAD） functional domains and they were 李 蓉，吳曉佩，王雪晶，陳裕坤，郭容芳，林玉玲，賴鐘雄，徐 涵 . 文心蘭 RFNR 的克隆、亞細(xì)胞定位及其與 LFNR 不同的脅迫響應(yīng)機制研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 2165 conservative in the evolution process， but exhibited significant differences in the composition of amino acids， protein structure and configurations. The RFNR was more conservative than LFNR. The results of FNR protein localization showed their encoded proteins were found mainly in the chloroplasts. The real-time fluorescence quantitative PCR expression analysis showed that LFNR and RFNR had organ-specific expression， i.e. LFNR was mainly in the leaf and RFNR in the root. The soft rot induced the down-regulation of LFNR gene and the up-regulation of RFNR gene. Both LFNR and RFNR showed up-regulation in response to the treatments of high salt concentration and high temperature and RFNR showed more quickly and higher levels of response， as well as both responded slightly to salicylic acid（ SA） treatment. When treated with methyl jasmonate（ MeJA） ， both LFNR and RFNR exhibited single-peak expression. There were similar and different expression characteristics under various stress conditions in two types of FNR in Oncidium， which implied different molecular mechanisms in responding to different stresses. Keywords： Oncidium； FNR（ Ferredoxin-NADP+ oxidoreductase） ； stress； subcellular localization；gene expression 鐵氧還蛋白氧化還原酶（ ferredoxin-NADP+oxidoreductase， FNR）在藻類和高等植物的質(zhì)體中廣泛存在（楊超 等， 2014） ，第 1 個 FNR 基因是從豌豆類囊體中分離到的（耿麗華， 2004） 。 FNR有一個非共價結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸（ FAD）作為輔基，催化鐵氧還蛋白（ Ferredoxin， Fd）和NAD（ P） H 之間的可逆電子轉(zhuǎn)移 （ Mulo， 2011） 。 FNR 具有 FAD 結(jié)合域以及 NADP+結(jié)合位點 （ Mulo，2011） 。 所有的高等植物有兩種類型的 FNR（ Mulo， 2011） ， 分別為 LFNR（ Leaf-type Ferredoxin-NADP+oxidoreductase）和 RFNR（ Root-type Ferredoxin-NADP+oxidoreductase） 。在高等植物的葉綠體中，F(xiàn)NR 是線性電子傳遞鏈的最后一步從 Fd 接受電子傳遞給 NADP，為卡爾文循環(huán)提供 NADPH；除 葉綠體外， FNR 也存在于高等植物的其他質(zhì)體中，在氮代謝中發(fā)揮重要作用（ Mulo， 2011） 。 擬南芥中 LFNR 和 RFNR 各有兩個， LFNR1 和 LFNR2 都存在于葉綠體基質(zhì)和類囊體膜中，LFNR1 在類囊體中更豐富，而 LFNR2 在葉綠體基質(zhì)中更豐富， LFNR1 對鐵氧還蛋白的親和力略微高于 LFNR2；而 RFNR1 和 RFNR2 均定位于葉綠體上。擬南芥的相關(guān)研究表明 AtLFNR 功能的喪失會損害植物的自養(yǎng)能力以及光合能力，提示其在植物體內(nèi)電子傳遞過程中發(fā)揮極其重要的作用；而AtRFNR2 對于根系吸收的亞硝酸鹽的還原和解毒至關(guān)重要，從而避免亞硝酸鹽的積累和由此產(chǎn)生的植物生長缺陷（ Hachiya et al.， 2016） 。對水稻中 FNR 基因的研究表明， LFNR 與 RFNR 在初級結(jié)構(gòu)上有 49%的同源性且 RFNR 與水稻抗稻瘟病的防衛(wèi)反應(yīng)密切相關(guān)（耿麗華， 2004） 。 文心蘭（ Oncidium hybridum）是熱帶氣生蘭（ Ye et al.， 2014；吳曉佩 等， 2017） 。文心蘭在苗期極易受到軟腐病危害，在切花盛產(chǎn)期的 4 5 月及 9 11 月，高溫高濕導(dǎo)致的軟腐病帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，提高植株的抗軟腐病能力是育種與栽培的研究目標(biāo)之一（楊學(xué) 等， 2017） 。吳曉佩（ 2017）對文心蘭的研究表明 LFNR 對軟腐病菌以及外源脅迫有顯著響應(yīng)，表明該基因可能在文心蘭響應(yīng)抗逆以及抗軟腐病過程中具有重要作用。 但是文心蘭中 RFNR 與 LFNR 功能有何差異仍需進一步研究。以文心蘭小櫻桃為材料，利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得文心蘭 LFNR 基因序列，并對 RFNR 進行克隆，運用 qPCR 技術(shù)對文心蘭不同組織部位以及脅迫相關(guān)處理下 LFNR 與 RFNR 的表達進行相對定量分析，旨在為 FNR 基因功能的研究提供依據(jù)。 Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2166 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 1 材料與方法 1.1 試驗材料及處理 2017 年 11 月 20 日 2018 年 1 月 20 日進行試驗。 以小櫻桃文心蘭為材料（由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供）進行不同組織部位取樣以及脅迫處理。分別用 0.5 mmol · L-1的 SA 和 0.2 mmol · L-1的 MeJA 噴灑文心蘭葉片，于 0、1、 3、 6、 12、 24 和 48 h 取樣；將文心蘭原球莖分別置于 25 （正常生長溫度） 、 30 、 35 和40 處理 24 h 后取樣；用 250 mmol · L-1的 NaCl 澆灌文心蘭植株，鹽處理 0、 4、 8 和 16 h 后對葉片進行取樣；取 20 L 的 OD600為 0.6 左右的軟腐病菌菌液注射生長一致的 1 年生文心蘭假鱗莖，于 0、 4、 8 和 12 h 取樣。均 3 次重復(fù)。 取上述處理的葉片、原球莖和假鱗莖迅速放入液氮速凍后于 80 冰箱保存?zhèn)溆谩?1.2 總 RNA 的提取及 cDNA 的合成 參考 Trizol（ Invitroigen 公司）試劑盒的方法提取文心蘭健康苗的總 RNA，并用 Thermo 超微量核酸檢測儀測定 RNA 濃度并通過 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的純度和濃度，然后運用GeneRacerTM試劑盒（ TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 用于基因克隆，用 SYBR ExScriptTM（ TaKaRa）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 用于定量 PCR 分析。 1.3 FNR 基因的篩選與克隆 在蘭花網(wǎng)站（ http： /orchidstra2.abrc.sinica.edu.tw/orchidstra2/gridlist.php?lib=OG）搜索關(guān)鍵詞ferredoxin-NADP，選取 root type，獲得 OGTC008364，再以該序列為參考序列，運用 BioEdit 軟件進行本地 BLAST，從文心蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得相似度最高的 1 條序列。 根據(jù)篩選獲得 cDNA 序列運用 DNAMAN6.0 軟件設(shè)計擴增引物 RFNR-F 和 RFNR-R（表 1） ，以文心蘭小櫻桃的 cDNA 為模板進行 PCR 擴增獲得 RFNR 的 cDNA 序列。 PCR 反應(yīng)體系為 25 L： Dream TaqTM Green PCR Master Mix（ 2×） 12.5 L， ddH2O 9.5 L，模板 cDNA 1 L，上、下游引物各 1 L。 PCR 擴增程序為 94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 s， 55 退火 30 s， 72 延伸 45 s， 34 個循環(huán)； 最后 72 延伸 5 min。 獲得的目的片段采用 Gel/PCR Extraction Kit 回收，經(jīng) PMD 18-T 載體連接后轉(zhuǎn)化 Trans-T1 感受態(tài)中進行 TA 克隆，并挑選陽性克隆子進行菌液 PCR，將有目的條帶的菌液送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序。 文心蘭 LFNR 序列（ KX461908.1）由本實驗室克?。▍菚耘?， 2017） ，從 NCBI 數(shù)據(jù)庫下載序列進行比對分析和后續(xù)試驗。 1.4 生物信息學(xué)分析 通過 NCBI Conserved Domain Search（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）進行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用 DNAMAN 6.0 軟件進行序列比對；通過 MEME（ Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitafion ）圣地亞哥超級計算機中心（ SDSC）開發(fā)的一套用來尋找一組相關(guān)的 DNA 序列或者蛋白質(zhì)序列的基序（ motif）的程序在線分析基因的保守 motif，采用 TB tools 對獲得的 motif 進行繪制；采用 MEGA 6.0 鄰位歸并法（ Neighbor joining， NJ）構(gòu)建 FNR 基因系統(tǒng)進化樹。 李 蓉，吳曉佩，王雪晶，陳裕坤，郭容芳，林玉玲，賴鐘雄，徐 涵 . 文心蘭 RFNR 的克隆、亞細(xì)胞定位及其與 LFNR 不同的脅迫響應(yīng)機制研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 2167 利用 ExPASy-ProtParam tool， TMHMM Server 分析蛋白基本理化性質(zhì)、 跨膜結(jié)構(gòu)域 ,； 利用 Signal P4.1Server， NetPhos， COILS， LocTree 3 進行信號肽，磷酸化位點、螺旋卷曲結(jié)構(gòu)、蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測；采用 SOP-MA， SWISS-MODEL 預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)。 1.5 蛋白亞細(xì)胞定位 將 RFNR 的 CDS 序列導(dǎo)入 DNAMAN 6.0 軟件中進行酶切位點分析， 結(jié)果顯示 CDS 區(qū)域不含有Bgl和 Spe這兩個酶切位點。根據(jù) Hieff CloneTMPlus One Step Cloning Kit 說明書合成RFNR-1302-F 和 RFNR-1302-R 引物（表 1） ，通過 PCR 擴增獲得目的基因序列，進行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶。同時，利用限制性內(nèi)切酶 Bgl和 Spe對 pCAMBIA1302 載體進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收獲得線性化的載體，然后參照 Hieff CloneTMPlus One Step Cloning Kit 說明書的體系進行重組反應(yīng)。之后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸肝菌 Trans-T1，進行菌液 PCR，測序以及酶切鑒定后提取質(zhì)粒，采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA 105。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射煙草和文心蘭葉片進行異位以及原位的 RFNR 蛋白亞細(xì)胞定位。 1.6 FNR 基因表達特性分析 運用羅氏 LightCycler 480 儀器， 通過 qPCR 檢測 FNR 基因在不同組織部位以及脅迫相關(guān)處理下的表達情況。根據(jù)熒光定量 PCR 引物設(shè)計原則，設(shè)計 FNR 基因的 qPCR 引物（表 1）以及內(nèi)參基因Actin 的特異性引物 Actin-Q-F 和 Actin-Q-R（表 1） 。采用 SYBR premix Ex TaqTMkit（ TaKaRa）進行 qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為 20 L，其中 2× SYBR 10 L， cDNA 模版 1 L，上、下引物各 0.8 L，ddH2O 7.4 L。反應(yīng)程序為： 95 預(yù)變性 30 s， 95 變性 10 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 15 s， 40次循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用 2-CT法獲得 FNR 基因的相對表達量，采用 SPSS 19.0 對 LFNR 和 RFNR 的表達分別進行差異顯著性分析， ORIGIN 8.5 進行繪圖。 表 1 引物序列 Table 1 List of primers used 用途 Use 退火溫度 / Tm引物名稱 Primer 引物序列 Sequence ORF 驗證 ORF verification 55 RFNR-F GCTAAAGCCTCAAATCACCA RFNR-R CCTCTTTCAGTCCCTCAGCAC 亞細(xì)胞定位 Subcellular localization 55 RFNR-1302-F ACTCTTGACCATGGTAGATCTATGGCGCACTCGTCGGCTT RFNR-1302-R AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTATAAACCTCAACATGCCAT qPCR 60 RFNR-Q-F ACCAGGAGACAAGGTTCAGC RFNR-Q-R ATGTGAGTGGCGGTTGGA qPCR 60 Actin-Q-F GCAACATTGTTCTTAGCGGAGGCT Actin-Q-R TCTTCATGCTGCTTGGTGCAAGTG qPCR 60 LFNR-Q-F AGGGACAGTCAGTTGGTGTG LFNR-Q-R GGCGCACTCCTTTGACTAACT 2 結(jié)果與分析 2.1 文心蘭 FNR 基因的克隆 以文心蘭 小櫻桃 幼苗為材料， 提取 RNA 進行質(zhì)量以及完整度檢測后， 直接反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。以 RFNR 特異性引物 RFNR-F 和 RFNR-R 進行 PCR 擴增， PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增出Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2168 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 圖 1 文心蘭 RFNR 基因 PCR 擴增結(jié)果 Fig. 1 PCR amplification result of RFNR in Oncidium 1 條與預(yù)期目的片段長度相符的條帶（圖 1） 。將目的條帶膠回收后與載體 pMD18-T 連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) Trans-T1，挑取陽性克隆子經(jīng)菌液 PCR 鑒定后進行測序。 測序結(jié)果顯示擴增獲得 RFNR 的 cDNA 長度為 1 505 bp，具有 ATG 為起始密碼子， TAG 為終止密碼子的 1 140 bp 的編碼區(qū)， 共編碼 379 個氨基酸 （圖 2） 。 文心蘭 LFNR 序列（ KX461908.1）由本實驗室克?。▍菚耘澹?2017） ，從 NCBI 數(shù)據(jù)庫下載獲得序列。 圖 2 文心蘭 RFNR 核酸序列以及編碼氨基酸序列 Fig. 2 The nucleic acid and amino acid sequences of RFNR in Oncidium 2.2 文心蘭 FNR 基因生物信息學(xué)分析 保守功能域的分析結(jié)果表明文心蘭兩種類型的 FNR 都屬于 FNR-like 超家族，包含有 FAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和 NAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。將兩種類型 FNR 基因編碼的氨基酸序列進行比對，結(jié)果（圖 3）顯示，文心蘭 LFNR 與 RFNR 編碼氨基酸序列有 42.11%的同源性。 李 蓉，吳曉佩，王雪晶，陳裕坤，郭容芳，林玉玲，賴鐘雄，徐 涵 . 文心蘭 RFNR 的克隆、亞細(xì)胞定位及其與 LFNR 不同的脅迫響應(yīng)機制研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 2169 圖 3 文心蘭 LFNR 與 RFNR 編碼氨基酸序列的同源性分析 Fig. 3 Analysis of homology between LFNR and RFNR genes-encoded amino acid sequences in Oncidium 選取擬南芥、水稻、大豆、玉米、菠蘿、香蕉、鐵皮石斛以及蝴蝶蘭等 8 個物種的 FNR 基因編碼的氨基酸序列進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)文心蘭 FNR 基因與同為蘭科的鐵皮石斛 FNR 基因在進化上保持了較近的親緣關(guān)系，其中 LFNR 基因與擬南芥 LFNR1 親緣關(guān)系更近； RFNR 基因與蝴蝶蘭同源性更強，與擬南芥 RFNR1 和 RFNR2 親緣性無較大差異（圖 4） 。 圖 4 FNR 基因編碼的氨基酸序列聚類分析 Fig. 4 Cluster analysis of FNR genes-encoded amino acid sequences in Oncidium 對兩種類型的 FNR 蛋白質(zhì)的保守 motif 進行分析， 結(jié)果 （圖 5） 所示， 可知兩種 FNR 都有 motif 2、motif 3、 motif 6、 motif 1、 motif 10、 motif 4、 motif 5 這 7 個保守基序；此外， RFNR 都有 motif 7、motif 13、 motif 11 這 3 個保守基序，表明 RFNR 較 LFNR 有更強的保守性。其中，文心蘭中兩種類型 FNR基因編碼氨基酸之間的同源性明顯低于與其他物種的同類型 FNR基因編碼氨基酸的同源性。 Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2170 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 圖 5 FNR 蛋白 motif 分析 Fig. 5 Motif analysis of FNRs proteins 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明， LFNR 和 RFNR 都屬于堿性蛋白，不存在信號肽，因此都不屬于分泌蛋白，都有兩個從外到內(nèi)的跨膜螺旋；但是 RFNR 屬于不穩(wěn)定蛋白，由內(nèi)到外的跨膜螺旋只有兩個，且在 350 400 之間可能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)， LFNR 有 3 個跨膜螺旋，但不會形成卷曲螺旋，磷酸化位點分析結(jié)果顯示 LFNR（ 43）比 RFNR（ 26）有較多磷酸化位點。二級結(jié)構(gòu)分析表明 LFNR由 25.07%的 螺旋， 26.46%的延伸鏈， 5.57% 轉(zhuǎn)角以及 42.90%的無規(guī)則卷曲組成；而 RFNR 蛋白由 24.54%的 螺旋， 24.80%的延伸鏈， 4.22% 轉(zhuǎn)角以及 46.44%的無規(guī)則卷曲組成； FNR 三級結(jié)構(gòu)分析（圖 6）可知兩者三級結(jié)構(gòu)都由兩個亞基組成，但仍存在明顯差異。 圖 6 FNR 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 Fig. 6 Predicted three-dimensional structure of FNR proteins 2.3 文心蘭 RFNR 蛋白的亞細(xì)胞定位 采用 LocTree3 在線網(wǎng)站對文心蘭 RFNR 蛋白亞細(xì)胞定位進行預(yù)測，該蛋白定位在葉綠體，與擬南芥中 RFNR 編碼的蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果一致。 李 蓉，吳曉佩，王雪晶，陳裕坤，郭容芳，林玉玲，賴鐘雄，徐 涵 . 文心蘭 RFNR 的克隆、亞細(xì)胞定位及其與 LFNR 不同的脅迫響應(yīng)機制研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 2171 為驗證其定位，將構(gòu)建好的帶有 RFNR 與 GFP 融合蛋白載體的農(nóng)桿菌注射煙草葉片表皮細(xì)胞，觀察 GFP 的表達情況。結(jié)果（圖 7）顯示，空載體中在整個細(xì)胞中都可以觀察到 GFP 熒光，而RFNR-GFP 融合蛋白主要是在葉綠體中呈明顯的綠色熒光，說明文心蘭 RFNR 蛋白定位于葉綠體。 圖 7 文心蘭 RFNR 蛋白在煙草表皮中亞細(xì)胞定位觀察結(jié)果 a、 e 為 GFP 蛋白的綠色熒光圖像， b、 f 為紫外光下的葉綠體自發(fā)熒光圖像， c、 g 為明場圖像， d、 h 為熒光和明場疊加圖像。 Fig. 7 Subcellular localization of RFNR in tobacco leaf tissue a and e： Green fluorescence of GFP， b and f： Chloroplast autofluorescence under UV radiation， c and g： Bright field， d and h： Merged field. 將 RFNR-GFP 融合蛋白采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射至文心蘭較嫩的葉片中，黑暗共培養(yǎng) 48 h 后取葉片下表皮用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察，結(jié)果（圖 8）顯示，在 488 nm 激發(fā)光下，對照中觀察到微弱而彌散的熒光， RFNR-GFP 在葉綠體中尤其是氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中有較強熒光。 圖 8 文心蘭 RFNR 蛋白在文心蘭表皮中亞細(xì)胞定位觀察結(jié)果 a、 e 為 GFP 蛋白的綠色熒光圖像， b、 f 為紫外光下的葉綠體自發(fā)熒光圖像， c、 g 為明場圖像， d、 h 為熒光和明場疊加圖像。 Fig. 8 Subcellular localization of RFNR in Oncidium leaf tissue a and e： Green fluorescence of GFP， b and f： Chloroplast autofluorescence under UV radiation， c and g： Bright field， d and h： Merged field. Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2172 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 2.4 LFNR 和 RFNR 在文心蘭不同組織部位中的表達分析 以 18Sr 和 Actin 為內(nèi)參基因，分析兩種類型 FNR 基因在文心蘭根、莖、葉和花不同組織部位的基因表達情況，結(jié)果（圖 9）顯示。 LFNR 在根、莖、葉和花中均有表達，根和花中表達量極低，葉中最高，莖中次之。 RFNR 在根、莖、葉和花中都有相對較高的表達量，莖、葉和花中表達量無顯著差異，根中表達量顯著高于其他組織部位。 2.5 水楊酸和茉莉酸甲酯處理下文心蘭LFNR 和 RFNR 的表達分析 在 0.5 mmol · L-1的水楊酸（ SA）誘導(dǎo)下LFNR 和 RFNR 并沒有極為明顯的響應(yīng)，兩者表達量都在本底表達附近輕微波動（圖 10） 。 在 0.2 mmol · L-1的茉莉酸甲酯（ MeJA）誘導(dǎo)下 LFNR 和 RFNR 都呈現(xiàn)明顯的單峰響應(yīng)，兩者都在 6 h 時顯著上調(diào)，其余時間兩者都在本底表達附近波動（圖 11） 。 圖 10 水楊酸處理下文心蘭 LFNR 和 RFNR 的表達 Fig. 10 The expression of LFNR and RFNR gene after SA treatment 圖 11 MeJA 處理下文心蘭 LFNR 和 RFNR 的表達 Fig. 11 The expression of LFNR and RFNR gene after MeJA treatment 2.6 不同脅迫處理下文心蘭 LFNR 和 RFNR 的表達分析 在高溫脅迫處理下， LFNR 和 RFNR 表達整體下調(diào)， LFNR 在 40 時顯著下調(diào)， RFNR在 30 時顯著下調(diào)， RFNR 下調(diào)趨勢較 LFNR明顯（圖 12） 。 在鹽脅迫處理下， LFNR 和 RFNR 的表達呈現(xiàn)相似的趨勢，兩者在脅迫 8 h 內(nèi)顯著上調(diào)，而脅迫 12 h 時，表達量下調(diào)至接近未脅迫處理圖 12 高溫脅迫處理下文心蘭 LFNR 和 RFNR 的表達 Fig. 12 The expression of LFNR and RFNR responding to high temperature stress 圖 9 LFNR 和 RFNR 在文心蘭不同組織中的表達 Fig. 9 The expression of LFNR and RFNR genes in different tissues of Oncidium 李 蓉，吳曉佩，王雪晶，陳裕坤，郭容芳，林玉玲，賴鐘雄，徐 涵 . 文心蘭 RFNR 的克隆、亞細(xì)胞定位及其與 LFNR 不同的脅迫響應(yīng)機制研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (11)： 2164 2176. 2173 時（圖 13） 。 感染軟腐病后， LFNR 基因在感病 4 h 時明顯下調(diào)，之后呈本底表達，而 RFNR 在感病 4 h 時顯著上調(diào)，之后下調(diào)并輕微波動（圖 14） 。 圖 13 高鹽濃度脅迫處理下文心蘭 LFNR 和 RFNR 的表達 Fig. 13 The expression of LFNR and RFNR genes responding to salt stress 圖 14 軟腐病脅迫處理下文心蘭 LFNR 和 RFNR 的表達 Fig. 14 The expression of LFNR and RFNR genes responding to soft rot treatment 3 討論 3.1 文心蘭 RFNR 比 LFNR 保守性更強 FNR 通過將 Fd 的電子轉(zhuǎn)移給 NADP+介導(dǎo)光合作用電子傳遞的最后一步， 產(chǎn)生的 NADPH 參與碳固定、 氮代謝、 脂質(zhì)及葉綠素合成， 并且調(diào)控基質(zhì)氧化還原等一系列的反應(yīng) （ Lintala et al.， 2010） 。PS系統(tǒng)電子受體能量的降低中， FNR 的激活是一個關(guān)鍵的節(jié)點，相關(guān)研究已經(jīng)表明 FNR 基因的失活會引起 ROS 的積累（ Lintala et al.， 2012） 。植物中 FNR 蛋白根據(jù)其功能和定位分為兩大類，一類是存在于光合組織尤其是植物葉片中的 LFNR，另一類是主要存在于非光合組織 RFNR（ Mulo，2011；楊超 等， 2014） 。功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析表明文心蘭中兩種類型的 FNR 都隸屬于 FNR-