<p>一株耐鹽溶磷真菌的篩選、鑒定及其生物肥料的應用效果江紅梅，殷中偉，史發(fā)超，劉彩月，程明芳，范丙全*（中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）摘要: 【目的】從內蒙古種植向日葵的鹽堿地中篩選高效溶磷真菌，為農業(yè)生產中增產節(jié)肥，開發(fā)耐鹽、溶磷微生物肥料提供菌種資源。【方法】利用形態(tài)特征和ITS rDNA序列鑒定菌株；LC-MS技術測定菌株M2在液體培養(yǎng)基中分泌有機酸和植物激素含量，明確菌株M2的溶磷和促生機理。采用液體搖床培養(yǎng)試驗測定了鑒定菌株的溶磷能力。試驗處理包括：在磷酸三鈣、磷酸鋁和5個磷礦的磷礦粉制備的100 mL難溶磷磷源 (含5g/L難溶磷) 中，接入1 mL滅菌培養(yǎng)液對照，和分別接種1 mL斜臥青霉菌P83和草酸青霉菌M2共15個處理。置于28、160 r/min搖床培養(yǎng)，分別于3、6和9 d，取菌液5 mL，在12000 r/min、4離心5 min，取上清液測定有效磷含量。采用含NaCl的固體培養(yǎng)基測定菌株的耐鹽性。NaCl含量分別為0%、5%、7.5%、10%和12.5%的PDA平板中接入溶磷菌，置于28恒溫培養(yǎng)箱中5 d，觀察并記錄菌絲的生長狀況。采用盆栽試驗方法檢驗了菌株的溶磷能力。以玉米種子 (鄭單958) 為供試作物，以水稻土、黏性潮土、鹽潮土和石灰性潮土為供試土壤，以Ca3(PO4)2、AlPO4 和昆陽磷礦粉 (RP) 為供試磷源 (磷源用量為1.0 g/kg土壤)。設置只加入滅菌草炭和Pikovskaya培養(yǎng)液對照，分別接種溶磷菌P83、M2，共計38個處理，144盆。玉米播種40天后收獲，測定植株鮮重、干重和玉米根際土壤有效磷含量。田間試驗以花生為供試作物，設置只加滅菌草炭和Pikovskaya培養(yǎng)液對照和分別接種ATCC20851、P83、M2溶磷菌劑三個處理?；ㄉL155 d后收獲，稱量花生植株鮮重和干重、花生果實鮮重和干重，同時采集花生根部土壤測定有效磷含量。【結果】溶磷菌株M2鑒定為草酸青霉 (Penicillium oxalicum)。液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)6 d后，接種菌株M2，以Ca3(PO4)2為磷源的上清液中有效磷含量達972 mg/L，Ca3(PO4)2溶解率為59.2%；以AlPO4為磷源的有效磷含量達988 mg/L，溶解率為48.2%；以江蘇錦屏、貴州開陽、云南晉寧、河北釩山和云南昆陽磷礦粉為磷源的有效磷釋放量達21.0556mg/L。菌株M2在7.5%NaCl培養(yǎng)基中正常生長。盆栽試驗結果發(fā)現，菌株M2對玉米植株促生效果顯著，玉米植株鮮重比不接種菌劑 (CK) 提高26.4%99.2%、干重增加20.0%262.9%，土壤有效磷提高19.225.3mg/kg。菌株M2與4種土壤的適配性均高于對照菌株P83。田間小區(qū)花生產量結果顯示，接種溶磷菌劑M2增產效果最好，花生果實產量達4.50 t/hm2，比CK增加0.85 t/hm2，增產23.29%。菌株M2 在含有磷酸三鈣、磷酸鋁和開陽磷礦粉3種難溶磷培養(yǎng)液中經過6 d培養(yǎng)，均產生7種有機酸，其中草酸和檸檬酸含量最高，分別為653.46 mg/L和269.61 mg/L；培養(yǎng)液中均能檢測到吲哚乙酸 (IAA) 和玉米素，IAA含量為32.3866.17mg/L，玉米素濃度為0.050.07 mg/L?！窘Y論】獲得了一株耐鹽、高效溶解多種難溶磷的草酸青霉菌M2，可顯著增加土壤有效磷，促進玉米生長和花生增產，與4種典型土壤適配性好，具有良好的農業(yè)應用前景。關鍵詞: 草酸青霉菌；溶磷作用；耐鹽；促生效果；有機酸；植物激素Isolation and functional evaluation of phosphate-solubilizing fungiwith salt-tolerant characteristicsJIANG Hong-mei, &nbsp; YIN Zhong-wei, &nbsp; SHI Fa-chao, &nbsp; LIU Cai-yue, &nbsp; CHENG Ming-fang, &nbsp; FAN Bing-quan*( Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China )Abstract: 【Objectives】To supply effective microbial strains for biofertilizer production, we isolatedphosphate-solubilizing fungi from the saline-alkaline soils planting sunflower in Inner Mongolia.【Methods】Petridishes method was used to isolate phosphate-solubilizing fungus and the isolated fungus was identified by ITS植物營養(yǎng)與肥料學報 2018, 24(3): 728742 doi: 10.11674/zwyf.17468Journal of Plant Nutrition and Fertilizers http:/www.plantnutrifert.org收稿日期： 20171211 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 接受日期： 20180404 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102801-7）；農業(yè)部“948”重點項目（2011-G25，2016-21X）資助。聯系方式：江紅梅 E-mail: jianghongmei2001163.com ； * 通信作者 范丙全 Tel: 010-82106212，E-mail：bqfancaas.ac.cnrDNA sequence homology analysis. Broth medium culture was used to measure the dissolving capacity ofinsoluble phosphate of the isolated M2. Insoluble phosphates: Ca3(PO4)2, AlPO4, and five phosphorous rockpowders as sole P source, respectively, were used to make PVK broth medium containing 5 g/L of phosphateseparately, and 1 mL of sterilized cultural media, strain P83 and strain M2 were added into 100 mL of the brothmedium and incubated at 28 for 3, 6 and 9 days at 160 r/min. Cultures were centrifuged at 12000 r/min for 5min at 4 and the supernatant immediately analyzed for available phosphorus. To determinate the salt toleranceof isolate M2 and strain P83 in petridishes, the PDA solid medium containing 0%, 5%, 7.5%, 10% and 12.5% ofNaCl were employed and the growth diameters of P-solubilizing isolates P83 and M2 were recorded, respectively,after 5 days of incubation. A pot experiment was carried out to investigate solubilizing phosphate effect of strainM2. Maize seeds (Zea mays L. Zhendan 958) were planted in the four types of soils (paddy soil, viscous fluvo-aquic soil, salinized fluvo-aquic soil and calcareous fluvo-aquic soil) in the presence of Ca3(PO4)2, AlPO4 andKunyang RP. The fresh and dry biomass and soil available phosphorus in treatments of P83 and M2 inoculationswere measured at 40 days after sowing. A field trial was conducted to investigate the plant growth promotioneffect of the produced bio-fertilizer with M2 strain. Peanut seeds were coated onto the mixture of fungal sporessuspension (strain ATCC20851, P83 and M2) with sterilized peat. The yields of peanut straw and seeds wererecorded and the soil available phosphorus was analyzed after harvest. Accumulation profiles of organic acid andphytohormone produced by the isolated M2 were analyzed using LC-MS method.【Results】The isolated M2strain was identified as Penicillium oxalicum and had a strong ability to solubilize insoluble phosphates. Thephosphate release rate from the solubilized Ca3(PO4)2 by M2 strain was 59.2% and the concentration of availableP was 972 mg/L under shaking incubation after 6 days culture. The soluble P in AlPO4 liquid culture was lowerthan that in the medium with Ca3(PO4)2, the available P content was 988 mg/L and the solubilized rate of AlPO4reached up to 48.2%. The contents of solubilized P by M2 from Jinping RP, Kaiyang RP, Jinning RP, FanshanRP, Kunyang RP were ranged from 21.0 to 556 mg/L after 6 days shaking incubation. The isolated M2 straingrew well in the presence of 7.5% NaCl, exhibiting satisfactory salt resistance property. The pot experimentshowed that the M2 strain had significant growth promoting effects in all the four types of soils. Compared withthe no-inoculation control, the fresh and dry biomass of corn in the M2 inoculated treatments were increased by26.36%99.18% and 20.05%262.94%, respectively, and the soil available P contents were enhanced by19.2425.28 mg/kg. The adaptability of isolated M2 to four types of soils was better than that of strain P83.Field experiment showed that the M2 inoculation exhibited a greater enhancement in peanut yield, and the yieldwas averaged at 4.50 t/hm2 with an increase of 23.29% over the control. Seven organic acids and twophytohormones were all detectable in the liquid cultures of Ca3(PO4)2, AlPO4 and Kunyang RP, the concentrationsof oxalic acid and citric acid in the three liquid cultures were as high as 653.46 mg/L and 269.61 mg/L in thepresence of M2 stain, respectively. The concentrations of indole acetic acid (IAA) were ranged from 32.38 to66.17 mg/L, and zeatin concentrations were ranged from 0.05 to 0.07 mg/L.【Conclusions】A novel phosphate-solubilizing M2 strain was isolated and identified to be Penicillium oxalicum. The isolated M2 strain behaves wellin solubilizing insoluble phosphates under culture with petri dishes, broth medium and pot experiments, and couldsignificantly increase soil available phosphate and corn biomass, suggesting that Penicillium oxalicum M2 strain isprospective for biofertilizer production in the future.Key words: Penicillium oxalicum; phosphate solubilization; salt-tolerant; plant growth promotion effect;organic acid; phytohormone土壤缺磷是限制作物產量的一個重要因素，據統(tǒng)計，全世界約有57萬公頃的耕地缺磷1，而我國約有2/3的耕地磷素缺乏尤為突出2。長期以來，施用磷肥是糧食增產的重要舉措。大量研究顯示，施入土壤的磷肥當季利用率不超過20%3，其中絕大部分磷與土壤中Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+ 等離子結合轉化3 期江紅梅，等：一株耐鹽溶磷真菌的篩選、鑒定及其生物肥料的應用效果729 &nbsp;為難溶磷，不易被植物吸收利用1。迄今，世界各國依靠大量消費磷肥確保作物增產，保障糧食安全，從而導致磷礦資源的消費量逐年增加。我國90%以上磷礦為中低品位，按現有的年消費量，我國磷礦使用年限將不足20年3。因此，提高磷肥及磷礦資源的利用效率和土壤磷庫的有效性，延長磷礦資源的使用期限，對世界各國農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義45。溶磷微生物能活化土壤難溶磷、提高磷肥利用率、增加作物吸磷量、促進作物增產46，其生物肥料制劑已經成為一種高效、經濟、環(huán)境友好的轉化土壤難溶磷的生物措施。溶磷微生物依靠自身產生有機酸78、分泌H+ 離子9，將難溶磷轉化為有效磷，同時通過自身產生植物促生物質10，在磷素的生物有效性和作物增產中發(fā)揮重要作用。自1903年Staltrom10從土壤中成功分離到溶磷細菌以來，溶磷微生物一直是研究熱點，國內外相繼開展了溶磷微生物的大量篩選工作1213，以期通過接種溶磷微生物制劑提高土壤難溶磷的有效性和磷肥利用率，從而減少磷礦資源的消費量7, 14。已有的報道表明，真菌的溶磷能力大于細菌，且溶磷性能穩(wěn)定11。世界各國科學家分離了大量溶磷真菌，其種類主要是青霉菌6、曲霉菌8、木霉菌15、酵母菌16、籃狀菌17、正青霉菌18、根霉菌19、鐮刀菌20、小菌核菌21和輪枝菌22等，其中絕大部分為青霉菌和曲霉菌。溶磷青霉菌是一類重要的溶磷微生物資源，現已報道的溶磷青霉菌有微白青霉23、產黃青霉24、桔青霉25、?，F青霉23、微紫青霉26、梅利尼青霉25、黑青霉27、特異青霉28、橄欖色青霉23、島青霉23、草酸青霉13、產紫青霉26、局限青霉23、紅色青霉26、皺褶青霉27、托姆青霉28、斜臥青霉29、指狀青霉30、變換青霉30、繩狀青霉32、拜萊青霉32、紫棕青霉 (P. cf. fuscum)33、嗜松青霉34、淡紫青霉35、黃灰青霉9和棘孢青霉36，達26種之多。絕大多數溶磷菌株是從作物根際土壤中分離，而一些溶磷菌株則是從特殊環(huán)境中獲得，以期更好地利用該類菌株具有溶磷功能和兼具適應土著環(huán)境的特性。Chatli等36從低溫沙漠地區(qū)分離了溶磷青霉菌株FC28、FC39，對磷酸三鈣的溶解量分別為136.9 mg/L和103.3 mg/L；Bhattacharya等37從蚯蚓糞便中分離到溶磷菌株V1，對磷礦粉最大溶解率為36%，土壤有效磷含量提高13.65 mg/kg；Naveenkumar等38從檳榔殼廢棄物中獲得了溶磷菌Strain-1，對磷酸三鈣的溶解量為200 mg/L；Rinu等39從海拔18003610 m的喜馬拉雅山脈土壤中分離到溶磷菌株ITCC2546、ITCC4210和ARIFCC771，在盆栽實驗中使玉米種子干重分別增加10.71%、33.33%和21.43%，小麥種子干重分別增加33.33%、37.04%和25.92%；李海云等40從豬糞堆肥中篩選到溶磷產黃青霉菌株PSM-1，對磷酸三鈣的溶解量為138.36 mg/L；Nath等41從茶樹葉中分離出溶磷菌Penicillium sp.1和Penicillium sp. 2，對磷酸三鈣的溶解量分別為86.10 mg/L和84.25 mg/L；Chai等42從明礬礦石中篩選到溶磷青霉菌株PSM11-5，對磷礦粉的溶解率達74.5%，且耐受重金屬Cd2+、Co2+ 和Cr6+ 的能力較好。我國鹽堿地耕地面積約有1300萬公頃，是我國最具增產潛力的低產農田。鹽堿土壤主要面對鹽堿脅迫和養(yǎng)分吸收兩大障礙16，鑒于目前鹽堿土壤治理采用的管道排鹽44、抗 (耐) 鹽育種17收效甚微，功能微生物及其制劑的應用正在展現巨大潛能44。無論鹽分脅迫土壤，還是非鹽分脅迫的土壤，有效磷含量低是制約作物產量的主要因素之一13。因此，溶磷微生物，尤其耐鹽溶磷微生物受到農業(yè)生產的高度重視17。國內外已有少量耐鹽溶磷菌株的研究報道，其中，耐鹽溶磷青霉菌主要有菌株PSF244、菌株PSFWRB-245和菌株QL150146。此外，紅酵母菌(Rhodotorula sp.) PS416、木霉菌TRC315和疣孢藍狀菌 (Talaromyces verruculosus) P1017等溶磷菌株的耐鹽能力較突出。本研究旨在篩選具有耐鹽能力的高效溶磷真菌，并對菌株的溶磷能力、代謝產物及促生增產效果進行研究，為開發(fā)適用于鹽堿農田土壤的溶磷生物肥料提供菌種資源。1 &nbsp; &nbsp;材料與方法1.1 &nbsp; &nbsp;供試材料1.1.1 &nbsp;土壤來源 &nbsp; 從內蒙古五原縣 (東經107°3570108°3750，北緯40°463041°1645) 輕中度鹽堿農田采集向日葵根圍土壤樣品150個，土壤pH值為8.67，電導率EC為0.96 ms/cm。盆栽土壤來自北京市石灰性潮土、安徽省阜陽黏性潮土、安徽水稻土和山東沿海鹽潮土。土壤理化性狀見表1。1.1.2 &nbsp;草炭 &nbsp; 本研究菌劑使用的載體為草炭，該草炭產自我國東北地區(qū)，有效磷97.14 mg/kg、速效鉀48.36 mg/kg、有機質219.74 g/kg。1.1.3 &nbsp;培養(yǎng)基 &nbsp; 1) 菌株篩選與培養(yǎng)：無機磷培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等4。2) Pikovskaya改良培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 10.0730植 物 營 養(yǎng) 與 肥 料 學 報24 卷g、(NH4)2SO4 0.5 g、酵母抽提物 0.5 g、KCl 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、MnSO4·4H2O 0.001 g、Ca3(PO4)25.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、pH 7.047。3) PDY培養(yǎng)基：土豆200 g與1 L蒸餾水混合煮沸20 min過濾，濾液補水至1 L，加入蔗糖10 g、酵母粉1 g。4) PDA培養(yǎng)基：PDY加瓊脂18 g/L。5) 耐鹽培養(yǎng)基：PDA加NaCl。分別配制NaCl含量為0%、5%、7.5%、10%和12.5%的培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121，20 min。1.1.4 &nbsp;供試磷源 &nbsp;1) 分析純磷酸三鈣Ca3(PO4)2 (P 20%)、分析純磷酸鋁AlPO4 (P 25.41%)，購于天津科密歐試劑公司。2) 磷礦粉：貴州開陽磷礦粉 (Kaiyang rockphosphate，Kaiyang RP，P 14.79%)；江蘇錦屏磷礦粉 (Jinping rock phosphate，JPRP，P 15.01%)；云南晉寧磷礦粉 (Jinning rock phosphate，JNRP，P14.75%)；河北釩山磷礦粉 (Fanshan rock phosphate，FSRP，P 14.80%) ；云南昆陽磷礦粉 (Kunyang rockphosphate，Kunyang RP，P 14.90%)。磷礦石均粉碎過100目 (149 m) 篩，鉬銻抗比色法測定有效磷含量。1.1.5 &nbsp;液質聯用 (Liquid chromatograph-massspectrometer，LC-MS) 試劑 &nbsp;1) 有機酸標準品 酒石酸 (DL-Tartaric acid)、草酸 (Oxalic acid) 、檸檬酸 (Citric acid)、蘋果酸 (DL-Malic acid)、乳酸 (L(+)-Lactic acid)、琥珀酸(Succinic acid) 和延胡索酸 (Fumaric acid)，購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。2) 植物激素標準品 生長素 (IAA)、玉米素(Zeatin)，購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。磷酸二氫鉀和磷酸為國產優(yōu)級純，甲酸銨、丙酸和甲醇(Methyl alcohol) 為色譜純 (美國Tedia公司)。試驗用水為超純水 (電阻率為18.20 M.cm)。1.1.6 &nbsp;Hoagland培養(yǎng)液配方 (mol/L) &nbsp; K2SO4 8 × 104、MgSO4 6.5 × 104、KCl 1 × 104、Ca(NO3)2 2 × 103、CuSO4 1 × 107、MnSO4 1 × 106、EDTA-Fe 1 × 107、H3BO3 1 × 105、ZnSO4 1 × 106、(NH4)6Mo7O24 5 ×109。用0.01 mol/L NaOH溶液和0.01 mol/L HNO3溶液調節(jié)pH至5.848。1.1.7 &nbsp;供試菌株 &nbsp; 草酸青霉 (Penicillium oxalicum) 菌株M2為本試驗篩選菌株；斜臥青霉 (Penicilliumdecumbens) 菌株P83為本實驗室保存菌株。斜臥青霉P83和拜萊青霉ATCC20851作為對照菌株。1.1.8 &nbsp;主要的試劑和儀器 &nbsp; 真菌總DNA提取試劑盒、Taq酶和dNTP購自天根生化科技有限公司，其他試劑為國產分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。引物由上海生工生物技術有限公司合成，ITS1 (5&#39;-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3&#39;) 和ITS4 (5&#39;-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3&#39;)49；pH計為Mettler Toledo S40 seven multi；電導儀為MettlerToledo FEP30；培養(yǎng)箱為DHP-9162型，購自上海一恒科技有限公司；PCR儀為GeneAmp PCR System9700；高速離心機為Heraeus公司的Sorvall BiofugeStratos；光學顯微鏡為OLYMPUS BH-2；掃描電子顯微鏡為FEI-QUANTA200；紫外分光光度儀為天美科技有限公司UV-7501。三重串聯四極桿液質聯用儀器 (美國Agilent)：主機Agilent LC 1290 Infinity2，Agilent QQQ 6470；工作站Agilent Masshunter。1.2 &nbsp; &nbsp;試驗方法1.2.1 &nbsp;溶磷菌株的分離鑒定 &nbsp; 采用梯度稀釋法獲得系列稀釋倍數的土壤菌懸液。稱取1g保藏于4冰箱的新鮮土壤，用0.85%滅菌的生理鹽水將土壤樣品稀釋至102105倍，分別吸取0.1 mL土壤懸液涂布于無機磷培養(yǎng)基平板上，每個濃度土壤懸液重復涂布3個平板。置于培養(yǎng)箱中28倒置培養(yǎng)，選擇溶磷圈較大的菌株，轉接到PDA固體培養(yǎng)基平板上，純化后接入PDA斜面保藏。表 1 &nbsp; 供試土壤理化性狀Table 1 &nbsp; The physico-chemical properties of test soils土壤類型Soil type電導率 (mS/cm)EC有機質 (g/kg)Organic matter有效磷 (mg/kg)Avail. P速效鉀 (mg/kg)Avail. K水稻土Paddy soil 0.25 17.46 5.58 185.99黏性潮土Fluvo-aquic soils 0.30 10.96 6.01 219.81鹽潮土Salinized fluvo-aquic soil 1.04 21.61 5.94 318.43石灰性潮土Calcareous fluvo-aquic soil 0.22 31.22 8.26 129.633 期江紅梅，等：一株耐鹽溶磷真菌的篩選、鑒定及其生物肥料的應用效果731 &nbsp;1.2.2 &nbsp;懸浮培養(yǎng)試驗 &nbsp; 將100 mL含5 g/L難溶磷的Pikovskaya培養(yǎng)液盛入三角瓶中，難溶磷磷源分別為磷酸三鈣、磷酸鋁、開陽磷礦粉 (Kaiyang RP)、錦屏磷礦粉 (JPRP)、晉寧磷礦粉 (JNRP)、釩山磷礦粉(FSRP) 和昆陽磷礦粉 (Kunyang RP)。于121滅菌30 min，接種1 mL溶磷菌懸液于無菌培養(yǎng)基中。試驗處理包括：1) 對照 (CK)，接入1 mL滅菌培養(yǎng)液； 2) 黑曲霉菌P83；3) 草酸青霉菌M2。每個處理3次重復。置于28、160 r/min搖床培養(yǎng)，分別于3、6和9 d，取菌液5 mL，12000 r/min、4離心5 min，取上清液測定有效磷含量。1.2.3 &nbsp;供試菌株在磷酸三鈣、磷酸鋁和磷礦粉溶磷過程中的pH值變化 &nbsp; 試驗設置同1.2.2的方法，分別測定在磷酸三鈣、磷酸鋁和5種磷礦粉中接種菌株M2、P83時，溶液pH值的變化。1.2.4 &nbsp;供試菌株耐鹽性測定 &nbsp; 用無菌接種環(huán)從長滿菌絲體的PDA培養(yǎng)液中，挑取一個較大的小球體接入固體耐鹽培養(yǎng)基中央，置于28恒溫培養(yǎng)箱中，從第3 d開始每日觀察并記錄菌絲在NaCl含量分別為0%、5%、7.5%、10%和12.5%的PDA平板中的生長狀況。1.2.5 &nbsp;溶磷菌劑的制備 &nbsp; 將50 g草炭置于500 mL三角瓶中，121間歇式滅菌3次，每次30 min。供試溶磷菌株M2、P83分別接種于PDA固體平板上，28倒置培養(yǎng)5 d，用接種環(huán)輕輕刮取孢子到50 mL滅菌PDB培養(yǎng)液中。在顯微計數板上計數，用培養(yǎng)液平衡至孢子數量約為1 × 108 cfu/mL時，供試菌株的菌液與滅菌草炭以11 (v/w) 混合均勻，28恒溫箱中培養(yǎng)1周備用。1.2.6 &nbsp;液質聯用 (LC-MS) 測定草酸青霉菌M2溶磷過程中產生的有機酸 &nbsp; 在200 mL三角瓶中裝入100mL的Pikovskaya液體培養(yǎng)基，磷源分別為磷酸三鈣、磷酸鋁和昆陽磷礦粉三種。滅菌后接種1 mL106 cfu溶磷真菌M2的孢子懸液，在28，170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)6 d。將菌液12000 r/min離心2 min取上清，加入2滴0.05%百里酚以抑制微生物活動并防止有機酸分解。將菌液過水相0.22 m濾膜后上機測試。有機酸標準液配制：分別精確稱取酒石酸(Tartaric acid)、草酸 (Oxalic acid)、蘋果酸 (Malicacid)、檸檬酸 (Citric acid)、乳酸 (Lactic acid)、延胡索酸 (Fumaric acid) 和琥珀酸 (Succinic acid)7種有機酸的標準品 (精確至0.0001 g)，用流動相A溶解稀釋，用孔徑0.22 m的微孔濾膜過濾，定容于50mL容量瓶中，配制質量濃度為100 mg/L的儲備液，4冷藏。標準曲線繪制：根據文獻12及實際操作中紫外吸收靈敏度，將草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、延胡索酸、琥珀酸按照2.555550.515的比例配制混標，逐級稀釋成5、10、20倍分別為a、b、c和d級別的標準液，現配現用。其中a級別標準溶液的質量濃度為56、120、140、103、150、10.8和300 mg/L。1) 高效液相條件 流動相A配制：精準稱量KH2PO4 (精確至0.000 1 g)，用超純水溶解配制濃度為0.01 mol/L，加入適量H3PO4調節(jié)pH值至2.73，經水系孔徑為0.22 m的微孔濾膜過濾，超聲脫氣后備用。流動相B為0.1%丙酸水甲醇 = 8020，經超聲脫氣后備用。色譜柱為ZORBAX SB C18 (5 m，250 mm × 4.6 mm)，流速為0.5 mL/min，柱溫為25，進樣量10 L，運行時間10 min。2) 質譜條件 負離子掃描，SIM模式，干燥氣溫度300，鞘氣溫度250，毛細管電壓3500 V，噴嘴電壓500 V。1.2.7 &nbsp;液質聯用 (LC-MS) 測定草酸青霉菌M2溶磷過程中分泌的植物激素 &nbsp; 試驗設計同1.2.6的方法。植物激素標準液配制：分別精確稱取生長素(IAA) 和玉米素 (Zeatin) 標準品 (精確至0.0001 g)，以甲醇溶解稀釋，用孔徑0.22 m的微孔濾膜過濾，定容于50 mL容量瓶中，配制質量濃度為100 mg/L的儲備液，4冷藏。1) 高效液相條件 流動相為5 mmol/L甲酸銨水甲醇 = 7030。色譜柱為Eclipse XDB C18(3.5 m，2.1 mm × 150 mm)，流速為0.3 mL/min，柱溫為25，進樣量10 L，運行時間6 min。2) 質譜條件 正離子掃描，MRM模式，干燥氣溫度300，鞘氣溫度250，毛細管電壓3500 V，噴嘴電壓500 V。1.2.8 &nbsp;盆栽試驗 &nbsp; 玉米種子用0.4%的次氯酸鈉進行表面消毒，用無菌蒸餾水沖洗4次，除去次氯酸鈉，再用55無菌蒸餾水浸種，30溫箱培養(yǎng)過夜后將種子轉入滅菌紗布上催芽。試驗使用塑料盆 (18 cm ×15 cm × 15 cm)，每盆裝土壤750 g。供試土壤有四種，水稻土、黏性潮土、鹽潮土和石灰性潮土。供試磷源為三種，分別是Ca3(PO4)2、AlPO4 和昆陽磷礦粉 (RP)，每種磷源用量為1.0 g/kg土壤。菌劑處理為：1) 對照 (CK)，加入滅菌草炭和Pikovskaya培養(yǎng)液；2) 接種溶磷菌P83；3) 接種溶磷菌M2。稱取菌732植 物 營 養(yǎng) 與 肥 料 學 報24 卷劑1.50 g/盆，與2.25 g滅菌草炭混勻后，與土壤混合均勻。試驗采用完全隨機設計方案。每個處理重復4次，共計144盆。溫室種植 (2014年3月28日種植，5月4日收獲，北京白天平均28，夜間平均18)，每盆播種2粒發(fā)芽的玉米種子。生長期間保持土壤濕度在65%75%。采集玉米根際土壤樣品和收獲玉米植株，測定植株鮮重、干重和土壤有效磷含量。玉米品種為鄭單958。1.2.9 &nbsp;小區(qū)試驗 &nbsp; 2014年5月在北京市唐家?guī)X布置了田間小區(qū)試驗。供試菌株為M2、P83和ATCC20851為對照菌株，試驗地面積為40 m2 (10 m × 4 m)，將其劃分為1.8 m × 0.8 m的小區(qū)，每個小區(qū)接種菌劑300 g。菌劑處理為：1) 對照 (CK)，只加入滅菌草炭和Pikovskaya培養(yǎng)液；2) 接種ATCC20851溶磷菌劑；3) 接種P83溶磷菌劑；4) 接種M2溶磷菌劑。每個處理重復4次，溶磷菌劑與表層15 cm土壤混合均勻后培壟 (200 cm × 20 cm × 20 cm)，每個壟種植花生16棵，155 d收獲。測定花生植株鮮重和干重、花生果實鮮重和干重。將小區(qū)產量折合為每公頃的產量，收獲時采集花生根部土壤測定土壤有效磷含量。1.3 &nbsp; &nbsp;數據統(tǒng)計分析采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析 (SASInstitute Inc., Cary, NC, USA)。利用SPSS 19.0軟件中的一般線性模型 (General Lineral Model forUnivariate，GLMUnivariate) 進行多因素方差分析。2 &nbsp; &nbsp;結果和分析2.1 &nbsp; &nbsp;溶磷菌的篩選、鑒定從向日葵根圍土壤樣品中共分離到5株溶磷真菌，其中真菌M2在無機磷培養(yǎng)基上生長良好，7天能夠將9 cm培養(yǎng)皿內的無機磷全部溶解，說明該菌溶磷能力較強，故選擇菌株M2作為本試驗的供試菌株。菌株M2在PDA培養(yǎng)基中28培養(yǎng)，菌落生長迅速，菌絲體為白色，菌落中央有臍凸。3天后出現灰綠色分生孢子，5天時分生孢子多且極易脫落，無滲出液背面為淺黃色。顯微鏡下觀察到菌絲成束且無隔斷，呈帚狀枝單輪生，壁光滑。分生孢子為圓形，直徑約3 m。利用ITS rDNA特異引物對菌株進行PCR擴增得到562 bp的目的DNA片段，利用Blast軟件與GenBank的序列進行同源性比較，</p>