園藝學報， 2018， 45 (12)： 2407 2416. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0270； http： /www. ahs. ac. cn 2407 收稿日期 ： 2018 08 02； 修回日期 ： 2018 12 11 基金項目 ： 江西省科技廳重點研發(fā)資助項目（ 20161BBF60040） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： 13507058200163.com） 百合葉尖干枯病病原菌的鑒定、 生物學特性及其對殺菌劑的敏感性研究 曾慧蘭，盧其能，曾鵬遠，李潤根*（宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院園藝系，江西省作物生長發(fā)育調控重點實驗室，江西宜春 336000） 摘 要： 采集龍牙百合（ Lilium brownii var. viridulum）葉尖干枯病典型癥狀的植株進行病原菌分離、純化和回接，結合病菌形態(tài)學特征及其 rDNA-ITS、 LSU、 TUB 和 RPB 基因的序列分析，確定病原菌為高粱附球菌（ Epicoccum sorghinum） 。 探討了病原菌對不同碳源、氮源、 pH、光照和溫度處理等的反應，并采用菌絲生長速率法測定該病原菌對 6 種殺菌劑的敏感性。研究結果表明，最適合菌絲生長的碳源為乳糖，氮源為牛肉浸膏， pH 值為 6，溫度為 25 ，致死溫度為 48 ，全光照條件有利于菌絲生長。在 6種參試殺菌劑中， 啶酰菌胺的抑制作用最強， 半數(shù)效應濃度 （ concentration for 50% of maximal effect， EC50）為 0.011 mg · L-1；嘧霉胺的效果最差， EC50為 2.168 mg · L-1。 關鍵詞： 百合；葉尖干枯病菌；生物學特性；殺菌劑；敏感性 中圖分類號： S 682.2 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 12-2407-10 Identification， Biological Characteristics and Sensitivity of the Causal Pathogen Inducing Leaf Dieback on Lily ZENG Huilan， LU Qineng， ZENG Pengyuan， and LI Rungen*（ Department of Horticulture， College of Life Science and Environmental Resources， Jiangxi Province Key Laboratory of Controlling and Regulating of Crop Growth and Development， Yichun University， Yichun， Jiangxi 336000， China） Abstract： In order to prevent and control the harm effects of leaf dieback of Lilium brownii var. viridulum， diseased plant samples were collected. Isolation and purification of the pathogen were conducted to identify the pathogen. Combining morphological method with molecular identifications of rDNA-ITS， LSU， TUB and RPB genes， the isolated strain was identified as Epicoccum sorghinum. Biological responses of the pathogen to different carbon source， nitrogen source， pH and light treatments also were studied. As a result， the most suitable carbon source was lactose， the most suitable nitrogen source was beef extract， the optimum temperature for the mycelium growth was 25 ， and the mycelium death temperature was 48 ， the optimum pH value for the mycelium growth was 6， the suitable light condition for the mycelium growth was 24 h. At the aspect of sensitivity to six fungicides， the results revealed that the inhibitory effects had significant differences on the mycelium growth of the pathogen. 50% Carbendazim water dispersible granules（ WDG） had stronger inhibitory effect than the others， the Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2408 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. concentration for 50% of maximal effect（ EC50） was 0.011 mg · L-1， 40% pyrimethanil suspending agent had the minimum inhibitory effect， with EC50value 2.168 mg · L-1. Keywords： Lilium brownii var. viridulum； pathogen of leaf dieback； biological characteristics；fungicide； sensitivity 隨著百合種植面積不斷擴大，病蟲危害明顯，防治百合病害是提高百合生產的重要因素之一。百合葉尖干枯病主要危害百合葉片，發(fā)病時葉尖呈深褐色壞死或干枯，并不斷向葉基擴展蔓延。在江西、 安徽、 廣西、 北京等地均有相關病害的報道 （唐祥寧 等， 1997； 汪海洋， 2006； 賁海燕， 2008） ，目前發(fā)生較為普遍且日趨嚴重。引起百合葉尖干枯病的病原菌為百合莖點霉 Phoma lilii 的報道（唐祥寧 等， 1997；汪海洋 等， 2003；汪海洋， 2006）較多，但極少有關附球菌屬的病原菌引起百合葉尖干枯病的報道。 附球菌屬 （ Epicoccum） 是小雙腔菌科 （ Didymellaceae） 的一類重要的植物病原真菌 （臺蓮梅 等，2003；李偉 等， 2011） ，在世界各地均有分布，其寄主范圍廣泛，可侵染農作物、經濟作物、林木、雜草等（ Stokholm et al.， 2016； Liu et al.， 2018） ，引起多種作物如皇竹草、火龍果蘋果、越橘等（練啟仙 等， 2007；王俊麗 等， 2014；侯艷敏， 2016；尉瑩瑩 等， 2017）莖枯、基腐、葉斑、枝枯、果腐等癥狀，嚴重影響了植物的生長和發(fā)育（ Bruton et al.， 1993） 。 本研究中對百合葉尖干枯病的癥狀進行了描述，分離純化了百合生長期葉尖干枯病病原菌，依據(jù)病原菌的形態(tài)學特征和 ITS、 TUB、 LSU、 RPB 基因序列進行了病原菌鑒定，研究了溫度、濕度和pH 對病原菌菌絲生長發(fā)育的影響，進行了該病菌對 6 種殺菌劑的敏感性試驗，以期為該病害的診斷和防治措施的制定提供理論依據(jù)，并篩選出更有效的殺菌劑，提高防治效果。 1 材料與方法 1.1 材料 試驗以龍牙百合（ Lilium brownii var. viridulum）為材料。 2016 年 3 月 25 日于江西省萬載縣白水鄉(xiāng)百合生產基地采集葉尖干枯病發(fā)病植株。 1.2 病原菌的分離與鑒定 采用傳統(tǒng)的組織分離法對病樣進行病原物的分離純化（陸家云， 2001；陳捷， 2007）。將分離得到的菌株在 25 、 12 h（光） /12 h（暗）條件下培養(yǎng) 5 d，挑取尖端菌絲，培養(yǎng)至產生分生孢子，進行單孢純化，并將純化后的菌株保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（ Potato Dextrose Agar， PDA）斜面培養(yǎng)基上， 4 保存。將純化菌株分別置于 PDA、燕麥瓊脂（ Oatmeal Agar， OA）和麥芽汁瓊脂（ Malt Extract Agar， MEA）平板培養(yǎng)基上， 25 培養(yǎng) 7 d，觀察菌落和菌絲形態(tài)及著生情況，在奧林巴斯（北京， BX43）數(shù)碼生物顯微鏡下攝像，并根據(jù)真菌鑒定手冊、中國真菌志等（魏景超， 1979；白金鎧， 2003）進行病原菌的形態(tài)鑒定。 采用改良 CTAB 法提取病原菌基因組 DNA（陳鋒菊 等， 2010）。以相應引物（表 1）擴增菌株 ITS、 LSU、 TUB 和 RPB 的基因序列。反應體系（ 25 L）為： DNA 模板 2 L、 10× Buffer（含 Mg2+）2.5 L、 Taq polymerase（ 5 U · L-1） 0.2 L，引物（ 10 mol · L-1）各 1 L， dNTP（ 10 mmol · L-1）0.4 L， ddH2O 17.9 L。反應程序： 95 預變性 5 min； 95 變性 1 min， 55 退火 30 s， 72 曾慧蘭，盧其能，曾鵬遠，李潤根 . 百合葉尖干枯病病原菌的鑒定、生物學特性及其對殺菌劑的敏感性研究 . 園藝學報， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2409 延伸 80 s， 35 個循環(huán)； 72 延伸 10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將序列提交到 NCBI/GenBank 獲得基因登錄號。 測序結果在 NCBI、 Mycobank（ http： /www.mycobank.org/）和 CBS-KNAW（ http： /www.wester dijkinstitute.nl/）中進行比對，選用近源種建立相關系統(tǒng)發(fā)育樹（ Chen et al.， 2015） ，確定其種類。 表 1 多位點基因所用引物序列 Table 1 Primers for amplication of gene fragments involved in multilocus sequence analysis 基因 引物 序列（ 5 3） Gene Primer Sequence TUB T1 AACATGCGTGAGATTGTAAGT T2 TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG LSU NL1 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG NL4 GTCCGTGTTTCAAGACGG ITS ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG RPB RPB2-xF CGTCGAACAAACACACCAGTC RPB2-xR GGGATGCCCATCTTCATGTC 1.3 Kochs 法則鑒定致病性 根據(jù) Kochs 法則，采用健康的當年生百合葉片進行表面消毒，將分離純化的菌株用 5 mm 的菌餅接種到用梅花針刺傷的傷口上，用無菌脫脂棉進行保濕處理，以無菌 PDA 培養(yǎng)基餅塊作為對照，重復 3 次。置于 25 恒溫培養(yǎng) 7 d（相對濕度 80% 90%）后觀察發(fā)病情況，選取出現(xiàn)類似癥狀的葉片進行病原菌的再次分離鑒定。 1.4 百合葉尖干枯病菌生物學特性觀察 不同溫度和 pH 值處理：將直徑 5 mm 的病原菌菌塊接種到馬鈴薯蔗糖瓊脂（ Potato Saccharose Agar， PSA）平板培養(yǎng)基中央，設置 5、 10、 15、 20、 22、 25、 28、 30、 35 等 9 個培養(yǎng)溫度處理。以 PSA 為基礎培養(yǎng)基，用 0.1%的 NaOH 和 HCl 溶液調配 pH 分別為 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、9.0 和 10.0， 25 培養(yǎng)。 不同光照處理：將直徑 5 mm 的病原菌菌塊接種到 PSA 平板中央， 25 培養(yǎng)，光照條件分別為連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、 12 h（光） /12 h（暗） 。 不同碳、氮源處理：以查式（ Czapek）培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以 KNO3為氮源，碳源總質量濃度為 12.63 g · L-1，選擇 6 種碳源：乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉。以蔗糖為碳源，氮源總質量濃度為 0.33 g · L-1，選擇 7 種氮源：牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、硝酸鉀、尿素、氯化銨、硫酸銨。兩種處理均 25 培養(yǎng)。 病原菌菌落致死溫度的測定： 將直徑 5 mm 的病原菌菌塊放置于裝有 1 mL 無菌水的滅菌離心管中，分別置于 40 70 （設置梯度 5 ）的恒溫水浴鍋中處理 10 min（先預熱 1 min）后取出迅速冷卻。將處理過的菌塊置于 PSA 平板培養(yǎng)基中， 25 恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察 7 d。先以 5 梯度確定致死溫度范圍，然后 1 梯度重復以上試驗，確定菌絲致死溫度。 所有處理均設 4 次重復。 Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2410 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 1.5 殺菌劑的室內毒力測定 在初步篩選抑菌的殺菌劑濃度的基礎上，選擇 6 種殺菌劑 50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑（ Water Dispersible Granule， WDG）和 50%咯菌腈可濕性粉劑（ Wettable Powder， WP） ，由瑞士先正達作物保護有限公司提供； 50%異菌脲懸浮劑（ Suspension Concentrate， SC）和 40%嘧霉胺 SC，由拜耳作物科學 （中國） 有限公司提供； 50%啶酰菌胺 WDG， 由巴斯夫歐洲公司提供； 25%啶菌惡唑 SYP-Z048乳油（ Emulsifiable Concentrates， EC） ，由沈陽科創(chuàng)化學品有限公司提供。 對百合葉尖干枯病菌菌絲生長的抑制率在 5% 95%范圍內的 6 個質量濃度 （嘧霉胺和啶菌噁唑稀釋 2 × 103、 5 × 103、 1 × 104、 5 × 104、 1 × 105和 2 × 105倍； 異菌脲、 嘧菌環(huán)胺和咯菌腈稀釋 1 × 104、5 × 104、 1 × 105、 2 × 105、 4 × 105和 6 × 105倍；啶酰菌胺稀釋 5 × 104、 1 × 105、 2 × 105、 4 × 105、6 × 105和 8 × 105倍）進行試驗，分別倒入 3 個直徑為 90 mm 的培養(yǎng)皿內，重復 3 次，以加入滅菌蒸餾水的培養(yǎng)基平板為對照，靜置 30 min 后在平板中央放 5 mm 的菌餅，于 25 下倒置培養(yǎng)，對照處理的菌絲生長直徑大于 60 mm 后，量取各平板中菌落的直徑，計算抑菌率。將抑菌率換算成機率值、藥劑濃度換算成對數(shù)值進行計算（檀根甲和祝建平， 1998；朱茂山 等， 2010）。 利用 SPSS22.0 軟件求出毒力回歸方程、相關系數(shù)和半數(shù)效應濃度（ Concentration for 50% of maximal effect， EC50） 。 2 結果與分析 2.1 病害田間癥狀 百合葉尖干枯病常在百合生長初期發(fā)病。發(fā)病初期，葉尖正面出現(xiàn)黃褐色病斑；隨后向基部擴大增多，病健組織交界處為深褐色，有明顯輪紋， 7 d 左右病斑可擴大成 1 2 cm，圓形或不規(guī)則形。發(fā)病中期病斑可橫跨葉脈，向葉片基部擴大成片。發(fā)病后期，葉片焦枯，整片干枯卷曲。在 3 5月濕度大時，發(fā)病植株葉片正、反面可見白色霉層。植株從基部葉片開始發(fā)病，逐漸上延，嚴重時可整株發(fā)?。▓D 1， A） 。 2.2 病原菌的鑒定 2.2.1 病原菌形態(tài)學鑒定 從百合病葉中分離得到一種絲狀真菌，無其他致病真菌或細菌。 在 PDA 培養(yǎng)基上 25 培養(yǎng) 7 d 后，菌落直徑 67.80 mm，邊緣規(guī)則圓形，菌絲白色，氈狀，致密，菌落無明顯分層，背面顯示有輕微分層（圖 1， D） 。 在 OA 培養(yǎng)基上，菌絲白色，較 PDA 上菌絲更疏松，氈狀，菌落無明顯分層，背面菌落為白色（圖 1， E） 。 在 MEA 培養(yǎng)基上，菌絲白色，氈狀，致密，菌落有較明顯分層，背面菌落為橘紅色，有明顯分層暈圈（圖 1， F） 。 菌落易形成厚垣孢子，大小為（ 5.98 13.33） m ×（ 4.19 7.48） m（圖 1， G） ，分生孢子器近圓形，大小為（ 140.16 231.44） m ×（ 153.12 290.27） m（圖 1， H）。分生孢子呈卵圓形或長橢圓形，無色單胞，大小為（ 0.9 3.0） m × 1.0 m（圖 1， I）。 曾慧蘭，盧其能，曾鵬遠，李潤根 . 百合葉尖干枯病病原菌的鑒定、生物學特性及其對殺菌劑的敏感性研究 . 園藝學報， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2411 圖 1 百合葉尖干枯病的發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征 A：田間發(fā)病植株癥狀； B：病原菌菌塊接種的葉片（ 7 d） ； C：無菌 PDA 塊接種的葉片（ 7 d） ； D F：病原菌在 PDA、 OA 和 MEA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； G：厚垣孢子； H：分生孢子器； I：分生孢子。 Fig. 1 Symptoms of dieback of lily and morphological characteristics of the pathogen A： Natural symptoms of leaf dieback on Lilium brownii var. viridulum； B： Symptoms of lily at 7 d post inoculation of pathogen on the leaf； C： Symptoms of sterilized PDA dices at 7 d post inoculation on the plant； D F： The front and back of the colony morphology on PDA， OA and MEA plate； G： Chlamydospore； H： Pycnidium； I： Conidia. 2.2.2 病原菌分子生物學鑒定 將測序得到的菌株的 LSU、 ITS、 RPB 和 TUB 序列提交到 NCBI/GenBank，獲得基因登錄號 MH633721、 MH633723、 MH638292 和 MH638293。將供試菌株的 LSU、 ITS、 TUB 和 RPB 序列與在 NCBI、 MycoBank 和 CBS-KNAW 上的模式菌株序列進行單獨匹配分析，結果均與 Epicoccum sorghnium 有高度的相似性（表 2） 。同時，選用其近源相關序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2）表明，該病原菌 LSU、 ITS、 RPB、 TUB 與 E. sorghinum 菌種的相關基因均歸為一類。結合形態(tài)學鑒定結果，將該病原菌鑒定為高粱附球菌（ Epicoccum sorghnium） 。 Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2412 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 表 2 病原菌測定基因序列匹配信息 Table 2 The results of identification of the causal organism 基因名稱 Gene 基因登錄號 Genbank No. 參考序列（ NCBI 登錄號） Reference species 相似度 /% Similitary LSU MH633721 Epicoccum sorghinum 28S rDNA（ LT965998） Epicoccum sorghinum genomic DNA sequence contains 28S rRNA gene 100.00 ITS MH633723 Epicoccum sorghinum 菌株 P8 ITS1-5.8S-ITS2-LSU（ KY454467） Epicoccum sorghinum isolate P8 small subunit ribosomal RNA gene， partial sequence； internal transcribed spacer 1， 5.8S ribosomal RNA gene， and internal transcribed spacer 2， complete sequence； and large subunit ribosomal RNA gene，partial sequence 99.82 RPB MH638292 Epicoccum sorghinum RPB2 基因（ LT593087） Epicoccum sorghinum partial RPB2 gene for RNA polymerase II large subunit 2 99.00 TUB MH638293 Epicoccum sorghinum TUB2 基因（ FJ427177） Epicoccum sorghinum partial tub2 gene for beta tubulin 99.13 圖 2 基于 ITS、 LSU、 TUB 和 RPB 序列采用鄰接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig. 2 Phylogenetic tree based on sequences of ITS， LSU， TUB and RPB gene using Neighbor-joining method 2.3 病原菌致病性鑒定 接種 2 d 后葉片可見病斑； 3 d 后開始出現(xiàn)水浸狀腐爛，并密生白色絮狀菌絲， 7 d 后病斑擴大且密生白色絮狀菌絲（圖 1， B） ，而對照則無發(fā)?。▓D 1， C） 。隨著接菌時間的延長，葉尖呈深褐色壞死、干枯，并不斷擴展蔓延。從發(fā)病葉片上再分離的菌株在 PSA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌曾慧蘭，盧其能，曾鵬遠，李潤根 . 百合葉尖干枯病病原菌的鑒定、生物學特性及其對殺菌劑的敏感性研究 . 園藝學報， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2413 株一致，獲得的分離物形態(tài)特征與原接種菌株一致，從對照中沒有分離到相關致病菌，表明所獲得的分離物為百合葉尖干枯病的致病菌。 2.4 病原菌生物學特性 測定結果表明，適宜 E. sorghinum 菌株生長的溫度為 5 35 ，最適生長溫度為 25 ，當溫度 40 時，菌絲體無法正常生長（圖 3， A）；最適宜菌絲體生長的 pH 值為 6（圖 3， B）；該菌在含有乳糖、葡萄糖的查氏培養(yǎng)基上生長狀況好且較一致（表 3）；該菌在含有不同氮源的查氏培養(yǎng)基上生長狀況存在較大差異，在含有牛肉浸膏的培養(yǎng)基上生長最快，且菌絲密實，在含有硫酸銨的培養(yǎng)基上生長最慢（表 3）；連續(xù)光照條件最適宜菌絲體生長，完全黑暗或 12 h/12 h 光照 /黑暗條件下菌絲體也生長較快（表 3）。 圖 3 溫度（ A）和 pH（ B）對病原菌菌絲生長的影響 小寫字母表示 5 d 時樣品間差異顯著（ P < 0.05） ；大寫字母表示 7 d 時樣品間差異顯著（ P < 0.05） 。 Fig. 3 Effects of temperature（ A） and pH（ B） on mycelial growth of Epicoccum sorghnium Values with different small letter mean significant difference（ P < 0.05） at the fifth day observation. And with different capital letter mean extremely significant difference（ P < 0.05） at the seventh day observation. 表 3 不同碳源、氮源和光照處理對病原菌菌絲生長的影響 Table 3 Effects of carbon sources， nitrogen sources and light time on the mycelial growth of Epicoccum sorghnium 因素 Factor 處理 Treatment 菌落直徑 /mm Colony diameter 5 d 7 d 碳源 Carbon source 乳糖 Lactose 49.13 ± 0.51 a 67.90 ± 1.34 a 葡萄糖 Glucose 47.96 ± 0.22 a 66.36 ± 0.58 a 麥芽糖 Maltose 43.60 ± 1.53 b 56.36 ± 0.64 b 蔗糖 Sucrose 42.93 ± 0.93 bc 58.10 ± 0.81 b 果糖 Fructose 41.88 ± 0.64 bc 56.36 ± 0.64 b 淀粉 Starch 40.69 ± 0.99 c 56.50 ± 0.36 b 氮源 Nitrogen source 牛肉浸膏 Beef extract 59.02 ± 0.23 a 72.67 ± 0.81 a 蛋白胨 Peptone 52.42 ± 0.91 b 69.03 ± 1.47 b 酵母提取液 Yeast extract 52.16 ± 0.77 b 69.80 ± 1.01 b 硝酸鉀 Potassium nitrate 50.20 ± 0.84 b 72.92 ± 0.94 a 尿素 Urea 33.95 ± 1.11 c 54.30 ± 0.57 c 氯化銨 Ammonium chloride 33.23 ± 1.06 c 41.03 ± 0.79 d 硫酸銨 Ammonia sulfate 20.24 ± 0.77 d 26.06 ± 0.81 e 光照 Light 24 h 49.94 ± 7.13 a 82.66 ± 0.51 a 12 h 52.03 ± 1.00 a 71.84 ± 0.81 b 0 h 51.99 ± 1.12 a 69.71 ± 0.96 b 注：表中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標準誤（ n = 4） ，數(shù)值后不同字母表示不同處理間差異顯著（ P < 0.05） 。 Note： Values are means ± standard error（ n = 4） . Values with different small letter mean significant difference（ P < 0.05） . Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2414 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 另外， E. sorghinum 菌株經 40 47 水溫 10 min 處理的菌絲在 PSA 培養(yǎng)基上均能繼續(xù)生長，但在 48 、 10 min 和 49 、 10 min 處理的菌絲不再生長。表明該菌菌絲的致死溫度是 48 、 10 min。 2.5 殺菌劑的室內篩選 室內毒力測定結果表明， 6 種藥劑對 E. sorghinum 菌株均有一定的抑制作用。根據(jù)殺菌劑濃度與病原菌菌絲生長程度相關的回歸方程可知，隨著殺菌劑濃度的增加抑制作用增強（表 4） 。根據(jù)EC50可知，不同藥劑之間的抑制作用差異較大。其中啶酰菌胺抑制作用最強， EC50為 0.011 mg · L-1；其次是咯菌腈， EC50為 0.671 mg · L-1；再次是嘧環(huán)菌胺， EC50為 0.966 mg · L-1；嘧霉胺的效果最差，EC50為 2.168 mg · L-1。 由毒力回歸方程（表 4）可知， 50%咯菌腈斜率值最大， 50%異菌脲其次， 50%啶酰菌胺斜率值最小，說明 E. sorghinum 對 50%咯菌腈最敏感，對 50%異菌脲較敏感，而對 50%啶酰菌胺最不敏感。 表 4 不同殺菌劑對病原菌菌絲生長毒性的影響 Table 4 Toxicity of tested fungicides against mycelial growth of Epicoccum sorghnium 殺菌劑 Fungicide 回歸方程 Regression equation 相關系數(shù) Correlation coefficient 半抑制濃度 /（ mg · L-1）EC5040%嘧霉胺懸浮劑 40% pyrimethanil SC y = 1.119x + 4.624 0.984 2.168 50%異菌脲懸浮劑 50% iprodione SC y = 1.639x + 4.670 0.915 1.590 50% 啶酰菌胺水分散粒劑 50% boscalid WDG y = 0.515x + 6.004 0.995 0.011 50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑 50% cyprodinil WDG y = 0.799x + 5.012 0.953 0.966 25%啶菌惡唑乳油 25% pyrisoxazole EC y = 0.859x + 4.926 0.923 1.219 50%咯菌腈可濕性粉劑 50% fludioxonil WP y = 1.854x + 5.321 0.999 0.671 3 討論 通過形態(tài)學及分子生物學的方法對引起龍牙百合葉尖干枯病的病原菌進行研究，鑒定其為高粱附球菌 Epicoccum sorghinum。有研究報道指出，百合葉尖干枯病的病原菌為百合莖點霉 Phoma lilii（唐祥寧 等， 1997）和葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea（賁海燕， 2008），而在本研究中并未分離到這兩類病原菌。本研究中鑒定的龍牙百合葉尖干枯病原菌與上述兩種病原菌均有不同，一方面可能是由于南北氣候和地理位置導致的，葡萄座腔菌（ B. dothidea）引起的百合葉尖干枯病的發(fā)病植株主要采集于北京地區(qū)（賁海燕， 2008） ，本試驗地地處江西，與北京的氣候相異較大。另一方面可能是由于使用了不同的鑒定方法，前期的研究多采用的是傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定法（唐祥寧 等，1997） ，存在著較大的局限性，受人為因素的影響較大，而本研究采用的是形態(tài)學結合分子生物學鑒定方法，相比之前較為準確。 傳統(tǒng)的形態(tài)學是真菌鑒定的基礎，而多基因位點的分析能從 DNA 水平上反映物種的進化水平?，F(xiàn)在對病原真菌的鑒定已經采用系統(tǒng)發(fā)育分析和形態(tài)學相結合的手段進行，多種基因已被證實可以有效對 Epicoccum 屬的真菌進行區(qū)分。本研究中通過分析病原菌的 ITS、 TUB、 LSU 和 RPB 基因序列，結合病原菌的形態(tài)分析，最終鑒定該病原菌為 E. sorghinum，這與 Lima 等（ 2011） 、 Danijela 等（ 2012） 、 Liu 等（ 2018） 、 Jayasiri 等（ 2017） 用 ITS、 TUB、 RPB 和 LSU 鑒定 Epcicoccum 屬內各種真菌的結果一致。 研究病原菌的生物學特性對掌握病害的發(fā)生規(guī)律和提出防治措施具有非常重要的意義。在對百曾慧蘭，盧其能，曾鵬遠，李潤根 . 百合葉尖干枯病病原菌的鑒定、生物學特性及其對殺菌劑的敏感性研究 . 園藝學報， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2415 合葉尖干枯病病菌的生物學特性進行研究時發(fā)現(xiàn)，所分離到的 E. sorghinum 在 PSA 培養(yǎng)基上 25 培養(yǎng)時，菌絲