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我國12個(gè)地區(qū)草莓葉螨種類分子鑒定及遺傳多樣性.pdf

  • 資源ID:4749       資源大?。?span id="y2ovyng" class="font-tahoma">240.46KB        全文頁數(shù):4頁
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我國12個(gè)地區(qū)草莓葉螨種類分子鑒定及遺傳多樣性.pdf

,(): 收稿日期 : 修訂日期 :基金項(xiàng)目 :北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (,);北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng) ();北京市農(nóng)林科學(xué)院科技示范推廣項(xiàng)目 ();北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) ();北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通信作者 :我國個(gè)地區(qū)草莓葉螨種類分子鑒定及遺傳多樣性曹利軍,周曉怡,宮亞軍,魏書軍(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所,北京;長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,荊州)摘要為明確草莓上的葉螨種類及其遺傳多樣性 ,以便準(zhǔn)確有效地指導(dǎo)草莓葉螨防治 。本研究選取我國 個(gè)代表性的地區(qū) ,采集草莓上的葉螨 。采樣范圍覆蓋了我國華北 、華中 、華東和西南的草莓產(chǎn)區(qū) 。擴(kuò)增和測定線粒體 基因部分序列 ,將所獲得的序列通過 與 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對 ,確定葉螨種類 ,并對 基因序列的多樣性進(jìn)行分析 。測序獲得了長度為 的 基因片段 。比對結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析表明 ,來自我國 個(gè)地區(qū)的 個(gè)樣品均為二斑葉螨 。遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)我國草莓上二斑葉螨的基因有 種單倍型,其中個(gè)地區(qū)僅存在 種單倍型,北京昌平檢測到種單倍型。兩種單倍型之間有個(gè)核苷酸的同義突變 。本研究表明 ,二斑葉螨為這些地區(qū)草莓上唯一的葉螨種類 ,種群內(nèi)遺傳多樣性非常低 。研究結(jié)果對于制定草莓上葉螨的防治策略具有指導(dǎo)意義 。關(guān)鍵詞草莓 ;葉螨 ;分子鑒定 ;二斑葉螨 ;遺傳多樣性中圖分類號 : 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 : : , , , ( , , ,; , , ,) , , , , ; ; ; ; 草莓具有非常豐富的營養(yǎng)價(jià)值 ,我國草莓栽培面積超過萬,年產(chǎn)量超過萬,年產(chǎn)量和栽培面積超過了世界總量的,現(xiàn)穩(wěn)居世界第一位。隨著草莓的廣泛種植 ,害蟲為害也日漸嚴(yán)重 。葉螨是草莓上為害最為嚴(yán)重的害螨 ,直接影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì) 。受葉螨為害的草莓植株會矮化早衰 ,葉片變褐色及干枯 ,開花期受害植株的果實(shí)縮小 ,且畸形果增多 ,草莓的品質(zhì)嚴(yán)重下降。葉螨具有個(gè)體微小 、世代周期短和繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn) ,在實(shí)際生產(chǎn)中頻繁用藥和不合理用藥等導(dǎo)致葉螨抗藥性產(chǎn)生迅速。前人的研究認(rèn)為草莓上有多種葉螨 ,包括二斑葉螨 、截形葉螨卷第 期 曹利軍等:我國個(gè)地區(qū)草莓葉螨種類分子鑒定及遺傳多樣性 、朱砂葉螨 和神澤葉螨 等 。隨著草莓種植面積的逐年擴(kuò)大 、農(nóng)藥的大量使用以及耕作制度的改變 ,草莓上主要葉螨種類是否發(fā)生了變化 ? 明確這一問題對于制定合理的葉螨防控策略 ,提高防治效果有重要參考價(jià)值 。然而 ,不同種類葉螨的卵 、若螨和成螨均缺少差異明顯的形態(tài)特征 ,并且形態(tài)特征易受性別和發(fā)育階段的影響 ,通過形態(tài)鑒定葉螨種類存在較大困難?;谛蛄械姆肿予b定技術(shù)是一種準(zhǔn)確又快速的鑒定葉螨種類的方法 ,其中線粒體基因序列 、核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)()序列和限制內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù) ()等 是 葉 螨 分 子 鑒 定 的 常 用 標(biāo)記。本研究采用了通用引物容易獲得 、擴(kuò)增成功率較高的序列對我國草莓主要產(chǎn)區(qū)的葉螨種類進(jìn)行了快速鑒定 ,并分析了葉螨種群的遺傳多樣性 。 材料與方法 標(biāo)本采集與提取供試葉螨樣本來自全國個(gè)草莓產(chǎn)區(qū) (表),覆蓋了我國華北 、華中 、華東和西南的草莓產(chǎn)區(qū) ,且在空間上分布均勻 。采集標(biāo)本時(shí) ,每個(gè)樣點(diǎn)采片帶有葉螨的草莓葉片放入自封袋 ,每個(gè)地區(qū)采集個(gè)以上樣點(diǎn) ,每個(gè)樣點(diǎn)間距以上 。將每個(gè)自封袋中的葉螨標(biāo)本挑入個(gè)裝有無水乙醇的離心管中 ,保存用于提取。表 草莓葉螨樣本采集信息 采集地點(diǎn)經(jīng)緯度,采集時(shí)間 年月檢測樣本數(shù) 個(gè) 北京延慶北菜園 °,° 北京昌平萬德園 °,° 北京平谷夏魚路 °,° 山西陽泉盂縣萇池鎮(zhèn)小獨(dú)頭村 °,° 河北衡水龐莊村 °,° 山東日照莒縣棋山鎮(zhèn)三莊村 °,° 安徽淮南市潘集區(qū)后湖生態(tài)園 °,° 上海市浦東新區(qū)苗橋路 °,° 浙江嘉興市嘉善縣魏塘街道智果村 °,° 四川成都貴和農(nóng)業(yè)公園 °,° 江西南昌八一鄉(xiāng)涂家村 °,° 湖南長沙市長沙縣三興村 °,° 在顯微鏡下初步觀察葉螨形態(tài) ,從每個(gè)種群選取頭個(gè)體色有差異或空間上相距較遠(yuǎn)的成螨提取,共計(jì)頭成螨 。提取過程為 :將單頭葉螨放入含有裂解緩沖液的的管中 ,并使用燒制過的移液器吸頭尖端擠壓碾碎 ,使組織在裂解緩沖液中消解 ,短暫離心后將管放置在下,隨后在金屬浴下孵育,最后在下保持。其中組織裂解液配方為 : ( ), ,明膠 ,蛋白酶。 基因序列的擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為:(), ,上下游引物各,酶,模板 ,加補(bǔ)充總體積為。本研究先后使用了對引物進(jìn)行擴(kuò)增 ,先使用引物進(jìn)行擴(kuò)增 ,擴(kuò)增不成功的樣品用自己設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增 。是參考等的引物并修改 ,上游引物為:,下 游 引 物 為:;是根據(jù)數(shù)據(jù)庫登記的葉螨序列重新設(shè)計(jì)的引物 ,上游引物:,下 游 引 物:。引 物 由 生 工 生 物 工 程(上海 )股份有限公司合成 。擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性;變性,退火,延伸,個(gè)循環(huán) ;最后修復(fù)延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙端測序 。 測序和序列分析將測序序列用 軟件進(jìn)行比對。使用 分析葉螨基因的單倍型數(shù) ,計(jì)算多樣性參數(shù)。將 分析得到的不同單倍型在數(shù)據(jù)庫中用工具進(jìn)行搜索 。··從數(shù)據(jù)庫下載屬的序列 ,所選取序列包含本研究所測定區(qū)域 。下載的數(shù)據(jù)在同行評審期刊上發(fā)表的論文里使用過 ,或者序列對應(yīng)的標(biāo)本經(jīng)葉螨分類專家鑒定 。來自同一個(gè)國家的相同序列 ,只保留一個(gè) 。通過 軟件,利用鄰接法 (,)構(gòu)建基于雙參數(shù)模型 (,)的系統(tǒng)發(fā)育樹 ,重復(fù) 次檢驗(yàn),計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的支持率 。 結(jié)果與分析 基因擴(kuò)增除浙江嘉興地區(qū)的頭葉螨未能擴(kuò)增得到序列外 ,其余地區(qū)選取的樣本均成功獲得基因序列 ,共獲得個(gè)樣品的序列 。其中 ,從頭葉螨中擴(kuò)增到目的片段 ,從頭葉螨中擴(kuò)增到目的片段 。 物種鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后 ,得到的基因部分序列的長度為。 分析表明 ,草莓上的葉螨有種單倍型 。將種單倍型序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對 ,結(jié)果 (圖)表明 :其中一種單倍型序列 (包含個(gè)個(gè)體 )與數(shù)據(jù)庫中 的 二 斑 葉 螨綠色型序列 (序列號 :)相似度為,命名為單倍型();另一種單倍型與單倍型相比 ,有個(gè)核苷酸的同義 ()突變 ,與二斑葉螨綠色型序列相似度大于,命名為單倍型()。系統(tǒng)發(fā)育分析表明 ,種單倍型與二斑葉螨綠色型聚為一支 ,和二斑葉螨紅色型有較近的親緣關(guān)系 ,而與其他葉螨的遺傳距離較遠(yuǎn) 。分子鑒定結(jié)果明確了我國草莓上的葉螨均為二斑葉螨綠色型 。圖 基于 序列構(gòu)建的葉螨 系統(tǒng)發(fā)育樹 遺傳多樣性使用 統(tǒng)計(jì)序列多樣性 ,發(fā)現(xiàn)單倍型存在于所有的種群中 ,而單倍型僅在北京昌平種群中的個(gè)個(gè)體中發(fā)現(xiàn) (圖)。單倍型在其他研究中尚未報(bào)道過 。結(jié)果表明 ,我國草莓上二斑葉螨線粒體基因的遺傳多樣性非常低 。 討論二斑葉螨原在歐洲和美國普遍發(fā)生 ,世紀(jì)年代以前在我國未曾發(fā)現(xiàn) 。年 ,在北京市天壇公園花卉上首次發(fā)現(xiàn)了二斑葉螨,隨后在年和年在河北昌黎 、甘肅天水的果樹上相繼被發(fā)現(xiàn)。年 ,二斑葉螨在我國僅局部分布于臺灣島 、北京市和天水市郊。此后 ,以上述各地區(qū)域?yàn)橹行?,向其他地區(qū)擴(kuò)散 。有研究認(rèn)為 ,二斑葉螨在我國主要分布于東北 、華北 、西北及蘇皖兩省北部,在海南和廣東的作物上沒有分布,但有研究者在我國南方的廣東和四川也發(fā)現(xiàn)了二斑葉螨的危害。本研究在四川成都 、江西南昌和湖南長沙均采集到了草莓上二斑葉螨的樣本 。此外 ,等對二斑葉螨種群遺傳學(xué)的研究中也采集到我國南方的多個(gè)二斑葉螨種群 ,例如在湖南長沙 (寄主為豇豆 )、江西九江(棉花 )、浙江慈溪 (棉花 )和云南玉龍 (菜豆 )。本實(shí)驗(yàn)室在調(diào)查過程中 ,在海南豆角上也發(fā)現(xiàn)了二斑葉螨(未發(fā)表 ),由此可見二斑葉螨在我國南方已經(jīng)建立了穩(wěn)定的種群 ,分布范圍進(jìn)一步擴(kuò)大 。二斑葉螨主動擴(kuò)散的能力有限 ,但可以憑借風(fēng)力 、流水 、昆蟲 、鳥獸和人畜等多種途徑進(jìn)行傳播 ,其中農(nóng)具和花卉苗木攜帶是二斑葉螨長距離傳播的主要途徑。近年來對入侵物種的研究表明 ,種群遺傳··卷第 期 曹利軍等:我國個(gè)地區(qū)草莓葉螨種類分子鑒定及遺傳多樣性學(xué)研究方法是分析入侵物種傳播擴(kuò)散過程的有力手段。本研究采集的樣本包括我國個(gè)地區(qū)草莓上的葉螨種群 ,南北最遠(yuǎn)相距 多公里 ,東西橫跨近 公里 。但是只發(fā)現(xiàn)了種線粒體單倍型 ,其中絕大多數(shù)地區(qū)只有種單倍型 。這可能反映了我國二斑葉螨的起源種群比較單一 ,入侵到我國之后隨種苗調(diào)運(yùn)發(fā)生了二次傳播 。而北京昌平具有種單倍型 ,可能反映了該園區(qū)的種苗調(diào)運(yùn)較為復(fù)雜 。實(shí)際上該園區(qū)草莓品種較多 ,有很多直接從國外引進(jìn)的品種 。從世紀(jì)年代開始國內(nèi)學(xué)者開始關(guān)注為害草莓的葉螨 ,包括朱砂葉螨和神澤葉螨,。本研究發(fā)現(xiàn)我國草莓主要產(chǎn)區(qū)為害草莓的葉螨只有二斑葉螨 ,未發(fā)現(xiàn)神澤葉螨 。由此推斷二斑葉螨可能已經(jīng)成為這些地區(qū)為害草莓的優(yōu)勢種 。出現(xiàn)這種情況的原因 ,可能是作為入侵種的二斑葉螨比本地種適應(yīng)能力更強(qiáng) ,其入侵?jǐn)U散導(dǎo)致了對當(dāng)?shù)叵嗨粕鷳B(tài)位的物種的取代;也可能是二斑葉螨經(jīng)過長期的藥劑篩選后逐漸取代了其他葉螨 ,從一種次要害螨上升為主要害螨。另外 ,耕作制度和栽培模式的變更 ,可能創(chuàng)造了更加適宜二斑葉螨生存的環(huán)境 。本研究明確了我國草莓上的主要葉螨種類為二斑葉螨 ,對于制定草莓害螨防治策略 ,減少農(nóng)藥濫用 ,管理葉螨抗藥性等具有重要的指導(dǎo)意義 。參考文獻(xiàn)吳曉云 ,高照全 ,李志強(qiáng) ,等 國內(nèi)外草莓生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào) ,():楊金生 ,束兆林 草莓紅蜘蛛的發(fā)生與防治對策 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) ,(): , , (:): ,(): , , , ,():蔡雙虎 ,程立生 二斑葉螨的研究進(jìn)展 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) ,():朱亮 ,康總江 ,魏書軍 ,等 年北京各區(qū)縣不同寄主上二斑葉螨發(fā)生調(diào)查 北方園藝 ,():洪雪 棚室草莓嚴(yán)防紅蜘蛛 北方果樹 ,():曹華國 草莓上神澤氏葉螨的發(fā)生與防治 生物災(zāi)害科學(xué) ,(): , , , , (:) ,():崔玉楠 ,孫荊濤 ,葛成 ,等基于形態(tài)與 技術(shù)相結(jié)合的快速葉螨鑒定法 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào) ,(): , (:) : , ,(): , , , : ,(): , , , : ,(): , , : ,(): , : ,(): , : ,(): ,(): : ,(): , , , ,():董慧芳 ,郭玉杰 ,牛離平用雜交方法鑒定我國三種常見葉螨植物保護(hù)學(xué)報(bào),():譚美謙防止二斑葉螨在京郊果樹上蔓延綠化與生活,():程立生二斑葉螨的檢疫重要性植物檢疫,():譚美謙二斑葉螨的發(fā)生特點(diǎn)及成災(zāi)原因中 國 果 樹,(): , , , (:) ,: , , , ,(): , , , ,():李瑞娟 ,王開運(yùn) ,姜興印 ,等二斑葉螨的抗藥性研究進(jìn)展山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 ),():(責(zé)任編輯 :楊明麗 )··

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