結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)條件優(yōu)化及高代自交 系胚狀體誘導(dǎo)研究 蘇賀楠 韓風(fēng)慶 楊麗梅 莊 木 張揚(yáng)勇 王 勇 李占省 方智遠(yuǎn) *呂紅豪 * （中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081） 摘 要：以25份不同類(lèi)型的結(jié)球甘藍(lán)為試驗(yàn)材料，研究游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中影響胚狀體產(chǎn)生的因素并進(jìn)行了優(yōu)化；同時(shí) 對(duì)結(jié)球甘藍(lán)高代自交系的誘導(dǎo)出胚情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：基因型是影響結(jié)球甘藍(lán)胚狀體產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，參試材料中 有11份（2份一代雜種和9份高代自交系）出胚，其中一代雜種中中甘628出胚率（19.8個(gè)·蕾 -1 ）最高，高代自交系中 01-88出胚率（47.5個(gè)·蕾 -1 ）最高，極顯著高于其他參試材料；花蕾長(zhǎng)度3.03.5 mm、花藥長(zhǎng)度花瓣長(zhǎng)度為32至21 時(shí)，處于單核靠邊期的小孢子比例最高，是適合小孢子培養(yǎng)的最佳取樣時(shí)期；初花期和盛花期是理想的取蕾時(shí)期；添加適量 活性炭可以極顯著提高胚誘導(dǎo)率。 關(guān)鍵詞：結(jié)球甘藍(lán)；游離小孢子培養(yǎng)；條件優(yōu)化；高代自交系；胚狀體誘導(dǎo) 株經(jīng)自然加倍或者秋水仙素誘導(dǎo)加倍形成純合的 雙單倍體植株（double haploid，DH）（Yuan et al.， 2015） 。DH群體是進(jìn)行遺傳分析、圖譜構(gòu)建和基因 定位的理想材料，而經(jīng)過(guò)鑒定獲得的優(yōu)良DH系也 為雜交育種提供了良好的材料基礎(chǔ)（孫繼峰 等， 2012；Lv et al.，2014a，2014b；Liu et al.，2017）。 自L(fǎng)ichter首次在油菜中利用小孢子培養(yǎng)獲得單倍 體植株以來(lái)，在隨后的30 a間各國(guó)學(xué)者對(duì)這一技 術(shù)進(jìn)行了深入的研究，并已在多數(shù)十字花科蔬菜 包括大白菜、結(jié)球甘藍(lán)中獲得了胚狀體（Lichter， 1982；Takahata et al.，1991；Verónica et al.，2015； Mukhlesur & Monika，2016）。 在結(jié)球甘藍(lán)中，近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者從基因型 （Takahashi et al.，2012；Shumilina et al.，2015） 、 供體植株的生長(zhǎng)環(huán)境、小孢子發(fā)育時(shí)期（王五宏 等，2013；王玉書(shū) 等，2015）、預(yù)處理?xiàng)l件（張振 超 等，2013；Shmykova et al.，2016）、培養(yǎng)條件（戴 希剛 等，2012） 、植株再生、倍性鑒定及染色體加 倍（程芳芳 等，2015；祁魏崢 等，2015）等方面 對(duì)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究和改進(jìn)，使得一 部分基因型的小孢子出胚率在原有基礎(chǔ)上得到了提 高。然而，結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)仍存在一些問(wèn)題： 頑固難出胚基因型材料依然較多，因而培養(yǎng)條件和 蘇賀楠，女，博士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究，E-mail： 18810835083163.com *通訊作者（Corresponding authors） ：方智遠(yuǎn)，男，院士，研究員，博 士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜遺傳育種研究，E-mail：fangzhiyuancaas. cn；呂紅豪，男，助理研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究，E-mail： lvhonghaocaas.cn 收稿日期：2017-12-21；接受日期：2018-02-06 基金項(xiàng)目 ： 國(guó) 家 重 點(diǎn) 研 發(fā) 計(jì) 劃 項(xiàng) 目（2017YFD0101804， 2016YFD0100204），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS- ASTIP-IVFCAAS），大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（nycytx-35-gw01） 結(jié)球甘藍(lán)（ Brassica oleracea L. var. capitata L.）是世界各地廣泛種植的十字花科蕓薹屬蔬菜 作物，在我國(guó)的年栽培面積已達(dá)到90萬(wàn)hm 2 （楊 麗梅 等，2016） 。結(jié)球甘藍(lán)具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)， 目前生產(chǎn)上的主栽品種幾乎均為一代雜種，雜交育 種已成為結(jié)球甘藍(lán)育種的主要方式（楊麗梅 等， 2003） 。培育一代雜種，首先要獲得遺傳穩(wěn)定的高 代自交系，傳統(tǒng)育種需要78 a的時(shí)間，而利用小 孢子培養(yǎng)可以在2 a內(nèi)獲得純合的育種材料，加速 自交系的選育過(guò)程；同時(shí)，隱性性狀易于表達(dá)，豐 富了育種資源。 游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是在花藥培養(yǎng)的基礎(chǔ)上 發(fā)展而來(lái)的一種單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，減少了花藥壁 和絨氈層對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響，培養(yǎng)出的單倍體植 30 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲(chóng)防控 30 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（4）：30 - 36 體系仍有待優(yōu)化；研究材料大多集中在一代雜種 上，關(guān)于高代自交系出胚的研究很少，因而利用差 異大的高代自交系材料構(gòu)建群體、挖掘出胚相關(guān)基 因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。 本試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)25份結(jié)球甘藍(lán)材料的花蕾長(zhǎng) 度及形態(tài)參數(shù)、花期和活性炭等影響小孢子胚狀體 發(fā)生因素和雄配子發(fā)育過(guò)程進(jìn)行研究，進(jìn)一步優(yōu)化 小孢子培養(yǎng)體系；對(duì)高代自交系進(jìn)行小孢子培養(yǎng)， 篩選出胚率差異較大的親本材料，為下一步構(gòu)建分 離群體、挖掘出胚率相關(guān)基因和相關(guān)分子機(jī)制奠定 基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 參試材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘 藍(lán)青花菜課題組提供的25份結(jié)球甘藍(lán)材料，包括 一代雜種5份、高代自交系20份，材料名稱(chēng)及類(lèi) 型詳見(jiàn)表1。 2016年8月20日在本所試驗(yàn)基地大棚內(nèi)穴盤(pán) 播種育苗，11月10日將半成株囤到陽(yáng)畦越冬春化， 2017年2月25日定植到日光溫室中，常規(guī)栽培管 理；2017年4月上旬至5月上旬花期取材培養(yǎng)。 1.2 小孢子分離與培養(yǎng) 小孢子的分離與培養(yǎng)參照袁素霞（2009）和 呂紅豪（2011）的方法并加以改進(jìn)。 取材：分 別取長(zhǎng)度為3.03.5 mm的花蕾，先用70%酒精滅 菌30 s，再用7%次氯酸鈉滅菌12 min，無(wú)菌水清 洗3次，每次3 min。 游離：把滅過(guò)菌的花蕾放 入10 mL玻璃試管內(nèi)，加入少量經(jīng)高溫高壓滅菌的 B5培養(yǎng)基（購(gòu)自Phytotechnology Laboratories）后研 磨，使小孢子游離出來(lái)，用孔徑45 m的尼龍篩 網(wǎng)過(guò)濾到離心管中。再添加適量B5培養(yǎng)基，800 r·min -1 離心5 min，棄上清液；重復(fù)3次。加入適 量經(jīng)抽濾滅菌的NLN培養(yǎng)基（購(gòu)自Phytotechnology Laboratories，pH=5.9），用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整小孢子 懸浮液濃度為1×10 5 個(gè)·mL -1 。 培養(yǎng)：將小孢 子懸浮液分裝進(jìn)規(guī)格為60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿 中， 每個(gè)培養(yǎng)皿3 mL， 加入1滴經(jīng)高溫高壓滅菌的0.5 g·L -1 活性炭，封口并在黑暗條件下32 熱激24 h， 隨后在25 、黑暗條件下培養(yǎng)。 出胚：經(jīng)過(guò)21 d左右，小孢子出胚，統(tǒng)計(jì)出胚率（個(gè)·蕾 -1 ）。 每 份材料設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。 1.3 花蕾形態(tài)參數(shù)與游離小孢子發(fā)育時(shí)期的關(guān)系 以01-88為試驗(yàn)材料觀察結(jié)球甘藍(lán)花粉配子 體發(fā)育過(guò)程。選取不同長(zhǎng)度（2.5、3.0、3.5、4.0、 5.0 mm）的花蕾放入FAA固定液中，32 h之后進(jìn) 行石蠟切片，觀察花粉配子體發(fā)育過(guò)程。 脫水： 50%、70%、85%、95%、100%乙醇，處理時(shí)間分 別為0.5 h、0.5 h、0.5 h、0.5 h、20 min。 透明： 將脫水后的材料依次置于1/2二甲苯+1/2無(wú)水乙 醇、純二甲苯、純二甲苯中，處理時(shí)間分別為0.5 h、1.0 h、0.5 h。 透蠟：將透明好的材料放入少 量二甲苯，加入石蠟蠟屑，放入37 恒溫箱，過(guò) 夜，敞口放置，使其中的二甲苯慢慢揮發(fā)。 換蠟： 第2天倒出石蠟、二甲苯混合液，在65 烘箱中 進(jìn)行，加入已經(jīng)熔化的純蠟，間隔2 h換1次，共 換2次。 包埋：在60 烘箱中進(jìn)行，將融化的 石蠟倒入預(yù)熱的紙盒內(nèi)，將透好蠟的材料擺放在熔 蠟中，輕輕將蠟盒平移到室溫環(huán)境中，待紙盒內(nèi)底 層蠟稍凝固，用預(yù)熱的鑷子將材料直立整齊地排列 在軟蠟層上，待材料固定不再飄動(dòng)后，將蠟盒平移 到冷水中待完全凝固。 切片：用Leica輪轉(zhuǎn)式切 片機(jī)切片，厚度為10 m。 貼片與烘片：用玻 璃棒輕蘸1小滴粘片劑，涂抹均勻，貼片時(shí)蒸餾水 用量為12滴，烘片臺(tái)溫度設(shè)置為39 。 脫蠟： 把烘干的切片放入二甲苯中，每次5 min，共2次。 甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡照相觀察。設(shè)置3次重 復(fù)，每次選取3個(gè)花蕾。 以中甘628和01-88為試驗(yàn)材料，分別選取 主花序，將花蕾依照長(zhǎng)度（2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mm）分為5個(gè)組別，每個(gè)組別中隨機(jī)選取3個(gè)花 蕾，測(cè)定花蕾長(zhǎng)度，計(jì)算花藥長(zhǎng)度/花瓣長(zhǎng)度的比 值；用小鑷子挑開(kāi)花蕾，小心擠出少量花粉，均勻 鋪平于載玻片上，利用顯微鏡觀察小孢子的發(fā)育時(shí) 期與花蕾長(zhǎng)度的相關(guān)性。 1.4 基因型對(duì)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 在相同適宜條件下（pH值為5.9的NLN培養(yǎng) 基，32 熱激24 h，0.5 g·L -1 的活性炭1滴）對(duì) 25份結(jié)球甘藍(lán)材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，21 d后 統(tǒng)計(jì)出胚率。設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。 1.5 不同花期與游離小孢子培養(yǎng)出胚率的關(guān)系 以中甘628和01-88為試驗(yàn)材料，分別于初 31 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲(chóng)防控 31 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 花期、盛花期和末花期取花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng) （pH值為5.9的NLN培養(yǎng)基，32 熱激24 h，0.5 g·L -1 的活性炭1滴） ，21 d后統(tǒng)計(jì)出胚率。設(shè)置3 次重復(fù)，每次每份材料選取3個(gè)花蕾。 初花期是指主枝的花朵開(kāi)放時(shí)期（3月下旬至 4月上旬） ，盛花期是指大部分側(cè)枝頂部花朵開(kāi)放 時(shí)期（4月上旬至4月下旬） ，末花期指?jìng)?cè)枝花朵 全開(kāi)放至花蕾停止發(fā)育（4月下旬至5月中旬）。 1.6 活性炭濃度對(duì)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 以中甘628和01-88為試驗(yàn)材料，在相同適宜 條件下（pH值為5.9的NLN培養(yǎng)基，32 熱激24 h）分別添加0.25、0.50 g·L -1 活性炭，以不添加 活性炭的處理為對(duì)照，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，21 d 后統(tǒng)計(jì)出胚率。設(shè)置3次重復(fù)， 每處理3個(gè)培養(yǎng)皿。 1.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 利用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。 2 結(jié)果與分析 2.1 基因型對(duì)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的 影響 由表1和圖1可以看出，供試的25份結(jié)球甘 藍(lán)材料中，有11個(gè)基因型產(chǎn)生了胚狀體，都是春 甘藍(lán)圓球類(lèi)型，而秋甘藍(lán)扁球類(lèi)型均未出胚。一 代雜種中，中甘628為最易出胚材料，平均出胚率 高達(dá)19.8個(gè)·蕾 -1 ，極顯著高于其他品種；中甘 828、中甘23、中甘192未有胚狀體產(chǎn)生。在20 份高代自交系中，01-88為最易出胚材料，平均出 胚率高達(dá)47.5個(gè)·蕾 -1 ，極顯著高于其他自交系； 084、96-100-312等11份材料未出胚。 中甘628是高代自交系87-534與SG643的雜 交F 1 ，其出胚率為19.8個(gè)·蕾 -1 ，極顯著高于兩 個(gè)親本自交系的出胚率（0.3、2.6個(gè)·蕾 -1 ）； 中 甘828是高代自交系87-534與96-100-312的雜交 F 1 ，其出胚率為0個(gè)·蕾 -1 ，其親本自交系的出胚 率為0.3、0個(gè)·蕾 -1 。由此可見(jiàn)，不同結(jié)球甘藍(lán)材 料中胚誘導(dǎo)相關(guān)基因的遺傳和分子機(jī)制可能不同。 2.2 花蕾長(zhǎng)度及形態(tài)參數(shù)與結(jié)球甘藍(lán)小孢子發(fā)育時(shí) 期的關(guān)系 由圖2可知：花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂后形成 四分體（圖2-a）；早期小孢子體積增大，顏色加深， 表1 不同基因型對(duì)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 試驗(yàn) 編號(hào) 材料名稱(chēng) 世代 類(lèi)型 出胚率 個(gè)·蕾 -1 2189 中甘628 F 1 春甘藍(lán)圓球型 19.8±4.4 B 2185 中甘21 F 1 春甘藍(lán)圓球型 0.3±0.5 D 2186 中甘828 F 1 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2187 中甘23 F 1 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2188 中甘192 F 1 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2003 01-88 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 47.5±1.9 A 根372 79-156 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 6.3±1.3 CD 根720 16C-720 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 3.5±0.4 CD 2009 01-20 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 3.0±0.5 CD 2026 88-62 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 3.0±0.4 CD 2005 SG643 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 2.6±0.3 CD 2006 15C381 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 2.5±0.4 CD 2029 05C-183 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 1.3±0.2 CD 2014 87-534 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0.3±0.5 CD 2002 084 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2019 96-100-312 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2028 14C552 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2031 04-45-720 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2032 04-45-721 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 根563 HB-1180 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 2034 04-45-796 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 根535 05-570 自交6代以上 春甘藍(lán)圓球型 0 D 203 23202 自交6代以上 秋甘藍(lán)扁球型 0 D 205 8020 自交6代以上 秋甘藍(lán)扁球型 0 D 206 8282 自交6代以上 秋甘藍(lán)扁球型 0 D 注：表中同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著 （P0.01），下表同。 圖1 部分結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚情況 a，01-88；b，79-156；c，87-534；d，中甘23。 細(xì)胞核位于中央，屬于單核早期（圖2-b） ；隨后， 細(xì)胞核移向細(xì)胞壁，花粉萌發(fā)溝清晰可見(jiàn)，此時(shí)呈 不明顯的三棱狀，此階段是單核靠邊期（圖2-c） ； 小孢子細(xì)胞核進(jìn)行1次有絲分裂，形成1個(gè)生殖核 a c d b 32 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲(chóng)防控 32 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 和1個(gè)營(yíng)養(yǎng)核，進(jìn)入雙核期（圖2-d）。 花粉的發(fā)育時(shí)期是影響小孢子最終出胚量的 關(guān)鍵因素之一，花粉發(fā)育時(shí)期的選擇與植株花蕾的 長(zhǎng)度及形態(tài)參數(shù)密切相關(guān)，單核靠邊期即單核晚期 是結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)的最適時(shí)期，此時(shí)小孢子形 態(tài)呈現(xiàn)出不明顯三棱狀。切片后在顯微鏡下觀察結(jié) 球甘藍(lán)不同大小花蕾的花粉細(xì)胞發(fā)育時(shí)期，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同基因型中甘628和01-88表現(xiàn)相似。 由表2可知，當(dāng)花蕾長(zhǎng)度在3.03.5 mm之間、花 藥長(zhǎng)度花瓣長(zhǎng)度為32至21時(shí)，處于單核靠 邊期的小孢子占67%71%，利于游離小孢子培養(yǎng) 出胚。 兩種基因型出胚率最低的取蕾時(shí)期都在末花期，分 別為0.3、0.7個(gè)·蕾 -1 ；初花期和盛花期取蕾的出 胚率極顯著高于末花期，說(shuō)明初花期和盛花期是游 離小孢子培養(yǎng)的適宜時(shí)期。 2.4 活性炭濃度對(duì)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚 率的影響 從表4可以看出，對(duì)兩種不同基因型結(jié)球甘藍(lán) 來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)基中加入0.25、0.50 g·L -1 的活性炭 后，游離小孢子出胚率都極顯著提高，中甘628出 胚率分別達(dá)到12.0、19.8個(gè)·蕾 -1 ，01-88出胚率 分別達(dá)到35.3、47.5個(gè)·蕾 -1 ；兩種不同濃度的活 性炭處理之間游離小孢子出胚率差異未達(dá)極顯著水 平，說(shuō)明適當(dāng)濃度的活性炭可以提高結(jié)球甘藍(lán)小孢 子胚誘導(dǎo)率。 表4 不同濃度活性炭對(duì)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng) 出胚率的影響 活性炭濃度/g·L -1 出胚率/個(gè)·蕾 -1 中甘628 01-88 0（CK） 1.0±0.2 B 6.0±0.7 B 0.25 12.0±1.1 A 35.3±2.3 A 0.50 19.8±3.8 A 47.5±1.7 A 3 結(jié)論與討論 游離小孢子培養(yǎng)是提高育種效率、豐富育種資 源的重要手段，獲得的DH群體也是進(jìn)行遺傳分析、 圖譜構(gòu)建和基因定位的理想材料。近年來(lái)，結(jié)球甘 藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)取得了較大進(jìn)展，但仍存在 一些問(wèn)題，如培養(yǎng)體系不夠完善、胚誘導(dǎo)的相關(guān)分 子機(jī)制尚不明確等，阻礙了小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種 中的進(jìn)一步應(yīng)用。 在培養(yǎng)體系方面，研究表明影響小孢子培養(yǎng)成 胚的關(guān)鍵因素包括基因型、取蕾時(shí)期、活性物質(zhì)等。 基因型是影響小孢子培養(yǎng)出胚的關(guān)鍵因素，不同基 因型之間出胚率差異較大，供體植株的基因型不僅 影響小孢子的產(chǎn)胚率，而且也影響胚的質(zhì)量（王超 楠 等，2010；顧祥昆 等，2013） 。以往有關(guān)研究著 重介紹了一代雜種的出胚率，桑玉芳等（2007）比 較分析了19個(gè)結(jié)球甘藍(lán)一代雜種游離小孢子的出 胚情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出胚率1個(gè)·蕾 -1 的品種只有 10個(gè)；關(guān)于自交系材料研究較少，楊安平等（2009） 分別用25份結(jié)球甘藍(lán)F 1 及其50份親本，產(chǎn)胚困 圖2 01-88花粉配子體發(fā)育途徑 a，配子體時(shí)期；b，單核早期；c，單核靠邊期；d，雙核早期。 表2 結(jié)球甘藍(lán)不同長(zhǎng)度花蕾中單核靠邊期小孢子的比例 花蕾長(zhǎng)度/mm 花藥長(zhǎng)度花 瓣長(zhǎng)度 單核靠邊期比例/% 中甘628 01-88 2.5 2.51 40 A 40 A 3.0 21 67 B 71 B 3.5 32 68 B 70 B 4.0 2.52 60 B 62 B 5.0 23 40 A 40 A 表3 取蕾時(shí)期對(duì)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響 取蕾時(shí)期 出胚率/個(gè)·蕾 -1 中甘628 01-88 初花期 19.8±3.8 A 20.0±0.7 AB 盛花期 7.0±0.7 AB 47.5±1.7 A 末花期 0.3±0.1 C 0.7±0.1 C 2.3 不同花期對(duì)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率 的影響 由表3可知，兩種不同基因型的結(jié)球甘藍(lán)出胚 率最高時(shí)的取蕾時(shí)期不同，其中一代雜種中甘628 在初花期的出胚率最高，達(dá)19.8個(gè)·蕾 -1 ，自交系 01-88在盛花期的出胚率最高，達(dá)47.5個(gè)·蕾 -1 ； a c d b 33 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲(chóng)防控 33 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 難的22份結(jié)球甘藍(lán)F 1 及其相應(yīng)的F 2 ，1份產(chǎn)胚能 力強(qiáng)的結(jié)球甘藍(lán)與22份產(chǎn)胚困難材料的正、反交 后代，在同等條件下進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié) 球甘藍(lán)F 1 較其親本產(chǎn)胚能力強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)胚困難的結(jié) 球甘藍(lán)F 1 ，以其F 2 為試材可誘導(dǎo)產(chǎn)胚或提高胚產(chǎn) 量，用產(chǎn)胚能力強(qiáng)的結(jié)球甘藍(lán)作親本與產(chǎn)胚困難的 材料雜交，正、反交均能明顯提高產(chǎn)胚困難材料 的產(chǎn)胚能力。本試驗(yàn)以25份不同基因型結(jié)球甘藍(lán) 為試材（其中有20份高代自交系） ，在相同適宜培 養(yǎng)條件下進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有11 個(gè)基因型（2份一代雜種和9份高代自交系）產(chǎn)生 了胚狀體，且不同材料之間小孢子出胚率差異顯 著，中甘628的出胚率極顯著高于兩個(gè)親本自交系 87-534與SG643，可見(jiàn)以產(chǎn)胚率較高的結(jié)球甘藍(lán)作 親本與產(chǎn)胚困難的材料雜交，能明顯提高雜交后代 的產(chǎn)胚能力，這與前人的研究結(jié)果相似。 在十字花科蔬菜花藥和游離小孢子培養(yǎng)中，單 核期和雙核早期通常認(rèn)為是小孢子最適培養(yǎng)的時(shí)期 （星曉蓉，2011） ，而不同花蕾的大小對(duì)應(yīng)著小孢 子不同的發(fā)育時(shí)期，選擇最佳花蕾長(zhǎng)度非常關(guān)鍵。 因此，本試驗(yàn)采用石蠟切片技術(shù)對(duì)結(jié)球甘藍(lán)配子體 發(fā)育進(jìn)行了詳細(xì)觀察，分別觀察到四分體時(shí)期、單 核早期、單核晚期、雙核期，并明確了關(guān)鍵時(shí)期（單 核期和雙核早期）與花蕾長(zhǎng)度和花藥、花瓣長(zhǎng)度比 值之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，為選取取樣最適時(shí)期的花蕾提 供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)。曾愛(ài)松等（2015）利用DAPI染 色對(duì)甘藍(lán)花粉發(fā)育途徑進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)6個(gè)品種 的花蕾長(zhǎng)度基本在3.54.5 mm范圍內(nèi)處于單核靠 邊期的小孢子比例最高。本試驗(yàn)對(duì)2個(gè)易出胚的甘 藍(lán)材料進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)花蕾長(zhǎng)度在3.03.5 mm之 間，且花藥長(zhǎng)度花瓣長(zhǎng)度為32至21時(shí)，處 于單核靠邊期的小孢子比例最高，該結(jié)果中適宜的 花蕾長(zhǎng)度較前人研究中的稍短，可能與基因型不同 有關(guān)。 取蕾時(shí)期也是影響結(jié)球甘藍(lán)小孢子出胚率的重 要因素之一。馮輝等（2007）對(duì)羽衣甘藍(lán)的研究發(fā) 現(xiàn)，盛花期是最適宜的取蕾時(shí)期；曾愛(ài)松等（2010） 研究認(rèn)為，結(jié)球甘藍(lán)取蕾時(shí)期對(duì)易出胚和難出胚的 材料影響不一致，對(duì)于易出胚材料，花期對(duì)胚胎發(fā) 生影響不大，出胚率都基本穩(wěn)定，對(duì)于難出胚材料， 開(kāi)花初期至盛花中期取樣培養(yǎng)易獲得成功，而末花 期很少有胚狀體產(chǎn)生。本試驗(yàn)利用2個(gè)易出胚基因 型進(jìn)行花期對(duì)小孢子培養(yǎng)出胚率影響的研究，結(jié)果 表明2個(gè)基因型出胚率最高的花期不同，一代雜種 中甘628在初花期出胚率最高，達(dá)19.8個(gè)·蕾 -1 ， 高代自交系01-88在盛花期出胚率最高，達(dá)47.5 個(gè)·蕾 -1 ，二者出胚率最低時(shí)期一致。 在培養(yǎng)基中添加一些活性成分會(huì)影響小孢子的 產(chǎn)胚能力。蔣武生等（2008）在大白菜游離小孢子 培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)添加活性炭（0.5 mg·L -1 ）較未添加活 性炭的對(duì)照培養(yǎng)效果好，兩個(gè)處理小孢子胚誘導(dǎo)率 相差417倍；韓陽(yáng)等（2006）在大白菜游離小孢 子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)100、200 mg·L -1 活性炭對(duì)大白菜小 孢子的胚胎發(fā)生有抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，加 入0.25、0.50 g·L -1 活性炭均有利于結(jié)球甘藍(lán)胚狀 體發(fā)生，這可能與活性炭能吸附培養(yǎng)過(guò)程中的部分 有害物質(zhì)有關(guān)。 目前，關(guān)于小孢子培養(yǎng)出胚相關(guān)分子機(jī)制的研 究很少，Malik等（2007）通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)從 甘藍(lán)型油菜0 h（晚無(wú)核到早期雙核小孢子）、3 d（32 熱激處理誘導(dǎo)小孢子） 、5 d（分裂小孢子）和7 d （胚性小孢子）小孢子中分離出來(lái) LEC1、LEC2、 BBM，這3個(gè)基因在小孢子胚胎形成時(shí)起著重要的 作用。Kitashiba等（2016）利用高出胚大白菜品種 Ho-Me和低出胚大白菜品種CR-Seiga構(gòu)建小孢子 群體，利用偏分離確定與小孢子胚胎發(fā)生相關(guān)的基 因位點(diǎn)，確定了3個(gè)與小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量相關(guān)物理 位置。然而在結(jié)球甘藍(lán)中還未見(jiàn)與小孢子胚胎發(fā)生 相關(guān)的基因及分子機(jī)制研究，本試驗(yàn)得到的高、低 出胚自交系材料為下一步開(kāi)展甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)出胚 機(jī)制的研究打下了基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)從基因型、取蕾時(shí)期、活性物質(zhì)等方面 進(jìn)一步探討和優(yōu)化了結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)的條件； 獲得的純合DH系為育種提供了材料；獲得的出胚 率差異大的自交系也為下一步構(gòu)建群體、挖掘胚誘 導(dǎo)相關(guān)基因及分子機(jī)制的研究做好了鋪墊，進(jìn)一步 的工作正在開(kāi)展中。 參考文獻(xiàn) 程芳芳，張恩慧，楊安平，程永安，許忠民，董韓，霍柳青.2015. 甘藍(lán)小孢子單倍體植株加倍技術(shù)探討.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué) 報(bào)：自然科學(xué)版，43（6）：167-173. 戴希剛，施雪萍，包滿(mǎn)珠.2012.基因型與培養(yǎng)條件對(duì)羽衣甘藍(lán)小 34 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲(chóng)防控 34 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 孢子胚胎發(fā)生的影響.植物生理學(xué)報(bào)，48（11） ：1113-1119. 馮輝，姜鳳英，馮建云，王超楠.2007.羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng) 技術(shù)研究及應(yīng)用.園藝學(xué)報(bào)，34（4）：1019-1022. 顧祥昆，李菲，張淑江，章時(shí)蕃，張慧，孫日飛.2013.芥菜游離 小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究.中國(guó)蔬菜，（12）：23-30. 韓陽(yáng)，葉雪凌，馮輝.2006.大白菜小孢子培養(yǎng)影響因素研究.中 國(guó)蔬菜，（7）：16-18. 蔣武生，姚秋菊，張曉偉，原玉香，耿建峰.2008.活性炭和振 蕩培養(yǎng)對(duì)提高大白菜胚誘導(dǎo)率的影響.中國(guó)瓜菜，21（4） ： 1-3. 呂紅豪.2011.甘藍(lán)枯萎病抗源篩選和抗性遺傳研究碩士論 文.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. 祁魏崢，頡建明，郁繼華，康俊根.2015.甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及 再生植株倍性鑒定研究.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，28（6）：2381-2388. 桑玉芳，張恩慧，楊安平，馬超，許忠民，程永安，白延紅.2007. 甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中影響胚狀體形成的主要因素.西北農(nóng) 業(yè)學(xué)報(bào)，16（2）：125-129. 孫繼峰，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，劉二艷，袁素霞，李占省，楊麗梅，莊 木，張揚(yáng)勇，孫培田.2012.青花菜相同親本的DH與F 2 群 體遺傳多樣性的比較.園藝學(xué)報(bào)，39（6）：1090-1098. 王超楠，聞鳳英，劉曉暉，羅智敏，趙冰.2010.球莖甘藍(lán)小孢子 培養(yǎng)中影響胚誘導(dǎo)的幾個(gè)因素.中國(guó)蔬菜，（10）：35-39. 王五宏，葉國(guó)銳，李必元，岳智臣，鐘新民.2013.結(jié)球甘藍(lán)小孢 子胚誘導(dǎo)與植株再生.核農(nóng)學(xué)報(bào)，27（6）：715-722. 王玉書(shū)，王歡，范震宇，馮輝.2015.觀賞羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)及 再生植株倍性變異.核農(nóng)學(xué)報(bào)，29（6）：1037-1043. 星曉蓉.2011.白菜型油菜小孢子培養(yǎng)成胚率及植株再生的影響因 素.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，20（7）：94-97. 楊安平，張恩慧，尚麗榮，朱守亮，李宏偉，許忠民，白延紅. 2009.結(jié)球甘藍(lán)F 1 、F 2 、雙交種及其親本的游離小孢子胚胎發(fā) 生能力分析.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，37（8） ： 171-176. 楊麗梅，方智遠(yuǎn)，劉玉梅，莊木，張揚(yáng)勇，孫培田.2003.利用小 孢子培養(yǎng)選育甘藍(lán)自交系.中國(guó)蔬菜，（6）：36-37. 楊麗梅，方智遠(yuǎn)，莊木，張揚(yáng)勇，呂紅豪，劉玉梅，李占省. 2016. “十二五”我國(guó)甘藍(lán)遺傳育種研究進(jìn)展.中國(guó)蔬菜， （11）：1-6. 袁素霞.2009.甘藍(lán)和青花菜小孢子培養(yǎng)及早期胚胎形成相關(guān)基因 差異表達(dá)分析博士論文.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. 曾愛(ài)松，馮翠，高兵，宋立曉，嚴(yán)繼勇.2010.結(jié)球甘藍(lán)小孢子培 養(yǎng)技術(shù)體系的優(yōu)化研究.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，25（S2）：40-44. 曾愛(ài)松，高兵，宋立曉，張?jiān)葡?，李健綺，嚴(yán)繼勇.2015.耐 寒結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)及其發(fā)育過(guò)程.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 20（2） ：86-92. 張振超，耿鑫鑫，戴忠良，潘躍平，王兵，許玲，顏志明，周偉軍. 2013.甘藍(lán)類(lèi)植物小孢子培養(yǎng)及植株再生研究.核農(nóng)學(xué)報(bào)，27 （7）：929-937. Kitashiba H，Taguchi K，Kaneko I，Inaba K，Yokoi S J，Takahata Y，Nishio T.2016.Identification of loci associated with embryo yield in microspore culture of Brassica rapa by segregation distortion analysis.Plant Cell Report，35（10）：2197-2204. Lichter R.1982.Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus.Zeitschrift Für Pflanzenphysiologie，105（5） ： 427-434. Liu X，Han F Q，Kong C C，F(xiàn)ang Z Y，Yang L M，Zhang Y Y，Zhuang M， Liu Y M，Li Z S，Lv H H.2017.Rapid introgression of the Fusarium wilt resistance gene into an elite cabbage line through the combined application of a microspore culture，genome background analysis，and disease resistance-specific marker assisted selection.Frontiers in Plant Science，8：1-11. Lv H H，Wang Q B，Zhang Y Y，Yang L M，F(xiàn)ang Z Y，Wang X W， Liu Y M，Zhuang M，Lin Y，Yu H L，Liu B.2014a.Linkage map construction using InDel and SSR markers and QTL analysis of heading traits in cabbage.Molecular Breeding，34：87-98. Lv H H，Wang Q B，Yang L M，F(xiàn)ang Z Y，Zhuang M，Zhang Y Y， Sun P T.2014b.Breeding of cabbage（Brassica oleracea L. var. capitata）with Fusarium wilt resistance based on microspore culture and marker-assisted selection.Euphytica，200（3）：465-473. Malik M R，Wang F，Dirpaul J M，Zhou N，Polowick P L，F(xiàn)errie A M R，Krochko J E.2007.Transcript profiling and identification of molecular markers for early microspore embryogenesis in Brassica napus.Plant Physiology，144（1）：134-154. Mukhlesur R，Monika M.2016.Behind the scenes of microspore-based double haploid development in Brassica napus：a review.Journal of Plant Science & Molecular Breeding，5（1）：1-9. Shmykova E，Shumilina T，Suprunova P.2016.Doubled haploid production in Brassica L. species.Russian Journal of Genetics Applied Research，6（1）：68-77. Shumilina N，Shmykova L，Bondareva T.2015.Effect of genotype and medium culture content on microspore-derived embryo formation in Chinese cabbage（Brassica rapa ssp. chinensis）cv. Lastochka. Biology Bulletin，42（4）：302-309. Takahashi Y，Shuji Y，Yoshihito T.2012.Effects of genotypes and culture conditions on microspore embryogenesis and plant regeneration in several subspecies of Brassica rapa L.Plant Biotechnology Reports，6（4）：297-304. Takahata Y，Brown D，Keller W.1991.Effect of donor plant age and inflorescence age on microspore culture of Brassica napus L. Euphytica，58（1）：51-55. Verónica P V，Patricia C M，Alba R S，Seguí-Simarro J M.2015. Induction of embryogenesis in Brassica napus microspores produces a callosic subintinal layer and abnormal cell walls with altered levels of callose and cellulose.Frontiers in Plant Science，6：1-17. Yuan S X，Su Y B，Liu Y M，Li Z S，F(xiàn)ang Z Y，Yang L M，Zhuang M，Zhang Y Y，Lv H H，Sun P T.2015.Chromosome doubling of microspore-derived plants from cabbage（Brassica oleracea var. capitata L.）and broccoli（Brassica oleracea var. italic L.）. Frontiers in Plant Science，6：1-10. 35 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場(chǎng) 病蟲(chóng)防控 35 研究論文 中 國(guó) 蔬 菜 CHINA VEGETABLES Studies on Optimization of Cabbage Isolated Microspore Culture Conditions and Generation of Embryoids from High-generation Inbred Lines SU He-nan，HAN Feng-qing，YANG Li-mei，ZHUANG Mu，ZHANG Yang-yong，WANG Yong，LI Zhan-sheng，F(xiàn)ANG Zhi-yuan * ，LYU Hong-hao * （Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China） Abstract：Taking 25 different types of cabbage（Brassica oleracea L. var. capitata L.）accessions as material，this paper studied on the factors affecting the generation of embryoids in culturing isolated microspore and conducted optimization.The embryogenesis for high-generation inbred lines was studied as well.The results showed that the donor plant genotype is the key factor affecting embryogenesis.Embryoids were induced from 11 accessions among all the tested materials.The highest embryoid inducing rate was 19.8 per bud in the