2018年 第 4期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 2018 , V o l 38 N o 4 灰 霉 病 是 一 種 常 見(jiàn) 的 真 菌 性 病 害 ， 是 葡 萄 、 番 茄 、 草 莓 、 黃 瓜 等 經(jīng) 濟(jì) 作 物 種 植 過(guò) 程 以 及 在 采 摘 保 鮮 過(guò) 程 中 常 見(jiàn) 且 為 害 巨 大 的 病 害 1 -4 ， 也 是 花 卉 栽 培 中 常 見(jiàn) 病 害 5 。 該 病 尤 其 是 在 設(shè) 施 條 件 下 種 植 的 蔬 菜 、 花 卉 中 常 見(jiàn) 發(fā) 生 ， 防 治 不 及 時(shí) 極 易 造 成 較 大 損 失 。 灰 霉 病 的 病 原 菌 屬 于 真 菌 子 囊 菌 綱 核 盤(pán) 菌 科 葡 萄 孢 屬 。 目 前 葡 萄 孢 屬 約 有 30個(gè) 種 6 ， 其 中 大 部 分 種 可 導(dǎo) 致 植 物 病 害 。 萬(wàn) 壽 菊 是 常 見(jiàn) 的 草 本 花 卉 ， 由 于 其 抗 性 好 、 病 蟲(chóng) 害 少 、 栽 培 簡(jiǎn) 單 、 耐 粗 放 管 理 ， 已 成 為 花 境 、 花 壇 、 道 路 裝 飾 的 主 要 植 物 材 料 。 除 了 觀 賞 價(jià) 值 ， 萬(wàn) 壽 菊 花 朵 還 是 含 保 健 成 分 葉 黃 素 含 量 最 豐 富 的 植 物 組 織 ， 是 目 前 天 然 葉 黃 素 提 取 的 主 要 原 料 。 近 幾 年 ， 伴 隨 國(guó) 內(nèi) 人 民 生 活 水 平 的 普 遍 提 高 ， 天 然 葉 黃 素 需 求 逐 年 增 加 ， 間 接 帶 動(dòng) 了 萬(wàn) 壽 菊 種 植 產(chǎn) 業(yè) 的 發(fā) 展 。 在 北 京 延 慶 ， 大 面 積 種 植 的 色 素 萬(wàn) 壽 菊 不 僅 為 葉 黃 素 提 取 提 供 了 原 料 ， 同 時(shí) 打 造 的 花 海 景 觀 也 帶 動(dòng) 了 觀 光 旅 游 、 餐 飲 等 產(chǎn) 業(yè) 的 進(jìn) 一 步 發(fā) 展 ， 有 效 帶 動(dòng) 了 當(dāng) 地 農(nóng) 民 增 收 致 富 。 萬(wàn) 壽 菊 通 過(guò) 種 子 繁 殖 ， 商 業(yè) 化 的 萬(wàn) 壽 菊 種 子 主 北 京 萬(wàn) 壽 菊 灰 霉 病 病 原 菌 分 離 鑒 定 陳 東 亮 1 ， 李 明 遠(yuǎn) 1 ， 程 曦 1 ， 李 雪 梅 1 ， 王 玲 玲 1， 2 ， 黃 叢 林 1 （ 1. 北 京 市 農(nóng) 林 科 學(xué) 院 北 京 農(nóng) 業(yè) 生 物 技 術(shù) 研 究 中 心 /北 京 市 功 能 花 卉 工 程 技 術(shù) 研 究 中 心 /農(nóng) 業(yè) 基 因 資 源 與 生 物 技 術(shù) 北 京 市 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室 ， 北 京 100097； 2 . 西 藏 農(nóng) 牧 學(xué) 院 ， 西 藏 林 芝 860000） 摘 要 ： 對(duì) 北 京 四 海 色 素 萬(wàn) 壽 菊 制 種 溫 室 發(fā) 生 的 疑 似 灰 霉 病 調(diào) 查 發(fā) 現(xiàn) ，萬(wàn) 壽 菊 植 株 發(fā) 生 葉 片 水 漬 狀 枯 斑 、萎 蔫 等 ，嚴(yán) 重 的 甚 至 整 株 枯 萎 死 亡 ，造 成 了 重 大 損 失 。 為 明 確 其 病 原 ，對(duì) 病 原 菌 進(jìn) 行 了 分 離 、培 養(yǎng) 和 快 速 致 病 性 測(cè) 定 ，并 對(duì) 分 離 的 菌 株 進(jìn) 行 DNA 提 取 和 基 因 序 列 分 析 。 結(jié) 合 生 物 學(xué) 特 征 和 基 于 基 因 序 列 的 分 子 進(jìn) 化 樹(shù) 分 析 ，鑒 定 該 病 原 菌 為 灰 葡 萄 孢 （ B o t r y t i s c i n e r e a ） 。 關(guān) 鍵 詞 ： 萬(wàn) 壽 菊 ； 灰 霉 病 ； 灰 葡 萄 孢 ； 鑒 定 中 圖 分 類 號(hào) ： S435. 672 ； S432 . 44 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識(shí) 碼 ： A 文 章 編 號(hào) ： 1672 -682 0（ 2 018） 04-0011-06 收 稿 日 期 ： 2 017-10-2 4； 修 回 日 期 ： 2 018-01-15 基 金 項(xiàng) 目 ： 北 京 市 農(nóng) 林 科 學(xué) 院 創(chuàng) 新 基 金 （ JNKST 2 01610、 KJCX2 0170108） ； 北 京 市 科 技 計(jì) 劃 課 題 （ Z 161100001116091） ； 北 京 市 功 能 花 卉 工 程 技 術(shù) 研 究 中 心 創(chuàng) 新 平 臺(tái) 項(xiàng) 目 作 者 簡(jiǎn) 介 ： 陳 東 亮 ， 博 士 ， 助 理 研 究 員 ， 研 究 方 向 為 植 物 分 子 生 物 學(xué) 。 E- m a i l ： d l c h e n 1984 12 6.c o m * 通 訊 作 者 ： 黃 叢 林 ， 博 士 ， 研 究 員 ， 研 究 方 向 為 花 卉 新 品 種 培 育 與 栽 培 技 術(shù) 研 究 。 E- m a i l ： c o n g l i n h 12 6.c o m 。 P a t h o g e n i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f g r e y m o l d o n m a r i g o l d i n B e i j i n g Ch e n Do n g l i a n g 1 ,L i Mi n g y u a n 1 ,Ch e n g Xi 1 ,L i Xu e m e i 1 ,W a n g L i n g l i n g 1, 2 ,Hu a n g Co n g l i n 1 （ 1.Be i j i n g Ag r i c u l t u r a l T e c h n o l o g y Re s e a r c h Ce n t r e ,Be i j i n g Ac a d e m y o f Ag r i c u l t u r e a n d Fo r e s t r y Sc i e n c e / Be i j i n g Fu n c t i o n Fl o w e r s En g i n e e r i n g T e c h n o l o g y Re s e a r c h Ce n t e r /Be i j i n g Ke y L a b o r a t o r y o f Ag r i c u l t u r a l G e n e Re s o u r c e a n d Bi o l o g i c a l T e c h n o l o g y ,Be i j i n g 100097,Ch i n a ;2 .T i b e t Co l l e g e o f Ag r i c u l t u r a l a n d An i m a l Hu s b a n d r y ,L i n z h i T i b e t 860000,Ch i n a ） A b s t r a c t :Su s p e c t e d g r e y m o l d d i s e a s e w a s i n v e s t i g a t e d i n Si h a i s e s u g r e e n h o u s e o f m a r i g o l d s e e d p r o d u c t i o n b a s e s i n Be i j i n g ,w h e r e s y m p t o m s o f h y g r o p h a n o u s s p o t a n d w i l t s o n m a r i g o l d a n d e v e n d e a d p l a n t w i t h h e a v y l o s s w e r e f o u n d .T h e p a t h o g e n w a s i s o l a t e d a n d c u l t u r e d ， DNA e x t r a c t i o n o f t h e i s o l a t e d s t r a i n s w e r e c o n d u c t e d ,a n d t h e s e q u e n c e s o f g 3p d h 、 h s p 6 0 a n d r b p 2 w e r e a n a l y z e d .Ba s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d m o l e c u l a r e v o l u t i o n a r y t r e e o f p a r t i c u l a r g e n e s ,t h e p a t h o g e n w a s i d e n t i f i e d a s B o t r y t i s c i n e r e a . K e y w o r d s :m a r i g o l d ;g r e y m o l d ;B o t r y t i s c i n e r e a ;i d e n t i f i c a t i o n 11 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 拉 丁 名 菌 株 號(hào) Ge n Ba n k 登 陸 號(hào) r b p 2 h s p 60 g 3 p d h B. a c l a d a P RI006 AJ745 665 AJ71605 1 AJ704993 B. a l l i i MU C L403 AJ745 666 AJ71605 5 AJ704996 B. b y s s o i d e a MU C L94 AJ745 670 AJ71605 9 AJ704998 B. c a l t h a e C BS 175 .63 AJ745 671 AJ716060 AJ704999 B. c a r o l i n i a n a C B15 JF8115 90 JF8115 87 JF8115 84 B.c o n v o l u t a 9801 AJ745 679 AJ716068 AJ705 007 B. c i n e r e a S AS 5 6 AJ745 677 AJ716067 AJ705 006 B. c r o c i MU C L436 AJ745 681 AJ716070 AJ705 009 B. d e w e y a e C BS 134649 HG7995 18 HG7995 19 HG7995 21 B. e l l i p t i c a BE 9714 AJ745 684 AJ716073 AJ705 012 B. f a b a e C BS 109.5 7 AJ745 685 AJ716074 AJ705 013 B. f a b i o p s i s Br o a d b e a n BC -2 E U 5 14473 E U 5 14482 E U 5 19211 B. f i c a r i a r u m C BS 176.63 AJ745 687 AJ716076 AJ705 015 B. g a l a n t h i n a MU C L435 AJ745 689 AJ716079 AJ705 018 B. g l a d i o l o r u m 9701 AJ745 691 AJ716080 AJ705 019 B. g l o b o s a MU C L444 AJ745 693 AJ716083 AJ705 022 B. h y a c i n t h i 0001 AJ745 695 AJ716084 AJ705 023 B. n a r c i s s i c o l a MU C L1885 7 AJ745 698 AJ716086 AJ705 025 B. p a e o n i a e MU C L16084 AJ745 700 AJ716089 AJ705 028 B. p e l a r g o n i i C BS 497.5 0 AJ745 662 AJ716046 AJ704990 B. p o l y b l a s t i s MU C L21492 AJ745 703 AJ716092 AJ705 031 B. p o r r i MU C L3234 AJ745 704 AJ716093 AJ705 032 B. p s e u d o c i n e r e a 10091 NJ692428 JN692400 JN692414 B. r a n u n c u l i C BS 178.63 AJ745 706 AJ716095 AJ705 034 B. s p h a e r o s p e r m a MU C L21481 AJ745 708 AJ716096 AJ705 035 B. s q u a m o s a P RI026 AJ745 707 AJ716100 AJ705 039 B. t u l i p a e BT 9830 AJ745 713 AJ716102 AJ705 041 B. s i n o a l l i i On i o n BC -23 E U 5 14479 E U 5 14488 E U 5 19217 B. s i n o v i t i c o l a GBC -3-3c JN692424 JN692396 JN692410 表 1 進(jìn) 化 樹(shù) 構(gòu) 建 用 到 的 葡 萄 孢 屬 （ B o t r y t i s s p ） 菌 株 及 序 列 要 通 過(guò) 雜 交 的 方 式 獲 得 。 為 了 獲 得 高 產(chǎn) 、 質(zhì) 量 穩(wěn) 定 的 種 子 ， 雜 交 親 本 需 要 在 設(shè) 施 條 件 下 栽 培 ， 以 減 小 不 良 自 然 條 件 對(duì) 種 子 產(chǎn) 量 和 質(zhì) 量 的 影 響 。 然 而 ， 設(shè) 施 條 件 下 的 小 氣 候 環(huán) 境 也 為 病 害 的 發(fā) 生 創(chuàng) 造 了 條 件 。 2017 年 7月 初 ， 在 北 京 延 慶 四 海 鎮(zhèn) 萬(wàn) 壽 菊 制 種 溫 室 內(nèi) ， 制 種 親 本 圃 發(fā) 生 嚴(yán) 重 病 害 ， 植 株 普 遍 出 現(xiàn) 整 枝 、 整 株 的 萎 蔫 ， 嚴(yán) 重 的 枯 萎 死 亡 ， 造 成 了 重 大 損 失 。 為 明 確 病 原 ， 對(duì) 其 病 原 菌 進(jìn) 行 了 分 離 、 培 養(yǎng) ， 并 結(jié) 合 形 態(tài) 特 征 和 分 子 檢 測(cè) 手 段 對(duì) 病 原 菌 進(jìn) 行 了 鑒 定 ， 為 進(jìn) 一 步 制 定 科 學(xué) 合 理 的 防 治 措 施 奠 定 了 基 礎(chǔ) 。 1 材 料 與 方 法 1 1 病 原 菌 的 分 離 與 培 養(yǎng) 于 北 京 延 慶 區(qū) 四 海 鎮(zhèn) 萬(wàn) 壽 菊 發(fā) 病 溫 室 內(nèi) ， 采 集 萬(wàn) 壽 菊 發(fā) 病 植 株 枝 條 ， 裝 入 干 凈 的 保 鮮 袋 中 帶 回 實(shí) 驗(yàn) 室 ， 于 4 冷 藏 箱 中 保 存 備 用 。 將 其 葉 片 去 除 ， 用 自 來(lái) 水 刷 洗 枝 條 表 面 ， 并 將 其 剪 成 3 5c m 的 莖 段 。 依 次 用 70% 乙 醇 浸 泡 3 m i n ， 1% 次 氯 酸 鈉 浸 泡 3 m i n 對(duì) 莖 段 表 面 消 毒 ， 最 后 無(wú) 菌 水 沖 洗 干 凈 后 ， 在 超 凈 臺(tái) 中 剝 去 枝 條 外 皮 層 ， 內(nèi) 部 組 織 切 成 0.2 0.3 c m 12 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 小 塊 ， 分 別 放 置 到 6 cm PDA 培 養(yǎng) 基 平 板 中 心 ， 于 25 進(jìn) 行 恒 溫 培 養(yǎng) 。 待 菌 絲 生 長(zhǎng) 至 滿 培 養(yǎng) 皿 時(shí) ， 轉(zhuǎn) 入 L/ D=12 h /12 h 光 暗 交 替 培 養(yǎng) 箱 進(jìn) 行 孢 子 誘 發(fā) 。 誘 發(fā) 的 孢 子 用 無(wú) 菌 水 沖 洗 下 來(lái) ， 取 少 量 涂 布 于 新 的 PDA 培 養(yǎng) 基 中 ， 在 超 凈 臺(tái) 無(wú) 菌 環(huán) 境 于 顯 微 鏡 下 挑 取 單 孢 子 。 單 孢 子 于 PDA 培 養(yǎng) 基 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 出 菌 絲 及 孢 子 后 ， 在 顯 微 鏡 下 觀 察 孢 子 梗 、 孢 子 等 形 態(tài) 特 征 ， 并 拍 照 。 1 2 萬(wàn) 壽 菊 培 養(yǎng) 與 快 速 致 病 性 檢 測(cè) 將 萬(wàn) 壽 菊 種 子 撒 播 于 草 炭 蛭 石 （ 11）基 質(zhì) 中 ，覆 蓋 透 明 塑 料 布 保 濕 ， 置 于 植 物 培 養(yǎng) 箱 中 ， 25 下 于 L/ / D= 16h / / 8h 光 暗 交 替 培 養(yǎng) ，待 種 子 發(fā) 芽 后 去 掉 塑 料 布 。 種 子 苗 長(zhǎng) 至 3 5片 真 葉 時(shí) ，移 栽 入 10cm 穴 盤(pán) 中 ，于 溫 室 中 進(jìn) 行 正 常 培 養(yǎng) 。 待 植 株 生 長(zhǎng) 至 15cm 左 右 高 時(shí) ，采 取 羽 狀 復(fù) 葉 進(jìn) 行 分 離 物 致 病 性 的 快 速 檢 測(cè) 。 離 體 葉 片 快 速 檢 測(cè) 的 步 驟 ： 9cm 培 養(yǎng) 皿 鋪 3層 滅 菌 濾 紙 ， 噴 灑 無(wú) 菌 水 至 濾 紙 濕 透 ； 剪 取 新 鮮 萬(wàn) 壽 菊 葉 片 ， 除 去 頂 部 小 葉 至 剛 好 能 放 入 培 養(yǎng) 皿 中 ； 取 少 量 帶 有 （ 病 菌 ） 菌 絲 的 培 養(yǎng) 基 塊 ， 放 置 于 葉 片 葉 柄 基 部 ， 蓋 上 培 養(yǎng) 皿 保 濕 ， 在 25 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng) 。 以 濕 潤(rùn) 的 無(wú) 菌 棉 球 替 換 菌 塊 做 陰 性 對(duì) 照 ， 每 個(gè) 處 理 設(shè) 置 3個(gè) 生 物 學(xué) 重 復(fù) 。 1 3 D N A 提 取 與 基 因 測(cè) 序 凍 融 法 快 速 提 取 單 孢 系 菌 絲 DNA： 無(wú) 菌 槍 頭 挑 取 少 量 新 鮮 菌 絲 ， 置 于 預(yù) 裝 有 100 L無(wú) 菌 水 的 1.5 m L離 心 管 中 ， 渦 旋 振 蕩 使 菌 絲 松 散 ； 沸 水 浴 5 10 m i n ， 迅 速 置 于 液 氮 中 冷 凍 3 5 m i n ； 室 溫 解 凍 ， 12 000 r /m i n 離 心 5 m i n ， 上 清 液 即 DNA 溶 液 ， 可 直 接 做 PCR 擴(kuò) 增 的 模 板 ， 用 于 擴(kuò) 增 g 3p d h 、 h s p 60及 r b p 2基 因 片 段 的 引 物 序 列 7 。 20 L的 PCR反 應(yīng) 體 系 ： Vaz y m e 2× m i x 10 L （ 南 京 諾 唯 贊 生 物 科 技 有 限 公 司 ） ， 上 下 游 引 物 各 0.5 L（ 10 m o l /L） ， 模 板 9 L。 PCR產(chǎn) 物 用 1%瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測(cè) ， 預(yù) 期 條 帶 經(jīng) 純 化 回 收 后 連 接 于 克 隆 載 體 p G EM T- e as y （ Pr o m e g a， U SA） ， 并 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌 DH5 ， 陽(yáng) 性 克 隆 送 生 工 生 物 （ 上 海 ） 股 份 有 限 公 司 測(cè) 序 。 1 4 序 列 分 析 與 進(jìn) 化 樹(shù) 構(gòu) 建 測(cè) 序 結(jié) 果 利 用 DNA St ar 5.01軟 件 進(jìn) 行 拼 接 和 初 步 處 理 。 3個(gè) 基 因 序 列 按 g 3p d h 、 h s p 60、 r b p 2的 順 序 依 次 拼 接 成 一 個(gè) 聚 合 序 列 ， 兩 端 及 不 同 序 列 間 加 保 護(hù) 性 堿 基 區(qū) 分 。 Cl u s x t al 1.83軟 件 進(jìn) 行 序 列 的 比 對(duì) 分 析 ， 采 用 MEG A 4.0軟 件 中 的 鄰 接 法 （ Ne i g h bo r - Jo i n i n g ， NJ） 法 構(gòu) 建 不 同 株 系 基 于 3基 因 的 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹(shù) ， 靴 帶 值 （ Bo o t s t r ap v al u e ） 設(shè) 置 為 1 000。 參 與 進(jìn) 化 樹(shù) 構(gòu) 建 的 其 他 葡 萄 孢 屬 菌 株 的 G 3D P H 、 H S P 60及 R B P 2基 因 序 列 均 下 載 自 美 國(guó) 國(guó) 立 生 物 技 術(shù) 信 息 中 心 （ Nat i o n al Ce n t e r f o r Bi o t e ch n o l o g y I n f o r m at i o n ， NCBI ） 數(shù) 據(jù) 庫(kù) ， 各 序 列 G e n Ban k 收 錄 號(hào) 、 菌 株 號(hào) 、 拉 丁 名 等 信 息 見(jiàn) 表 1。 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 萬(wàn) 壽 菊 灰 霉 病 病 害 特 征 北 京 延 慶 區(qū) 萬(wàn) 壽 菊 雜 交 制 種 溫 室 發(fā) 生 的 萬(wàn) 壽 菊 灰 霉 病 在 感 染 初 期 ， 其 癥 狀 主 要 表 現(xiàn) 為 部 分 葉 片 頂 部 黃 化 并 出 現(xiàn) 水 漬 狀 枯 斑 （ 圖 1a） ， 隨 著 病 情 的 發(fā) 展 ， 整 個(gè) 葉 片 萎 蔫 ， 逐 漸 在 莖 稈 上 近 葉 柄 基 礎(chǔ) 處 可 見(jiàn) 黑 色 條 斑 （ 圖 1b） ， 進(jìn) 一 步 發(fā) 展 為 整 個(gè) 枝 條 的 萎 蔫 （ 圖 1c） ， 最 終 整 個(gè) 枝 條 甚 至 整 株 枯 萎 死 亡 （ 圖 1d） 。 病 害 在 多 個(gè) 制 種 溫 室 普 遍 發(fā) 生 ， 初 步 統(tǒng) 計(jì) ， 8月 下 旬 ， 伴 有 整 枝 或 整 株 枯 死 的 植 株 在 25%左 右 。 此 時(shí) 為 雜 交 制 種 的 關(guān) 鍵 期 ， 病 害 發(fā) 生 對(duì) 種 子 產(chǎn) 量 和 品 質(zhì) 造 成 了 較 大 影 響 。 2 2 病 原 菌 的 分 離 與 致 病 性 檢 測(cè) 從 帶 病 的 萬(wàn) 壽 菊 枝 條 分 離 得 到 3個(gè) 分 離 物 。 其 分 離 物 進(jìn) 一 步 通 過(guò) 挑 單 孢 子 ， 得 到 6個(gè) 單 孢 系 。 獲 得 的 單 孢 系 采 用 離 體 葉 片 侵 染 的 方 法 進(jìn) 行 檢 測(cè) ， 在 接 種 后 的 3 4 d內(nèi) 均 可 見(jiàn) 明 顯 水 漬 狀 枯 死 斑 ， 并 由 靠 近 葉 柄 的 小 葉 逐 漸 發(fā) 展 至 整 個(gè) 葉 片 。 這 種 水 漬 狀 枯 死 斑 與 田 間 發(fā) 現(xiàn) 的 葉 尖 部 枯 死 斑 類 似 （ 圖 2） ， 而 對(duì) 照 未 發(fā) 現(xiàn) 類 似 枯 死 斑 （ 圖 2CK） ， 表 明 本 研 究 分 離 獲 得 的 即 為 田 間 病 害 的 病 原 菌 。 2 3 病 原 菌 形 態(tài) 特 征 分 離 自 萬(wàn) 壽 菊 的 病 原 菌 接 種 于 6 cm PDA 平 板 培 養(yǎng) 基 ， 于 生 化 培 養(yǎng) 箱 中 25 恒 溫 培 養(yǎng) 2 d， 白 色 霧 狀 菌 絲 可 覆 蓋 1/2平 板 ， 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 1 2 d可 覆 蓋 整 個(gè) 培 養(yǎng) 皿 （ 圖 3a） 。 菌 絲 移 至 光 暗 交 替 環(huán) 境 中 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 5 7d， 長(zhǎng) 出 分 生 孢 子 （ 圖 3b） 。 分 生 孢 子 為 近 無(wú) 色 ， 呈 倒 卵 型 ， 單 孢 ， 大 小 為 （ 11.16 19.73） m × （ 6.99 8.55） m 。 孢 子 梗 為 多 枝 簇 生 ， 直 立 或 稍 彎 曲 ， 長(zhǎng) 為 3 4 m m （ 圖 3c） 。 長(zhǎng) 滿 菌 絲 的 培 養(yǎng) 皿 繼 續(xù) 培 養(yǎng) ， 會(huì) 生 長(zhǎng) 出 黑 色 菌 核 （ 圖 3d） ， 菌 核 大 小 不 一 。 基 于 以 上 特 征 ， 推 測(cè) 為 葡 萄 孢 屬 灰 葡 萄 孢 （ B .c i n e r e a ） 或 13 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 a .葉 片 水 漬 狀 枯 死 b .莖 稈 黑 色 條 斑 c .枝 條 萎 蔫 d .整 株 枯 死 圖 1 北 京 延 慶 地 區(qū) 萬(wàn) 壽 菊 灰 霉 病 發(fā) 病 特 征 a c .菌 絲 侵 染 C K .陰 性 對(duì) 照 圖 2 分 離 自 北 京 萬(wàn) 壽 菊 上 的 灰 霉 病 分 離 物 離 體 侵 染 實(shí) 驗(yàn) 其 近 源 種 B . p e l a r g o n i i 。 其 據(jù) 孢 子 形 態(tài) 上 極 難 分 辨 ， 需 進(jìn) 行 進(jìn) 一 步 分 子 鑒 定 。 2 4 分 子 鑒 定 選 取 最 具 代 表 性 的 單 孢 系 ， 利 用 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 的 通 用 引 物 ， 對(duì) 其 g 3 p d h 、 h s p 6 0、 r b p 2等 3個(gè) 基 因 片 段 進(jìn) 行 了 克 隆 和 測(cè) 序 。 獲 得 的 序 列 在 G e n B a n k 進(jìn) 行 了 登 錄 ， 登 錄 號(hào) 分 別 為 M F 174048、 M F 174047和 M F - 174046。 基 于 3個(gè) 基 因 片 段 聚 合 序 列 ， 構(gòu) 建 了 葡 萄 孢 14 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 a . 菌 絲 b . 分 生 孢 子 c . 分 生 孢 子 梗 d . 菌 核 圖 3 分 離 自 北 京 萬(wàn) 壽 菊 上 的 灰 霉 病 分 離 物 形 態(tài) 特 征 屬 2 9 個(gè) 種 與 本 研 究 分 離 物 的 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹(shù) 。 從 進(jìn) 化 樹(shù) 中 清 晰 看 出 ， 本 研 究 中 分 離 的 萬(wàn) 壽 菊 灰 霉 病 病 原 菌 與 B . c i n e r e a 關(guān) 系 最 近 ， 進(jìn) 一 步 表 明 ， 本 研 究 在 延 慶 溫 室 萬(wàn) 壽 菊 上 發(fā) 現(xiàn) 的 灰 霉 病 病 原 菌 為 灰 葡 萄 孢 ， 這 與 孢 子 形 態(tài) 觀 察 的 結(jié) 果 一 致 。 3 結(jié) 論 與 討 論 灰 霉 病 為 植 物 常 見(jiàn) 病 害 ， 在 萬(wàn) 壽 菊 大 田 栽 培 中 也 時(shí) 有 發(fā) 生 ， 一 般 發(fā) 病 于 夏 末 秋 初 天 氣 冷 涼 ， 多 雨 高 濕 時(shí) 期 。 田 間 萬(wàn) 壽 菊 灰 霉 病 主 要 表 現(xiàn) 為 枝 葉 萎 蔫 ， 嚴(yán) 重 時(shí) 整 枝 、 整 株 都 會(huì) 枯 萎 死 亡 。 在 濕 度 較 大 時(shí) ， 枯 死 枝 條 和 花 朵 上 可 見(jiàn) 灰 色 的 孢 子 層 ， 而 孢 子 層 也 往 往 作 為 鑒 別 灰 霉 病 重 要 表 觀 特 征 。 本 次 發(fā) 現(xiàn) 的 病 害 發(fā) 生 于 延 慶 四 海 萬(wàn) 壽 菊 制 種 溫 室 內(nèi) ， 病 害 特 征 與 田 間 類 似 ， 但 較 田 間 發(fā) 病 期 稍 早 ， 且 未 見(jiàn) 明 顯 灰 霉 層 特 征 ， 這 可 能 與 發(fā) 病 時(shí) 期 以 及 溫 室 內(nèi) 的 特 殊 小 氣 候 環(huán) 境 有 關(guān) 。 在 延 慶 四 海 鎮(zhèn) 萬(wàn) 壽 菊 種 植 區(qū) ， 灰 霉 病 暴 發(fā) 時(shí) 多 伴 有 萬(wàn) 壽 菊 黑 斑 病 的 發(fā) 生 ， 由 于 病 晚 期 枝 條 黑 褐 色 枯 死 等 癥 狀 與 黑 斑 病 后 期 癥 狀 類 似 ， 容 易 忽 視 而 誤 診 為 黑 斑 病 ， 導(dǎo) 致 防 治 方 法 不 對(duì) ， 防 治 效 果 不 明 顯 。 研 究 表 明 ， 在 其 他 農(nóng) 作 物 中 ， 灰 霉 病 病 原 菌 主 要 通 過(guò) 傷 口 或 枯 死 組 織 8 或 殘 留 花 瓣 和 柱 頭 等 9 侵 入 植 物 ， 逐 漸 發(fā) 展 至 全 株 。 而 萬(wàn) 壽 菊 黑 斑 病 造 成 的 枯 死 斑 也 為 灰 霉 病 侵 入 和 發(fā) 展 創(chuàng) 造 了 便 利 條 件 。 準(zhǔn) 確 鑒 定 病 原 菌 是 制 定 有 效 防 治 策 略 的 前 提 條 件 。 引 起 植 物 灰 霉 病 的 病 原 菌 種 類 較 多 ， 均 屬 核 盤(pán) 菌 葡 萄 孢 屬 。 菌 絲 、 孢 子 等 形 態(tài) 特 征 是 鑒 別 真 菌 類 型 最 主 要 的 依 據(jù) ， 但 有 些 相 近 菌 種 形 態(tài) 特 征 較 為 相 似 ， 難 以 僅 依 靠 形 態(tài) 特 征 區(qū) 分 。 使 用 分 子 檢 測(cè) 技 術(shù) 可 以 從 基 因 層 面 檢 測(cè) 菌 種 甚 至 菌 系 間 的 微 小 差 異 ， 相 對(duì) 形 態(tài) 鑒 定 更 為 準(zhǔn) 確 、 快 速 。 為 鑒 定 四 海 萬(wàn) 壽 菊 制 種 圃 灰 霉 病 病 原 ， 本 團(tuán) 隊(duì) 對(duì) 病 原 菌 進(jìn) 行 了 分 離 ， 并 通 過(guò) 離 體 葉 片 進(jìn) 行 了 侵 染 性 檢 測(cè) 等 ， 最 終 確 定 了 病 原 并 基 本 確 定 其 為 核 盤(pán) 菌 科 葡 萄 孢 屬 。 進(jìn) 一 步 通 過(guò) 分 子 檢 測(cè) 方 法 ， 確 診 病 原 為 葡 萄 孢 屬 的 灰 葡 萄 孢 菌 （ B . c i n e a e a ） 。 灰 葡 萄 孢 是 一 種 常 見(jiàn) 的 植 物 致 病 病 原 菌 ， 也 是 葡 萄 孢 屬 中 已 知 的 寄 主 范 圍 最 廣 的 種 ， 可 以 侵 染 2 0 0 種 以 上 植 物 1 0 ， 造 成 病 原 菌 清 除 困 難 ， 防 治 效 果 不 理 想 。 在 2 0 1 2 年 評(píng) 選 的 1 0 大 病 害 真 菌 中 ， 灰 葡 萄 孢 排 于 第 2 位 1 1 ， 可 見(jiàn) 其 危 害 之 大 。 本 研 究 基 于 其 形 態(tài) 和 分 子 特 征 ， 對(duì) 普 遍 發(fā) 生 于 萬(wàn) 壽 菊 制 種 溫 室 內(nèi) 的 灰 霉 病 病 原 菌 進(jìn) 行 了 鑒 定 ， 為 針 對(duì) 性 制 定 科 學(xué) 合 1 5 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 B . b y s s o i d e a B . n a r c i s s i c o l a B . d r a y t o n i i B . p o l y b l a s t i s B . g l o b o s a B . s p h a e r o s p e r m a 62 99 67 99 99 99 97 99 99 99 99 8 1 B . t u l i p a e B . c r o c i B . h y a c i n t h i B . g a l a n t h i n a B . c a r o l i n i a n a B . f a b i o p s i s b o t r y t i s f r o m t a g e t i c a 54 20 75 92 99 99 55 99 99 79 97 8 3 93 99 B o t r y t i s s i n o a l l i i B . r a n u n c u l i B . f i c a r i a r u m B . d e w e y a e B . e l l i p t i c a B . s q u a m o s a B . c o n v o l u t a B . a c l a d a B . a l l i i B . p o r r i B . p a e o n i a e B . s i n o v i t i c o l a B . c a l t h a e B . p s e u d o c i n e r e a B . f a b a e B . p e l a r g o n i i B . c i n e r e a 0.005 圖 4 基 于 三 基 因 整 合 序 列 的 B o t r y t i s 屬 真 菌 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 理 預(yù) 防 措 施 奠 定 了 基 礎(chǔ) 。 參 考 文 獻(xiàn) 1 蒲 麗 ， 康 占 海 ， 蔣 家 珍 ， 等 . Si O 2 作 為 殺 菌 劑 防 治 黃 瓜 灰 霉 病 的 研 究 J . 植 物 病 理 學(xué) 報(bào) ， 2005（ s 1） ： 18 6-18 8 . 2 Va g e l a s I， Pa p a c h a t z i s A， Ka l o r i z o u H， e t a l . Bi o l o g i c a l c o n t r o l o f B o t r y t i s f r u i t r o t （ g r a y m o l d ） o n s t r a w b e r r y a n d r e d p e p p e r f r u i t s b y o l i v e o i l m Mi l l w a s t e w a t e r J . Bi o t e c h n o l o g y a n d Bi o t e c h n o l o g i c a l Eq u i p m e n t ， 2009， 23 （ 4） ： 148 9-1491. 3 張 瑋 ，喬 廣 行 ，黃 金 寶 ，等 . 中 國(guó) 葡 萄 灰 霉 病 菌 對(duì) 嘧 霉 胺 的 抗 藥 性 檢 測(cè) J . 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) ， 2013， 46（ 6） ： 1208-1212. 4 毛 勝 鳳 ， 周 湘 ， 范 聞 春 ， 等 . 喜 樹(shù) 堿 對(duì) 番 茄 灰 霉 病 菌 的 毒 理 效 應(yīng) J . 浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) ， 2015， 32（ 4） ： 58 5-58 9. 5 張 建 國(guó) ， 姬 延 偉 . 花 卉 灰 霉 病 的 癥 狀 表 現(xiàn) 與 綜 合 防 治 J . 中 國(guó) 植 保 導(dǎo) 刊 ， 2004， 24（ 4） ： 28 -29. 6 范 璇 . 主 要 果 蔬 作 物 灰 霉 病 菌 分 子 檢 測(cè) 及 鑒 定 研 究 D . 武 漢 ： 華 中 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) ， 2015. 7 St a a t s M， Va n Ba a r l e n P， Va n Ka n J A L. Mo l e c u l a r p h y l o g e n y o f t h e p l a n t p a t h o g e n i c g e n u s B o t r y t i s a n d t h e e v o l u t i o n o f h o s t s p e c i f i c i t y J . Mo l e c u l a r Bi o l o g y a n d Ev o l u t i o n ， 2005， 22（ 2） ： 333-346. 8 趙 楊 ， 苗 則 彥 ， 李 穎 ， 等 . 番 茄 灰 霉 病 防 治 研 究 進(jìn) 展 J . 中 國(guó) 植 保 導(dǎo) 刊 ，