園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (10)： 2045 2051. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.051-353x.2017-0632； http： /www. ahs. ac. cn 2045 收稿日期 ： 2018 07 28； 修回日期 ： 2018 09 15 基金項(xiàng)目 ： 江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ BE2017412） ；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目 CX（ 16） 1025；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)鏈項(xiàng)目（ KYCYL201501） ；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)重大專項(xiàng)（ KYTZ201401） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： chensmnjau.edu.cn） 切花菊 3 個(gè)品種的飛燕草素苷合成能力分析 于凱麗，吳慧瑩，曲愛愛，王藝光，房偉民，蔣甲福，陳發(fā)棣，陳素梅*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部景觀農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095） 摘 要： 為了評(píng)價(jià)不同切花菊品種花瓣飛燕草素苷合成能力，以 3 個(gè)粉色系切花菊品種為材料，采用飛燕草素前體二氫楊梅素 2 mg · mL-1溶液對(duì)花瓣進(jìn)行離體添加培養(yǎng)，建立菊花飛燕草素苷超高效液相UPLC 分析技術(shù)，并用于菊花花瓣中飛燕草素苷的鑒定。結(jié)果表明，菊花花青苷可采用 0.1 mol · L-1鹽酸甲醇及同體積的 10%甲酸水提取， 0.22 m 膜過濾。通過洗脫條件的優(yōu)化可在 9 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)飛燕草素苷與其他花青苷的分離，當(dāng)飛燕草素在 2.5 40 mg · L-1范圍內(nèi)時(shí)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為 0.997。 3 個(gè)粉色系菊花品種均具有催化二氫楊梅素合成飛燕草素的能力，且飛燕草素含量均在 220 g · g-1FW 以上，表明 3 個(gè)品種均可作為藍(lán)色花色轉(zhuǎn)基因候選品種。 關(guān)鍵詞： 菊花；二氫楊梅素；飛燕草素苷；超高效液相；藍(lán)色花色 中圖分類號(hào)： S 682.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 10-2045-07 Delphinidin Synthesis Ability in Three Cut Chrysanthemum Cultivars YU Kaili， WU Huiying， QU Aiai， WANG Yiguang， FANG Weimin， JIANG Jiafu， CHEN Fadi， and CHEN Sumei*（ College of Horticulture， Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Landscape Agriculture， Ministry of Agriculture， Nanjing 210095， China） Abstract： To evaluate the delphinidin biosynthesis ability of different chrysanthemum varieties， three varieties of pink flowers were employed， and the petals were fed with 2 mg · mL-1DHM. The delphinidin content in DHM fed petals was determined. By optimizing the analysis conditions， we established an effective way of quantitative determination of delphinidin via UPLC. The results showed that anthocyanin of chrysanthemum flowers can be extracted by 0.1 mol · L-1hydrochloric acid methanol， and 10% formic acid in a ratio of 9 1（ v/v） ， and followed by filtering through 0.22 m filter membrane. Through the optimization of elution conditions， delphinium can be separated from other anthocynins within nine minutes. Based on optimized UPLC analysis method， delphinium concentration within 2.5 40 mg · L-1has a good linear relationship with peak area， and the correlation coefficient is 0.997. We found that all the varieties could produce delphinidin when fed with DHM， the contents of delphinidin in three varieties are all over 220 g · g-1FW， inferring the tested varieties are promising host varieties for blue flower genetic modification. Yu Kaili， Wu Huiying， Qu Aiai， Wang Yiguang， Fang Weimin， Jiang Jiafu， Chen Fadi， Chen Sumei. Delphinidin synthesis ability in three cut chrysanthemum cultivars. 2046 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 2045 2051. Keywords： chrysanthemum； dihydromyricetin； delphinidin； ultral high performance liquid chromatography（ UPLC） ； blue flower color 花青素苷是花呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中矢車菊素苷元（ Cyanidin） 、飛燕草素苷元（ Delphinidin） 、天竺葵素苷元（ Pelargonidin） 、芍藥花素苷元（ Peonidin） 、矮牽牛素苷元（ Petunidin）和錦葵素苷元（ Malvidin）為基礎(chǔ)花青素苷元基。迄今，自然界中分離和鑒定的 600 多種花青素苷均由上述 6 種基礎(chǔ)花青素苷衍生而來（ Kong et al.， 2003） 。飛燕草素苷元（ Delphinidin）是藍(lán)色花呈色合成路徑積累的第一類花青素苷，是最關(guān)鍵的基礎(chǔ)色素（ Turnage et al.， 2002； Tanaka et al.， 2010） 。 菊花（ Chrysanthemum morifolium Ramat.）花色豐富，但是缺少藍(lán)色（李鴻漸和邵健文， 1990） 。以往的研究表明，菊花類黃酮 3羥化酶（ F3H）相對(duì)于二氫黃酮還原酶（ DFR）具有過強(qiáng)的底物競(jìng)爭(zhēng)力，能催化柚皮素合成圣草酚，阻斷了二氫勘非醇（ DHK）的合成，使得天竺葵色素苷的合成途徑中斷（ Schwinn et al.， 1993； Nakayama et al.， 1997） 。菊花 DFR 酶的特異底物是二氫槲皮素（ DHQ） ，催化合成的最終代謝產(chǎn)物為矢車菊素（ Nakayama et al.， 1997） 。由于菊花中缺少 F35H基因， 因此不能合成二氫楊梅素 （ DHM） ， 無法合成飛燕草素苷從而缺少藍(lán)色菊花。 Brugliera 等 （ 2013）利用體外 DHM 飼喂試驗(yàn)，從 75 個(gè)菊花品種中篩選出 16 個(gè)能夠催化合成飛燕草素苷的品種，并利用 F35H 基因?qū)Y選出的部分品種進(jìn)行了藍(lán)色花色遺傳改良。 Noda 等（ 2017）報(bào)道，不同物種來源啟動(dòng)子及催化合成藍(lán)色花青苷基因的共同轉(zhuǎn)化可獲得轉(zhuǎn)基因藍(lán)色菊花。本研究通過添加飛燕草素前體 DHM，對(duì)自主選育的 3 個(gè)菊花品種花瓣進(jìn)行離體培養(yǎng)，采用超高效液相色譜（ UPLC）測(cè)定處理后的花瓣中飛燕草素苷含量，分析該品種利用 DHM 合成飛燕草素苷的能力，為藍(lán)色菊花的轉(zhuǎn)基因培育奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 菊花材料及其花色的測(cè)定 供試材料為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)“中國(guó)菊花種質(zhì)資源保存中心”保存的切花菊品種南農(nóng)緋玉 、 QX-087和南農(nóng)宮粉 。于 2013 年 10 月采集處于開放階段（舌狀花成 45°開展，著色完全）的花用作試驗(yàn)材料，每品種 15 朵。 采用英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)的比色卡（ RHSCC）對(duì)選定的 3 個(gè)切花菊品種進(jìn)行花色測(cè)定，確定花色編號(hào)。 1.2 菊花花瓣的二氫楊梅素 （ DHM） 飼喂培養(yǎng) 二氫楊梅素（ DHM）為色譜純，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。參照 Brugliera 等（ 2013）體外 DHM 飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，取處于開放階段的花最外輪舌狀花花瓣，切取中部花瓣，每個(gè)花瓣方片約200 mg，置于玻璃培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入濃度為 2 mg · mL-1的 DHM 溶液 15 mL，浸沒花瓣培養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組加入 15 mL 去離子水。置于 20 、濕度 70%、持續(xù)光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 40 h。每處理設(shè) 3 重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后，用英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡（ RHSCC）對(duì)花瓣進(jìn)行顏色測(cè)定，并拍照記錄。 于凱麗，吳慧瑩，曲愛愛，王藝光，房偉民，蔣甲福，陳發(fā)棣，陳素梅 . 切花菊 3 個(gè)品種的飛燕草素苷合成能力分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (10)： 2045 2051. 2047 1.3 二氫楊梅素 （ DHM） 飼喂花瓣中飛燕草素苷的提取 將經(jīng) DHM 培養(yǎng)和去離子水培養(yǎng)后的花瓣用吸水紙吸干表面水分，稱取 200 mg 花瓣放入研缽，加入 0.1 mol · L-1鹽酸甲醇 2 mL 研磨，轉(zhuǎn)入 2 mL 離心管中，置于冰上避光浸提 30 min 后 12 000 r · min-1離心 10 min，吸取上清液 1 mL，加入等體積的 10%甲酸水（甲酸 水 = 1 9，體積比） ，顛倒混勻，經(jīng) 0.22 m 濾膜過濾， 3 次重復(fù)。 1.4 飛燕草素苷超高效液相色譜測(cè)定 稱取 1 mg 飛燕草素苷標(biāo)準(zhǔn)品 delphinidin chloride， C15H11ClO7， 相對(duì)分子質(zhì)量 338.7， 含量 94.7%，購(gòu)自 ChromaDex（ SA） 公司， 用色譜級(jí)甲醇 （ methanol） 溶解并定容至 10 mL， 制備成 100 mg · L-1的飛燕草母液素苷標(biāo)準(zhǔn)品母液，置于棕色瓶中遮光低溫保存?zhèn)溆谩?取飛燕草素母液 25、 50、 100、 200 和 400 L，用 10%的甲酸水（甲酸 水 = 1 9，體積比）稀釋至 1 mL， 配制成 2.5、 5.0、 10、 20、 40 mg · L-1標(biāo)準(zhǔn)品工作液。采用超高效液相進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)峰面積和飛燕草素苷工作液濃度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，用于菊花飛燕草素苷定量分析。 流動(dòng)相以色譜純乙腈作為 A 相， 10%的甲酸作為 B 相進(jìn)行梯度洗脫： 0 min， 5% B； 1 min， 5% B； 6 min， 30% B； 6.1 min， 5% B； 9 min， 5% B。 高效液相分析采用 Agilent 超高液相色譜儀 （ Acquity UPLC） 進(jìn)行。 色譜柱為 Zorbax Eclipse Plus C18 柱（ Rapid Resolution HT 2.1 mm × 50 mm 1.8-Micron 600Bar） ；柱溫 40 ；檢測(cè)波長(zhǎng)： 530 nm；上樣量： 2.0 L；流速 ： 0.30 mL · min-1?；ㄇ嗨剀諜z測(cè)流動(dòng)相為：流動(dòng)相 A， 100%的乙腈；流動(dòng)相B， 10%的甲酸水（ 1 9，體積比） （褚云霞 等， 2014； Santiago et al.， 2014） 。 將各樣品色譜峰面積的平均值代入飛燕草素苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算測(cè)定樣品液中飛燕草素苷濃度 ， 進(jìn)一步計(jì)算菊花花瓣樣品中所含飛燕草素苷的含量（ g · g-1 FW） 。 2 結(jié)果與分析 2.1 不同菊花品種花瓣 DHM 培養(yǎng)后的花色變化 與對(duì)照相比，經(jīng)飛燕草素苷前體 DHM 培養(yǎng)后 3 個(gè)菊花品種的花瓣顏色均發(fā)生了變化（圖 1） 。 圖 1 去離子水和 DHM 培養(yǎng)后菊花各品種花瓣的顏色變化 Fig. 1 The color change in petal observed after incubation of cut petal segments in water and DHM Yu Kaili， Wu Huiying， Qu Aiai， Wang Yiguang， Fang Weimin， Jiang Jiafu， Chen Fadi， Chen Sumei. Delphinidin synthesis ability in three cut chrysanthemum cultivars. 2048 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 2045 2051. RHSCC 比色分析顯示， 南農(nóng)緋玉去離子水培養(yǎng)的花瓣顏色為 Red-purple N66-D，而 DHM培養(yǎng)的花瓣顏色為 Purple-violet N81-A， QX-087 和 南農(nóng)宮粉 花瓣花色分別由對(duì)照的 Red-purple 72-D 和 Red-purple N74-C 轉(zhuǎn)變?yōu)?Red-purple 72-B 和 Purple N79-C。 2.2 不同菊花品種 DHM 培養(yǎng)后花瓣中飛燕草素苷的含量 飛燕草素苷標(biāo)準(zhǔn)品 UPLC 檢測(cè)顯示其保留時(shí)間為 3.4 3.5 min，同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品 6 次重復(fù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.47%，表明分析條件穩(wěn)定，可用于菊花樣品飛燕草素苷的分析。 對(duì)經(jīng)過 DHM 和去離子水培養(yǎng)的花瓣進(jìn)行 UPLC 分析，檢測(cè)飛燕草素苷含量。如圖 2 所示， 南農(nóng)緋玉 、 QX-087和南農(nóng)宮粉在去離子水（對(duì)照）花瓣中未檢測(cè)到飛燕草素苷，經(jīng) DHM 培養(yǎng)的花瓣中可檢測(cè)到飛燕草素苷，保留時(shí)間分別為 3.453、 3.466 和 3.457 min。 圖 2 南農(nóng)緋玉、 QX-087、南農(nóng)宮粉飛燕草素苷含量的色譜圖 Fig. 2 The dephinidin chromatogram of petal segments of Nannong feiyu , QX-087 and Nannong gongfen chrysanthemums 于凱麗，吳慧瑩，曲愛愛，王藝光，房偉民，蔣甲福，陳發(fā)棣，陳素梅 . 切花菊 3 個(gè)品種的飛燕草素苷合成能力分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (10)： 2045 2051. 2049 根據(jù)飛燕草素苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出飛燕草素苷含量回歸方程為 Y = 56.763X 43.751，相關(guān)系數(shù)為 0.9997（圖 3） 。 圖 3 飛燕草素苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig. 3 Relationship between UPLC peak area and delphinidin concentration 根據(jù)回歸方程計(jì)算出每個(gè)菊花品種經(jīng) DHM 飼喂的花瓣中的飛燕草素苷含量， 南農(nóng)緋玉 、 QX-087、南農(nóng)宮粉分別為（ 441.6 ± 47.4） 、 （ 281.2 ± 19.4）、（ 334.8 ± 44.7） g · g-1 FW（ 表1） 。 表 1 DHM 飼喂后不同品種花瓣中飛燕草素苷含量 Table 1 The concentration of delphinidin in petal segments of different varieties after DHM feeding 品種 Variety 飛燕草素苷含量 /（ g · g-1FW） Concentration of delphinidin南農(nóng)緋玉 Nannong Feiyu 441.6 ± 47.4 aQX-87 281.2 ± 19.4 b南農(nóng)宮粉 Nannong Gongfen 334.8 ± 44.7 b注：不同字母表示鄧肯檢驗(yàn) 5%顯著水平。 Note： Different letters mean significant difference at 0.05 level by Duncans test. 3 討論 超高效液相色譜（ UPLC）是以 1.7 m 的超細(xì)色譜柱填料為核心技術(shù)的新型色譜分離分析技術(shù)（陳佳 等， 2008；楊智勇 等， 2013） ，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。以往 HPLC 測(cè)定單個(gè)樣品花青苷的含量需要 20 60 min（岳喜慶 等， 2010； Zhao et al.， 2013） ，孫翊等（ 2011）通過優(yōu)化洗脫條件將單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間縮短 15 min。本試驗(yàn)中利用 UPLC 對(duì)菊花花瓣飛燕草素苷的快速定量研究，使得單個(gè)樣品分析時(shí)間僅需 9 min，大大提高了檢測(cè)效率。 百合、月季、菊花等不具有 F35H 基因，因而不能催化 DHM 的合成，導(dǎo)致藍(lán)色花色素苷合成受阻，因而花色中缺少藍(lán)色（張萍， 2011；洪艷， 2012） 。百合羅賓娜和東方百合貝尼尼較適宜轉(zhuǎn)入藍(lán)色基因，因其花瓣中矢車菊色素含量少，黃酮醇含量高，液泡 pH 值高（張萍 等， 2010） 。在花色素苷生物合成途徑中， F3H 羥化酶（矢車菊色素形成途徑中的關(guān)鍵酶）與 F35H 羥化酶共同競(jìng)爭(zhēng)作用底物，故當(dāng)矢車菊色素含量低，即 F3H 活性弱時(shí)，導(dǎo)入外源藍(lán)色基因易于合成大量飛燕草色素，形成藍(lán)色花（張萍， 2011） 。 Katsumoto 等（ 2007）在篩選轉(zhuǎn)基因藍(lán)色月季品種時(shí)，沒有選擇深色品種和紅色品種，因?yàn)樗鼈凕S酮醇含量低且 pH 值也很低。也不會(huì)選擇黃色、白色品種，因?yàn)槠鋂u Kaili， Wu Huiying， Qu Aiai， Wang Yiguang， Fang Weimin， Jiang Jiafu， Chen Fadi， Chen Sumei. Delphinidin synthesis ability in three cut chrysanthemum cultivars. 2050 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 2045 2051. 花瓣無法積累花色苷，所以通過視覺主要選擇了粉紅色至紫紅色的品種，然后檢測(cè)其中 169 個(gè)品種中的類黃酮成分以及液泡 pH 值，進(jìn)而選擇適宜轉(zhuǎn)藍(lán)色基因的品種。孫衛(wèi)等（ 2010）以不同花色菊花中最終形成的矢車菊素苷占矢車菊素苷途徑類黃酮量的百分比來衡量矢車菊素苷在代謝流中分配水平的高低發(fā)現(xiàn)，相比于紅、紫、紅紫和墨色菊中，粉色菊花瓣中矢車菊素苷的含量比較低。 Brugliera等（ 2013）采用花瓣圓片添加 DHM 試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)粉紅色品種在添加 DHM 后，花色轉(zhuǎn)換成了淡紫色或紫色，并檢測(cè)到了飛燕草素的合成，表明供試品種的 DFR 具有催化 DHM 的能力，以及具備下游藍(lán)色花色素苷飛燕草素的合成路徑。而深紅色、青銅色、紅色或黃色品種不適合作為選擇受體，暗示著粉紅色的菊花是藍(lán)色花色轉(zhuǎn)基因的適宜受體品種。 本研究中供試粉色品種 南農(nóng)緋玉菊花的花瓣經(jīng) DHM 培養(yǎng)后顏色明顯向藍(lán)紫色 Purple-violet轉(zhuǎn)變，且飛燕草素苷含量較高， QX-087和南農(nóng)宮粉菊花的花瓣經(jīng) DHM 培養(yǎng)后花瓣顏色也變?yōu)榧t紫、紫色系，也檢測(cè)到飛燕草素苷存在，表明供試的 3 個(gè)菊花品種均具有催化 DHM 合成飛燕草素苷的能力。但是不同品種 DHM 培養(yǎng)后花色呈色不同，推測(cè)不同品種促進(jìn)藍(lán)色呈色的因子不同， 或者 DFR 催化 DHM 的能力、 液泡 pH 值高低及輔助金屬離子等存在差異所致 （徐清燏 等， 2004；Yoshida et al.， 2009） 。綜合花瓣顏色變化及花瓣中飛燕草素苷含量分析，認(rèn)為南農(nóng)緋玉為最適宜進(jìn)行藍(lán)色花色關(guān)鍵基因 F35H 轉(zhuǎn)基因的受體品種。 References Brugliera F， Tao G Q， Tems ， Kalc G， Mouradova E， Price K， Stevenson K， Nakamura N， Stacey I， Katsumoto Y， Tanaka Y， Mason J G. 2013. 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