王 寧 ， 劉 銅 ， 靳亞忠 ， 等 木霉菌對(duì)土壤微生物多樣性及草莓生長和發(fā)病的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2018， 46( 18) : 108 112doi: 1015889/j issn1002 1302201818027木霉菌對(duì)土壤微生物多樣性及草莓生長和發(fā)病的影響王 寧1， 劉 銅2， 靳亞忠2， 咸洪泉1( 1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) ， 山東青島 266109; 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) ， 黑龍江大慶 163319)摘要 : 在草莓苗期施用木霉菌可濕性粉劑后 ， 通過對(duì)土壤微生物基因進(jìn)行高通量測序 ， 研究土壤微生物多樣性變化 。結(jié)果表明 ， 木霉菌對(duì)細(xì)菌的影響主要表現(xiàn)為假單胞菌屬 ( Pseudomonas) 數(shù)量明顯增多 ; 對(duì)真菌的影響主要表現(xiàn)為頭梗霉屬 ( Cephaliophora) 、赤霉菌屬 ( Gibberella) 和毛殼菌屬 ( Chaetomium) 數(shù)量明顯減少 ， 四枝孢屬 ( Tetracladium) 數(shù)量明顯增多 ?？傮w看出 ， 施用木霉菌可濕性粉劑對(duì)細(xì)菌多樣性的影響較小 ， 對(duì)真菌多樣性的影響較大 ， 會(huì)使真菌多樣性指數(shù)明顯降低 。此外 ， 施入木霉可濕性粉劑對(duì)草莓植株具有明顯的促生長作用 ， 并對(duì)草莓灰霉病有很好的預(yù)防和治療作用 。關(guān)鍵詞 : 木霉 ; 土壤微生物 ; 多樣性 ; 高通量測序中圖分類號(hào) : S15436; S668401 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 : A 文章編號(hào) : 1002 1302( 2018) 18 0107 05收稿日期 : 2017 03 30基金項(xiàng)目 : 國家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng) ( 編號(hào) : 2014FY120900) ; 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 ( 編號(hào) : 2018GNC110024) ; 山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目 ( 編號(hào) : 2217003) 。作者簡介 : 王 寧 ( 1991) ， 女 ， 山東萊蕪人 ， 碩士研究生 ， 主要從事農(nóng)業(yè)微生物方面的研究 。E mail: ningwang_rain163 com。通信作者 : 咸洪泉 ， 博士 ， 教授 ， 主要從事植物病害生物防治工作 。E mail: hqxian qau edu cn。木霉菌是優(yōu)良的生防真菌 ， 在應(yīng)用真菌防治土傳病害的研究中 ， 應(yīng)用最廣泛的真菌殺菌劑便是木霉菌 1。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是造成土傳病害發(fā)生的主要原因 2 3， 其多樣性高低是衡量土壤健康與否的一項(xiàng)重要指標(biāo) 4。施用木霉菌后 ， 通過對(duì)土壤微生物多樣性產(chǎn)生影響來達(dá)到防治病害 、改良土壤的作用 ， 因此 ， 研究土壤微生物多樣性意義重大 。目前微生物多樣性的研究方法多為活菌培養(yǎng) ， 局限在部分微生物總體數(shù)量研究 ， 對(duì)種類的研究比較少 ， 而土壤中的大多數(shù)微生物是無法進(jìn)行培養(yǎng)的 ， 可培養(yǎng)率只有 0 1% 1 0% 5 6。高通量測序具有無需培養(yǎng) 、能夠客觀還原菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點(diǎn) 7， 近年來 ， 高通量測序技術(shù)不斷發(fā)展 ， 尤其是第二代測序方法 ， 即 Illumina 454 和 SOLiD Ion Torrent 具有諸多優(yōu)點(diǎn) 8 10。這些測序平臺(tái)最大數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高 ， 在土壤微生物多樣性的研究中可以獲得豐富的信息 11 12。因此 ， 筆者試圖通過對(duì)土壤微生物基因組進(jìn)行高通量測序 ， 研究木霉菌施用后對(duì)土壤微生物多樣性的影響 ， 為進(jìn)一步揭示木霉菌和土壤微生物多樣性之間的關(guān)系提供依據(jù) 。1 材料與方法11 試驗(yàn)材料供試菌劑為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的木霉菌可濕性粉劑 ， 棘孢木霉 ( Trichoderma asperellum) 的孢子濃度為 1 ×109CFU/g，草莓品種為紅顏 。12 試驗(yàn)方法121 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在黑龍江省大慶市薩爾圖區(qū)春雷農(nóng)場塑料大棚內(nèi)進(jìn)行 ， 木霉菌可濕性粉劑于苗期施用 。設(shè)木霉菌可濕性粉劑 、對(duì)照 2 個(gè)處理 ， 小區(qū)面積為 002 hm2， 共3 次重復(fù) 。木霉菌可濕性粉劑處理為將木霉菌可濕性粉劑稀釋 300 倍進(jìn)行灌根 ， 灌根量為 300 mL/株 ， 對(duì)照用等體積的水灌根 。灌根時(shí)間為 2016 年 11 月 4 日 ， 21 d 后采用對(duì)角線五點(diǎn)取樣法取草莓根際土 。122 土壤微生物測序 微生物多樣性研究主要基于編碼核糖體 NA 的核酸序列 ， 其中細(xì)菌多樣性研究主要是基于16S rDNA V3 + V4 區(qū) ， 真菌多樣性研究主要基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ITS1 區(qū) 。提取樣品總 DNA， 細(xì)菌 V3 + V4 擴(kuò)增采用的引物如 下 : F， 5' AACTYCTACGGAGGCWG 3' ， 5' GACTACNVGGGTATCTAATCC 3'。真菌 ITS1 擴(kuò)增引物如下 : ZF， 5' AACCTGCGGAAGGATCATT 3' Z， 5' GACCAAGAGATCCTTG 3'。進(jìn)行 PC 擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化 、定量和均一化形成測序文庫 ， 對(duì)于建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢 ， 質(zhì)檢合格的文庫用 Illumina HiSeq 2500 進(jìn)行測序 。測序由北京百邁客生物科技有限公司完成 。123 信息分析流程 利用雙末端測序 ( paired end) 的方法 ， 構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序 。通過對(duì) reads( 讀長 ) 拼接過濾 ， 得到優(yōu)化序列 ( tags) 。將優(yōu)化序列進(jìn)行操作分類單元( operational taxonomic units， 簡稱 OTUs) 聚類 ， 并進(jìn)行物種注釋及豐度分析 ， 以揭示樣品的物種構(gòu)成 。進(jìn)一步進(jìn)行 多樣性分析 ( alpha diversity) ， 研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性 ， 統(tǒng)計(jì)各樣品在 97% 相似度水平下的 Ace、Chao1、Shannon 及Simpson 指數(shù) 。124 草莓生長指標(biāo)測定 施用木霉菌可濕性粉劑 50 d后 ， 測定單株葉片數(shù)及單張葉面積 ， 測定數(shù)量為 10 株 。單張葉面積的測定參考喬寶營等的方法 13。125 草莓灰霉病的調(diào)查 施藥后在生育期內(nèi)定期觀測連作草莓土傳病害的發(fā)生情況 ， 主要調(diào)查整個(gè)試驗(yàn)處理草莓灰霉病的病株數(shù) ， 并參照朱虹等方法計(jì)算防效 14。2 結(jié)果與分析21 樣品測序結(jié)果評(píng)估通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件處理各階段樣品序列數(shù) ， 評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)801 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期量 。各樣品測序數(shù)據(jù)評(píng)估結(jié)果如表 1、表 2 所示 。稀釋性曲線 ( rarefaction curve) 用于驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性 ， 并間接反映樣品中物種的豐富程度 15。由圖 1 可以看出 ， 在一定范圍內(nèi) ， 隨著測序數(shù)的增多 ， 若曲線表現(xiàn)為急劇上升 ， 則表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn) ; 當(dāng)曲線趨于平緩時(shí) ， 則表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨著測序數(shù)量的增加而明顯增多 。稀釋曲線可以作為對(duì)各樣本測序表 1 樣品細(xì)菌測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理雙端 reads 數(shù)( 個(gè) )原始序列數(shù) ( 個(gè) )優(yōu)化序列數(shù) ( 個(gè) )優(yōu)化序列占比( %)T180 415 76 297 63 698 7920T280 509 76 422 64 196 7974T379 583 75 428 63 206 7942CK179 948 75 396 63 513 7941CK279 916 75 605 63 254 7915CK379 809 75 656 63 652 7976表 2 樣品真菌測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理雙端 reads 數(shù)( 個(gè) )原始序列數(shù) ( 個(gè) )優(yōu)化序列數(shù) ( 個(gè) )優(yōu)化序列占比( %)T180 118 51 337 49 572 6187T280 192 53 576 51 069 6368T380 137 52 327 50 640 6319CK179 593 50 969 46 457 5837CK279 836 56 269 52 957 6633CK380 090 53 943 50 834 6347量是否充分的判斷 ， 如果曲線急劇上升 ， 表明測序量不足 ， 需要增加序列數(shù) ; 反之 ， 則表明樣品序列充分 ， 可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 。樣品稀釋曲線分別在測序數(shù)為 10 000、20 000 條處逐漸趨向平坦 ， 而表 1 顯示 ， 細(xì)菌的優(yōu)化測序數(shù)量超過 60 000 條 ，表 2 顯示 ， 真菌的優(yōu)化序列超過 40 000 條 ， 說明樣品序列充分 ， 測序數(shù)量合理 。22 OTU 劃分結(jié)果6 個(gè)樣品測序共獲得 479 966 對(duì) reads， 雙端 reads 拼接 、過濾后共產(chǎn)生 301 529 條 tags， 平均每個(gè)樣品產(chǎn)生 43 076tags。根據(jù)不同的相似度水平 ， 對(duì)所有序列進(jìn)行 OTU 劃分 ， 在一般情況下 ， 如果序列之間的相似性高于 97% 就可以把它定義為 1 個(gè) OTU， 每個(gè) OTU 對(duì)應(yīng) 1 種代表序列 16。使用 QIIME( version 180) 軟件中的 UCLUST 對(duì) tags 在 97%的相似度水平下進(jìn)行聚類 ， 獲得 OTU， 并基于 Silva( 細(xì)菌 ) 和 UNITE( 真菌 ) 分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì) OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋 。由表 3 看出 ， 各處理組和對(duì)照組細(xì)菌的總種類數(shù)變化非常小 ， 而真菌種類的數(shù)量差異較大 ， 處理組較對(duì)照組真菌種類總數(shù)明顯減少 ， 降低了 1757%。表 3 通過聚類得到的不同處理土壤中的 OTU 數(shù)量菌類CK 的 OTU 數(shù) ( 個(gè) ) 處理的 OTU 數(shù) ( 個(gè) )CK1CK2CK3 平均T1T2T3 平均總 OTU 數(shù)( 個(gè) )細(xì)菌 1 247 1 146 1 260 1 217 1 197 1 241 1 210 1 216 1 391真菌 347 233 310 296 220 295 219 244 45923 屬水平豐度變化由圖 2 可以看出 ， 細(xì)菌屬水平的豐度變化表現(xiàn)如下 : 在土壤中 ， 特呂珀菌屬 ( Truepera) 、Chryseolinea、藤黃單胞菌屬( Luteimonas) 、鐵礦沙單胞菌屬 ( Arenimonas) 、鞘鞍醇單胞菌屬 ( Sphingomonas) 、冷 菌 屬 ( Algoriphagus) 和 熱 單 胞 菌 屬( Thermomonas) 豐度較高 ， 處理組和對(duì)照組相比沒有明顯變化 。處理組的假單胞菌屬 ( Pseudomonas) 豐度所占比例比對(duì)照增加 458 百分點(diǎn) 。假單胞菌屬是土壤中病原菌的拮抗菌 ，其種類和數(shù)量增多有利于土壤健康 17。由圖 3 可以看出 ， 真菌屬水平豐度的變化表現(xiàn)如下 : 鐮刀菌屬 ( Fusarium) 在 T3處理中豐度占比 2 41%， T3處理中其他種類真菌數(shù)量較少 ， 鐮刀菌占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì) ， 與往年 T3處理是根腐病嚴(yán)重區(qū)有關(guān) 。大棚內(nèi)有相同根腐病發(fā)生區(qū)的土壤中 ， 鐮刀菌豐度占比達(dá) 3 35%， 木霉菌處理后下降 28 06 百分點(diǎn) 。豐度占比前 10 的頭梗霉屬 ( Cephaliophora) 、赤霉菌屬( Gibberella) 、毛殼菌屬 ( Chaetomium) 相對(duì)豐度明顯減少 ， 分別降低 24520、32253、3846 百分點(diǎn) ， 羽蘚屬 ( Tetracladium)相對(duì)豐度明顯增多 ， 增加 34829 百分點(diǎn) 。毛殼菌廣泛存在于土壤中 ， 它可以有效降解纖維素和有機(jī)物 ， 對(duì)微生物產(chǎn)生拮抗作用 ， 是廣泛應(yīng)用的生防菌 18。而木霉菌和毛殼菌互相拮抗 ， 所以會(huì)造成毛殼菌豐度的減少 19。24 物種豐度聚類熱圖Heatmap 是以顏色梯度來代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小并根據(jù)物種或樣品豐度相似性進(jìn)行聚類的一種圖形展示方式 。901江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期將高豐度和低豐度的物種分塊聚集 ， 通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣品群落組成的相似性和差異性 。在熱圖聚類結(jié)果中 ， 顏色代表物種豐度 ; 縱向聚類表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況 ， 2 個(gè)物種間距離越近 ， 枝長越短 ， 說明這 2個(gè)物種在各樣品間的豐度越相似 ; 橫向聚類表示不同樣品的各物種豐度的相似情況 ， 與縱向聚類一樣 ， 2 個(gè)樣品間距離越近 ， 枝長越短 ， 說明這 2 個(gè)樣品的各物種豐度越相似 。從圖 4 可以看出 ， 木霉菌制劑處理的土樣真菌豐度明顯降低 ， 尤其是處理 1 和處理 3。處理 2 和對(duì)照 2 橫向聚類豐度相近 ， 縱向聚類豐度差異較大 。頭梗霉屬 、赤霉菌屬等一些土壤致病菌明顯減少 ， 而圓酵母屬 ( Torula) 、摩西管柄囊霉( Funneliformis) 、羽蘚屬 ( Tetracladium) 豐度增加 ， 其中摩西管柄囊霉和羽蘚屬均是菌根真菌 ， 對(duì)土壤健康的保持非常重要 。21 d 后木霉菌的數(shù)量會(huì)明顯降低 。25 Alpha 多樣性分析Alpha 多樣性有 Chao1、Ace、Shannon、Simpson 等多種衡量指標(biāo) 20。其中 Chao1 和 Ace 指數(shù)能簡單地反映群落中物種的數(shù)量 ， 而不表示群落中每個(gè)物種的豐度信息 。Shannon和 Simpson 指數(shù)用于衡量群落多樣性 ， 受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響 。Chao1、Ace、Shannon 指數(shù)越大 ，Simpson 指數(shù)越小 ， 說明樣品的物種多樣性越高 21。另外 ， 本研究還統(tǒng)計(jì)了樣本文庫的覆蓋率 ( Coverage) ， 其數(shù)值越高 ， 則表明樣本中序列被測出的概率越高 ， 而沒有被測出的概率越低 。該指數(shù)可以反映測序結(jié)果是否能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況 。從表 4、表 5 可以看出 ， 經(jīng)過木霉菌處理后 ， 土壤微生物多樣性指數(shù)整體上變低 ， 細(xì)菌多樣性指數(shù)變化不大 ， Ace 和Shannon 指數(shù)變化較小 ， Chao1 和 Simpson 指數(shù)略微下降 。真菌的多樣性指數(shù)明顯降低 ， 對(duì)照 Ace、Chao1、Shannon 指數(shù)分別比處理增加 1851%、1881、3103%; 對(duì)照 Simpson 指數(shù)比處理降低 5096%。分析原因 ， 可能是由于木霉菌對(duì)細(xì)菌的拮抗性較小 ， 主要拮抗真菌 。26 木霉制劑對(duì)草莓植株生長及灰霉病發(fā)生的影響施入可濕性粉劑后 ， 分別在生育期內(nèi)進(jìn)行草莓葉片數(shù)量 、面積測定 。表 6 結(jié)果表明 : 處理組的草莓葉片數(shù)量 、葉面積均比對(duì)照組明顯增加 。施藥后 50 d 時(shí) ， 處理組葉片數(shù)量 、葉面積分別比對(duì)照組增加 10 78%、10 94%， 對(duì)草莓灰霉病的相對(duì)防效達(dá) 65%。結(jié)果說明 ， 施入木霉菌對(duì)草莓植株具有明顯的促生長作用 ， 并對(duì)草莓灰霉病有很好的預(yù)防和治療作用 。3 結(jié)論與討論本試驗(yàn)采用土壤宏基因組高通量測序的方法研究木霉菌制劑施用后對(duì)土壤微生物多樣性的影響 ， 結(jié)果表明 ， 施用木霉菌對(duì)土壤中細(xì)菌多樣性影響較小 ， 但會(huì)使真菌多樣性明顯降低 。木霉菌對(duì)細(xì)菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為假單胞菌屬數(shù)量明顯增多 ; 對(duì)真菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為頭梗霉屬 、赤霉菌屬和毛殼菌屬等數(shù)量明顯減少 ， 酵母菌 、羽蘚屬等數(shù)量明顯增多 。木霉菌的施用會(huì)造成很多病原菌含量減少 ， 也會(huì)造成一些有益菌含量減少 ， 從而重新塑造土壤的微生態(tài)系統(tǒng) ， 間接改良土壤 ， 增強(qiáng)植株長勢(shì) ， 并減輕灰霉病等土傳病害的發(fā)生程度 22。馬建華等報(bào)道 ， 在土壤中施入深綠木霉后細(xì)菌增長速度緩慢 ， 而真菌數(shù)量顯著降低 23。古麗君等研究發(fā)現(xiàn) ， 施入深綠木霉 17 d 后 ， 真菌的數(shù)量比對(duì)照減少了 4 × 103CFU/g， 土壤中細(xì)菌的數(shù)量增加了 1 27 × 1010CFU/g， 放線菌數(shù)量沒有明顯變化 24。另有報(bào)道顯示 ， 木霉菌和假單胞菌屬可以協(xié)同作用 ， 從而提高生防效果 25。毛殼菌屬是優(yōu)良的生防菌 ， 但木霉菌施用后會(huì)造成其數(shù)量下降 ， 已有報(bào)道顯示兩者互相拮抗 19。有關(guān)木霉菌在土壤中存活時(shí)間的問題 ， 當(dāng)前研究結(jié)果不一 ， 康萍芝等研究發(fā)現(xiàn) ， 施用木霉菌后 11 d， 木霉菌含量達(dá)到高峰 ， 之后開始降低 ， 55 d 后土壤中幾乎檢測不到木霉菌 26。杜嬋娟等發(fā)現(xiàn) ， 施用木霉菌后 35 d， 木霉菌含量達(dá)到高峰 ， 之后開始下降 27。古麗君等發(fā)現(xiàn) ， 木霉在施入 25 d 時(shí) ， 相對(duì)含量達(dá)到最低值 24。本研究發(fā)現(xiàn) ， 施用木霉制劑 21 d 后根際土壤中木霉菌含量已經(jīng)很低 ， 其原因有待進(jìn)一步研究 。土壤微生物多樣性是衡量土壤健康與否的重要指標(biāo) 。木011 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期表 4 細(xì)菌 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)處理OTU 數(shù)( 個(gè) )Ace指數(shù)Chao1指數(shù)Simpson指數(shù)Shannon指數(shù)覆蓋率( %)CK11 247 1 30926 1 31866 0003 5 637 9920CK21 146 1 19368 1 19596 0007 7 599 9947CK31 260 1 31526 1 32500 0003 0 640 9929CK 平均 1 218 1 27273 1 27987 0004 7 625 9932T11 197 1 26894 1 28314 0005 1 610 9928T21 241 1 29536 1 32926 0008 0 612 9937T31 210 1 26799 1 28306 0004 0 625 9936處理平均 1 216 1 27743 1 29849 0005 7 616 9934霉菌的施用會(huì)改變土壤中的微生態(tài)系統(tǒng) ， 往往使一些土傳病害真菌種類和數(shù)量減少 ， 而土壤中有許多真菌往往是重要的病原菌 28， 從而使土壤有益菌和病原菌保持一種動(dòng)態(tài)平衡 ，達(dá)到抑制病害發(fā)生和促進(jìn)作物生長的目的 。參考文獻(xiàn) : 1 楊依軍 ， 王 勇 ， 楊秀榮 ， 等 拮抗木霉菌在生物防治中的作用 J 天津農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2000， 6( 3) : 29 33111江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期表 5 真菌 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)處理OTU 數(shù)( 個(gè) )Ace指數(shù)Chao1指數(shù)Simpson指數(shù)Shannon指數(shù)覆蓋率( %)CK1347 38018 36862 0076 0 352 998 7CK2233 24991 27019 0133 1 259 9991CK3310 31748 31864 0159 1 301 9995CK 平均 297 31586 31915 0122 7 304 9991T1220 24164 24555 0162 0 240 9990T2295 31236 31484 0157 9 286 9992T3219 24558 24546 0430 8 171 9992處理平均 245 26653 26862 0250 2 232 9991表 6 木霉制劑對(duì)草莓生長和灰霉病發(fā)生的影響 ( 施藥后 50 d)處理平均葉片數(shù)量( 張 /株 )平均葉面積( cm2/張 )施后病情指數(shù)防效( %)木霉菌 113 71 144 65對(duì)照 102 64 411 2 ao S， Chan Y， Bugler Lacap D C， et al Microbial diversity in soil，sand dune and rock substrates of the Thar monsoon desert， India J Indian Journal of Microbiology， 2016， 56( 1) : 35 45 3 Garbeva P， van Veen J A， van Elsas J D Microbial diversity in soil:selection microbial populations by plant and soil type and implicationsfor disease suppressiveness J Annual eview of Phytopathology，2004， 42( 1) : 243 270 4 Xie Y， Fan J， Zhu W， et al Effect of heavy metals pollution on soilmicrobial diversity and bermudagrass genetic variation J Frontiersin Plant Science， 2016， 7( 1) : 755 5 Pace N A molecular view of microbial diversity and the biosphere J Science， 1997， 276( 5313) : 734 740 6 Torsvik V， Goksyr J， Daae F L High diversity in DNA of soilbacteria J Applied and Environmental Microbiology， 1990， 56( 3) :782 787 7 Zhang W， Chen L， Zhang ， et al High throughput sequencinganalysis of the joint effects of BDE209 Pb on soil bacterialcommunity structure J Journal of Hazardous Materials， 2016， 301:1 7 8 Quail M A， Kozarewa I， Smith F， et al A large genome centersimprovements to the Illumina sequencing system J NatureMethods， 2008， 5( 12) : 1005 1010 9 Meyer M， Stenzel U， Hofreiter M Parallel tagged sequencing on the454 platform J Nature Protocols， 2008， 3( 2) : 267 278 10 Mardis E The impact of next generation sequencing technologyon genetics J Trends in Genetics， 2008， 24( 3) : 133 141 11 Czechowski P， Clarke L J， Breen J， et al Antarctic eukaryotic soildiversity of the Prince Charles Mountains revealed by high throughput sequencing J Soil Biology Biochemistry， 2016， 95( 95) : 112 121 12 Cummings P J， Ahmed H ， Durocher J A， et al Pyrosequencing formicrobial identification and characterization J Journal ofVisualized Experiments Jove， 2013( 78) : e50405 13 喬寶營 ， 黃海帆 ， 張信栓 ， 等 草莓葉面積簡易測定方法 J 果樹學(xué)報(bào) ， 2005， 21( 6) : 621 623 14 朱 虹 ， 汪章勛 ， 樊美珍 ， 等 草莓灰霉病拮抗木薯菌株篩選及溫室防效測定 J 中國生物防治雜志 ， 2005， 21( 1) : 52 54 15 Wang Y， Sheng H F， He Y， et al Comparison of the levels ofbacterial diversity in freshwater， intertidal wetland， and marinesediments by using millions of illumina tags J Applied andEnvironmental Microbiology， 2012， 78( 23) : 8264 8271 16 Blaxter M， Mann J， Chapman T， et al Defining operationaltaxonomic units using DNA barcode data J PhilosophicalTransactions: Biological Sciences， 2005， 360( 1462) : 1935 1943 17 葛紅蓮 ， 陳 龍 ， 張軍令 ， 等 長期污水灌溉對(duì)小麥根際土壤微生物區(qū)系的影響 J 節(jié)水灌溉 ， 2009( 5) : 14 15 18 遲玉杰 ， 楊 謙 毛殼菌對(duì)植物病害的生物防治及存在的問題 J 農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究 ， 2002， 18( 3) : 215 218 19 柳婷婷 木霉菌與毛殼菌組合防治兩種蔬菜病害 J 中國農(nóng)業(yè)信息 ， 2015( 3) : 70 72 20 唐玉姝 ， 魏朝富 ， 顏廷梅 ， 等 土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)研究進(jìn)展 J 土壤 ， 2007， 39( 2) : 157 163 21 Grice E A， Kong H H， Conlan S， et al Topographical and temporaldiversity of the human skin microbiome J Science， 2009， 324( 5931) : 1190 1192 22 朱偉杰 ， 王 楠 ， 郁雪平 ， 等 生防菌 Pseudomonas fluorescens2P24 對(duì)甜瓜根圍土壤微生物的影響 J 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2010，43( 7) : 1389 1396 23 馬建華 ， 張麗榮 ， 康萍芝 ， 等 秸稈生物反應(yīng)堆技術(shù)的應(yīng)用對(duì)設(shè)施黃瓜土壤微生物的影響 J 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) ， 2010， 19( 12) :161 165 24 古麗君 ， 徐秉良 ， 梁巧蘭 ， 等 生防木霉對(duì)草坪土壤微生物區(qū)系的影響及定殖能力研究 J 草業(yè)學(xué)報(bào) ， 2013， 22( 3) : 321 326 25 譙天敏 ， 張 靜 ， 朱天輝 銅綠假單胞菌與長枝木霉對(duì)雜交竹梢枯病的協(xié)同增效生防研究 J 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ， 2015( 2) :113 120 26 康萍芝 ， 張麗榮 ， 沈瑞清 ， 等 哈茨木霉制劑對(duì)設(shè)施連作番茄根際土壤微生物的生態(tài)效應(yīng)及防病作用 J 農(nóng)藥 ， 2013， 52( 2) :128 131 27 杜嬋娟 ， 付 崗 ， 潘連富 ， 等 哈茨木霉 gz 2 菌株在土壤中的定殖規(guī)律研究 J 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) ， 2016， 29( 1) : 138 142 28 黃秀梨 微生物學(xué) M 北京 : 高等教育出版社 ， 2001211 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018 年第 46 卷第 18 期