2018年第 6期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18,VoI. 38.No. 6 果蔗作為粵北特色經(jīng)濟作物之一 ， 至今已有 30 年以上歷史 ， 主要分布在廣東省清遠市 、 英德市及韶 關(guān)市翁源縣 1 。 據(jù)統(tǒng)計 ， 英德市果蔗種植面積約為 866 . 67 hm 2 ； 翁源縣果蔗種植面積約為 2 133 . 33 hm 2 。 黑皮果蔗 （ Badila ） 和黃皮果蔗是粵北果蔗種植 區(qū)主要種植品種 ， 一般產(chǎn)量可達 120 t/hm 2 ， 高產(chǎn)甘 蔗可達 150 180 t/hm 2 。 產(chǎn)品主要銷往福建 、 江西 、 安 徽 、 山東 、 河南 、 黑龍江等省 。 經(jīng)多年連年種植 ， 果蔗 病害問題日益突出 ， 嚴重影響其品質(zhì)與產(chǎn)量 ， 生產(chǎn)上 迫切需要推廣果蔗改良品種及應(yīng)用健康種苗 。 甘蔗宿根矮化病 （ ratoon stunting disease ， RSD ）、 甘蔗赤條病 （ red stripe ）、 甘蔗白條病 （ leaf scald ） 是 粵北地區(qū)果蔗細菌性病害 PCR 分子檢測 吳小斌 ， 齊永文 * ， 勞方業(yè) ， 樊麗娜 ， 何慧怡 ， 李奇?zhèn)?（ 廣東省生物工程研究所 /廣州甘蔗糖業(yè)研究所 /廣東省甘蔗遺傳改良工程技術(shù)中心 ， 廣東廣州 510316 ） 摘要 ： 為了解粵北地區(qū)果蔗主產(chǎn)區(qū)甘蔗宿根矮化病 、 赤條病和白條病病害發(fā)生和為害 ， 本研究通過 PCR技術(shù)對粵北 果蔗產(chǎn)地植株蔗莖樣品進行分子檢測 。 結(jié)果表明 ，果蔗宿根矮化病菌總檢出率為 41 . 5 ，各采樣地塊均檢測出宿根矮 化病病原菌 ， 地塊檢出率達到 100 ， 不同地塊的檢出率為 10 82. 8 。 赤條病和白條病病原菌未檢出 。 粵北地區(qū)果 蔗細菌性病害以甘蔗宿根矮化病為主 。 關(guān)鍵詞 ： 果蔗 ； 宿根矮化病 ； PCR； 細菌病害 中圖分類號 ： S435.661 文獻標識碼 ： A 文章編號 ： 1672-6820 （ 2018 ） 06-0011-05 MoIecuIar detection of pathogen of bacteria disease on sugarcane by PCR in northern Guangdong province Wu Xiaobin, Qi Yongwen, Lao Fangye, Fan Lina, He Huiyi, Li Qiwei （ Guangdong Provincial Bioengineering Institute/ Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute / Guangdong Engineering and Technical Research Center of Sugarcane Genetic Improvement, Guangzhou Guangdong 510316, China ） Abstract: Ratoon stunting disease （ RSD ） , leaf scald and red stripe are three major bacterial diseases of sugarcane. In order to understand occurring of major bacterial diseases in main fruit-cane producing areas in northern Guangdong province, some local stem samples was detected by PCR. The results showed that total positive detection rate of RSD was 41.5, and positive detection rate of RSD in plots was 100, which ranged from 10 to 82.8 among different plots. Pathogens of leaf scald and red stripe were not found by detection, and RSD was the major disease against sugarcane in northern Guangdong province. Key words: sugarcane; ratoon stunting disease; PCR; bacterial disease 收稿日期 ： 2017-12-08 ； 修回日期 ： 2018-04-11 基金項目 ： 國家糖料作物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 （ CARS - 170107 ）； 廣東省科技計劃 （ 2014B090907006 、 2014B070705002 、 2015A020209026 、 2016A030313415 、 2016A030303018 ） 作者簡介 ： 吳小斌 ， 碩士 ， 研究實習員 ， 主要從事甘蔗病害及甘蔗分子設(shè)計育種研究 。 E- mail ： wuxiaobin163 .com * 通訊作者 ： 齊永文 ， 博士 ， 研究員 ， 主要從事甘蔗種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育研究 。 E- mail ： yongwen2001163 .com 。 11 · · 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 病害名稱 上游引物名稱及序列 片段大小 （ bp ） 參考文獻 宿根矮化病 Pat1 -F2 5 -GGAATACTCGCTATGTGTTG -3 597 Fu et al. 2016 5 Pat1 -R2 5 -CCAATACTATGCCGTAGAAAG -3 赤條病 Oaf1 5 -GTCGGTGCTAACGACATGG -3 550 Song et al. 2003 28 Oar1 5 -AGACATCTCCGCTTTCTTTCAA -3 白條病 XAF1: 5 -CCTGGTGATGACGCTGGGTT -3 600 Wang et al. 1999 32 XAR1: 5 -CGATCAGCGATGCACGCAGT -3 表 1 甘蔗細菌病害檢測引物 世界各蔗區(qū)廣泛發(fā)生的重要甘蔗細菌病害 ， 國內(nèi)外 均有相關(guān)報道 ， 并出現(xiàn)大面積為害現(xiàn)象 2-11 。 甘蔗宿 根矮化病主要通過血清學 2 ， 12-18 及分子生物學 5， 19-25 的手段進行檢測 。 2016年 ， Berna 等在植物生理學與 病理學國際會議提交的會議論文中提出 ， 通過固相 微萃取和氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) ， 對澳大利亞昆 士蘭蔗區(qū)的 10多個甘蔗栽培種進行甘蔗宿根矮化 病原菌檢測 26 。 甘蔗赤條病尚無國家標準檢驗檢疫 方法 。 Song 等在病菌基因組 16S 23S 間隔區(qū)設(shè)計 1 對特異性引物 Oaf1/Oar1 ，對甘蔗病葉樣品進行 PCR 檢測 27 -28 。 傅華英等在 Aaa 菌株的 16S 23S rDNA 及其間隔區(qū)設(shè)計 2對特異性引物 ， 進行巢式 PCR擴 增 29 。 甘蔗白條病病癥不穩(wěn)定性 ， 致使直觀判斷病害 侵染存在困難 。 目前 ， 應(yīng)用酶聯(lián)方法 、 斑點和組織免 疫印跡雜交法 、 常規(guī) PCR和熒光定量 PCR檢測甘 蔗白色條紋病菌 Xanthomonas dbilineans （ Ashby ） Dowson 均有報道 4 ， 30 -32 。 為了解粵北地區(qū)果蔗細菌病害在翁源縣分布情 況 ， 本研究應(yīng)用 PCR技術(shù)對粵北地區(qū)果蔗進行細菌 病害檢測 。 本研究對粵北地區(qū)有效防控甘蔗細菌病 害 ， 推廣應(yīng)用脫毒健康種苗具有重要現(xiàn)實意義 。 1 材料與方法 1 . 1 材料 2016年 12月 ， 分別從廣東省英德市 、 翁源縣共 19個采樣點 ， 采集黑皮果蔗樣本 181份 ， 黃皮果蔗 樣本 10份 。 蔗莖經(jīng)清洗消毒后 ， 截取地上部 第 3節(jié) 部及 第 4 節(jié) 部 ， 榨 取蔗 汁約 2 mL ， 裝于 2 mL 離心 管 ， 保 存 于 -80 備 用 。 陰 性甘蔗樣品取 自 本實驗 室 合作 蔗 田 脫毒健康種苗 ， 陽 性樣品取 自 本實驗 室 染 病蔗莖 。 Ex Taq TM Version 2 . 0擴增酶 、 DNA Marker 購自 TaKaRa 公司 ， 瓊脂糖粉末購自 BIOWEST 公司 。 1 .2 實驗方法 1 .2 .1 引物合成 用 于 檢測甘蔗細菌病害引物 信息如表 1， 引物 合成由賽默飛 世 爾科 技 （ 中國 ） 有 限公司完成 。 1 .2 .2 DNA 提取及病原菌 PCR檢測 蔗 汁總 DNA 提取采用 改良 CTAB 法 ， 所 有 DNA 保 存 于 -20 備 用 。 DNA 質(zhì)量及 濃度 分 析 分別 通過 瓊脂糖凝膠電泳 檢測和 Biophotometer 生物分 光光 度 計測定 。 PCR反 應(yīng) 體系 為 25 l 12. 5 l 2 × Ex Taq premix ， 上 下 游引物各 1 l ， 0. 5 l 總 DNA 和 10 l 無菌 水 。 宿根矮化病檢測 PCR擴增 程 序為 94 預變 性 2 min ； 94 變 性 30 s ， 50 退火 30 s ， 72 延伸 60 s ， 35 個 循環(huán) ； 72 延伸 10 min 。 赤條病檢測 PCR 擴增 程 序為 94 預變 性 5 min ； 94 變 性 1 min ， 55 退火 30 s ， 72 延伸 1 min ， 10個 循環(huán) ； 72 延伸 7 min 。 白條病檢測 PCR 擴增 程 序為 94 預變 性 5 min ； 94 變 性 45 s ， 65 退火 1 min ， 72 延伸 1 min ， 10個 循環(huán) ； 94 變 性 45 s ， 65 退火 1 min ， 72 延伸 2 min ， 10個 循環(huán) ； 94 變 性 45 s ， 65 退火 1 min ， 72 延伸 3 min ， 15 個 循環(huán) ； 72 延伸 10 min 。 1 .3 數(shù)據(jù)處理 PCR擴增 產(chǎn) 物采用 1. 5 瓊脂糖凝膠電泳 檢測 ， 并觀測目的條 帶 。 每 份樣品進行 3次 生物學重 復鑒 定 ， 3次 重 復試 驗 結(jié) 果均出現(xiàn) 陽 性條 帶時 ， 確認 病原 菌檢出 ； 3次 重 復試 驗 結(jié) 果不 一 致 時 ， 再次 重檢 ， 直 至確認 。 12 · · 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18 ,VoI. 38 .No. 6 M . DL2000 DNA Marker 1. 翁城鎮(zhèn)黑皮果蔗 2.周陂鎮(zhèn)黑皮果蔗 3.官渡鎮(zhèn)黑皮果蔗 4.青塘鎮(zhèn)黑皮果蔗 5. 連州鎮(zhèn)黑皮果蔗 6. 橫石水鎮(zhèn)黑皮果蔗 7.官渡鎮(zhèn)黃皮果蔗 N1. Negative/ 橫石水鎮(zhèn)黑皮果蔗脫毒種苗 N2. Negative/ 六里鎮(zhèn)黑皮果蔗脫毒種苗 B. Blank/ 水 P. Positive/ 染病黑皮果蔗 圖 1 宿根矮化病病菌 PCR 檢測凝膠電泳 地點 （ 品種 ） 樣本莖數(shù) （ 條 ） 宿根矮化病 赤條病 白條病 陽性 （ 條 ） 檢出率 （ ） 陽性 （ 條 ） 檢出率 （ ） 陽性 （ 條 ） 檢出率 （ ） 翁城鎮(zhèn) （ 黑皮果蔗 ） 31 10 32.2 0 0 0 0 周陂鎮(zhèn) （ 黑皮果蔗 ） 31 10 32.2 0 0 0 0 官渡鎮(zhèn) （ 黑皮果蔗 ） 29 24 82.8 0 0 0 0 官渡鎮(zhèn) （ 黃皮果蔗 ） 10 1 10.0 0 0 0 0 青塘鎮(zhèn) （ 黑皮果蔗 ） 29 4 13.8 0 0 0 0 連州鎮(zhèn) （ 黑皮果蔗 ） 31 16 51.6 0 0 0 0 橫石水鎮(zhèn) （ 黑皮果蔗 ） 10 6 60.0 0 0 0 0 合計 171 71 41.5 0 0 0 0 表 2 粵北地區(qū)蔗田甘蔗樣品宿根矮化病病原菌檢出率 病菌檢出率 （ ） = 陽性樣本數(shù) /樣本莖數(shù) × 100。 2 結(jié)果與分析 經(jīng)統(tǒng)計 ， 在粵北地區(qū)蔗田隨機采集的 171份果 蔗樣本中 ， 共檢測得到 71份宿根矮化病病原菌陽性 樣品 ， 陽性檢出率為 41. 5 ； 各采樣地塊均檢測出宿 根矮化病病原菌 ， 地塊檢出率達到 100 ， 不同地塊 的檢出率為 10 82 . 8 （ 表 2）。 在瓊脂糖凝膠電泳 圖中 ， 宿根矮化病陽性樣品目的片段長度為 597 bp （ 圖 1）。 本次試驗均未檢測出赤條病病原菌及白條 病病原菌檢測 。 在粵北地區(qū)本實驗室合作蔗田隨機 采集的 20份健康種苗樣本 ， 其中 1代種苗 10份 、 2 代種苗 10份 ， 均未檢測出宿根矮化病原菌 、 赤條病 病原菌及白條病病原菌 。 3 討論 甘蔗細菌病害傳播性極強 ， 主要通過帶病種莖 及砍收工具傳播 ， 帶甘蔗宿根矮化病病原蔗汁稀釋 至 10 000倍及受污染蔗刀在陰暗處放置 7 d 仍具 有傳染力 33 -34 。 蔗農(nóng)普遍采用蔗梢繁種及傳統(tǒng)砍收 方式是果蔗細菌病害大范圍傳播的直接原因 。 由于 甘蔗細菌病原物通常淤塞于甘蔗維管束 ， 影響水分 、 有機質(zhì)等運輸 ， 大田生產(chǎn)中 ， 甘蔗宿根矮化病可造成 減產(chǎn) 10 30 ， 干旱時可減產(chǎn)達 60 以上 ， 甚至導 致種性退化 35 -36 。 但由于該病害隱蔽性強 ， 無法從外 13 · · 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 觀上直接觀測該病害的發(fā)生 ， 易與水肥管理不良等 造成的不良現(xiàn)象混淆 。 因此 ， 蔗農(nóng)對該病害認識與重 視程度嚴重缺乏 。 PCR技術(shù)作為分子生物學實驗基礎(chǔ)技術(shù)之一 ， 具有技術(shù)成熟 、 靈敏度優(yōu)異 、 特異性強 、 操作簡便 、 成 本相對低廉等優(yōu)點 。 同時 ， 蔗汁核酸提取省時 、 省力 ， 操作簡便 。 因此 ， 蔗汁病原 PCR檢測適宜作為大量 樣品病原檢測的手段之一 。 本次試驗結(jié)果表明 ， 采樣 地塊果蔗均已受宿根矮化病菌感染 ， 采樣地塊果蔗 莖種蔗已不適合進行下一輪果蔗生產(chǎn) 。 由于果蔗生產(chǎn)中 ， 常采用蔗梢作為繁種材料 ， 甘 蔗病害連年積累 ， 致使果蔗栽培成本逐年加重 ， 多數(shù) 蔗地果品不佳 ， 蔗汁口感淡 、 咸 ， 收購價格相對低廉 。 在本次調(diào)查中 ， 農(nóng)民普遍反映 ， 果蔗種植過程大量施 用化肥 、 激素 ， 并且逐年增加 ， 藥物 、 人工成本越來越 高 。 2017年 12月 ， 廣東省果蔗收購價格低迷 ， 成品 蔗普遍收購價格為 0.4 0.6 元 /kg ， 農(nóng)民損失嚴重 ， 僅 有少部分果品優(yōu)良甘蔗收購價格稍高 。 果蔗脫毒種苗具有增產(chǎn) 、 節(jié)間拉長 、 商品性好等 優(yōu)點 37 。 蔡文偉等通過 1年新植與 4年宿根繁殖材 料的試驗數(shù)據(jù)證實 ， 甘蔗脫毒種苗分蘗率 、 發(fā)株率 、 單位面積有效莖數(shù) 、 甘蔗單位面積產(chǎn)量和蔗糖分 含 量均優(yōu)于同品種 非 脫毒種苗 。 其 中 ， 脫毒種苗宿根 第 4年數(shù)據(jù) 雖然 優(yōu)于 非 脫毒種苗 ， 但未達到顯著 水 平 38 。 陳仲華 、 沈萬寬 等 應(yīng) 用 熱 水脫毒 方法 使 健康 種苗 較 同品種種苗新植蔗增產(chǎn) 10 20 ， 宿根蔗增 產(chǎn) 15 25 39-40 。 本次實驗結(jié)果表明 ， 健康 種苗 可 有效 除去 種苗 細 菌病原物 ， 1代 、 2代 果蔗 健康 種苗 均 可 有效 控制細 菌病害發(fā)生 。 脫毒種苗果蔗 風味清 甜 ， 種植過程省 錢 、 省工 ， 對于提 升 果蔗品 質(zhì) ， 減 少蔗 農(nóng)損失 ， 促 進蔗農(nóng)增收 意義 重大 。 然而 ， 蔗農(nóng)對脫毒 種苗認識 依舊 不 足 ， 訛稱 為 “ 基 因種 ”， 且對于 嘗 試種 植脫毒種苗 意愿 低下 ， 不 利 于產(chǎn) 業(yè)健康 發(fā) 展及粵北 地 區(qū) 果蔗品 牌建立 。 我國 蔗 區(qū)豐富 的生 態(tài)多 樣性 ， 以及頻繁引 種 、 調(diào) 種為甘蔗病害 傳播 、 變 異提 供了條件 ， 且甘蔗 細 菌病 害表現(xiàn)不 穩(wěn)定 ， 依 據(jù) 田間癥狀 進行甘蔗病害 診斷 易 造成 誤判 ， 甘蔗 安全 生產(chǎn) 存 在 隱患 。 因此 ， 對不同蔗 區(qū) 甘蔗病害進行有效 診斷尤 為 必要 。 粵北 地 區(qū) 果蔗 細 菌性病害 以 甘蔗宿根矮化病為 主 ， 建議要 加強果 蔗宿根矮化病 診斷 和 防控 ， 積 極推 進果蔗脫毒種苗 的 推 廣 應(yīng) 用 。 本次試驗中 兩個 試驗點的脫毒種苗果 蔗 （ Badila 和 Negative ， 其 蔗苗由本實驗 室 提 供 ） 3種 細 菌病害檢 出 率均為 0， 應(yīng) 用 PCR技 術(shù)進行甘蔗病 原物檢測 可 為甘蔗脫毒種苗生產(chǎn)提 供準確可靠 、 靈 敏 、 快速 的檢測手 段 。 參考文獻 1 幸曉維 ， 鄭 偉 儀 . 8-5各市 農(nóng)作物 播 種面積和產(chǎn)量 M / 廣東農(nóng) 村統(tǒng)計 年 鑒 - 2015. 北京 ： 中 國統(tǒng)計出版社 ， 2015： 192-193. 2 Urashima A S ， Silva M F ， Correa J J ， et al .Prevalence and severity of ratoon stunt in commercial Brazilian sugar cane fields J . Plant Disease ， 2017 ， 101（ 5）： 815-821. 3 倉曉燕 ， 李 文 鳳 ， 王曉燕 ， 等 . 檢 疫 性病害甘蔗 白條 病的 發(fā)生 危 害與 防控 對 策 J . 中 國 糖料 ， 2017 （ 3）： 69-71. 4 Gutierrez A ， Garces F F ， Hoy J W . Evaluation of resis - tance to Leaf Scald by quantitative PCR of Xanthomonas albilineans in wugarcane J . Plant Disease ， 2016， 100 （ 7）： 9-15. 5 Fu H Y ， Sun S R ， Wang J D ， et al . Rapid and quantitative detection of Leifsonia xyli subsp . xyli in sugarcane stalk juice using a real - time fluorescent （ TaqMan ） PCR assay J . BioMed Research International ， 2016， 2016（ 12）： 1-8 . 6 李瑞美 . 果蔗 白條 病的發(fā)生 規(guī)律 與 防治措 施 J . 福建 農(nóng) 業(yè)科技 ， 2016， 47（ 6）： 18-19. 7 薛晶 ， 何 文 志 ， 張會華 ， 等 . 彌勒 蔗 區(qū) 甘蔗宿根矮化病 發(fā)生分 布及 病原檢測 J . 中 國 糖料 ， 2014（ 2）： 28-29 . 8 周玉飛 ， 付瑜華 ， 王洪星 ， 等 . 貴州西南 蔗 區(qū) 甘蔗宿根 矮化病調(diào)查 J . 甘蔗糖 業(yè) ， 2013（ 3）： 51-55 . 9 李 文 鳳 ， 王曉燕 ， 黃應(yīng)昆 ， 等 . 廣 西 宜 州 蔗 區(qū) 甘蔗宿根矮 化病的調(diào)查 及 病原檢測 J . 中 國 糖料 ， 2012（ 1）： 47-49 . 10 熊國如 ， 李 增 平 ， 趙婷婷 ， 等 . 海南 蔗 區(qū) 甘蔗病害種 類 及 發(fā)生 情況 J . 熱帶 作物學 報 ， 2010（ 9）： 1588-1595 . 11 馮奕璽 . 廣東 徐聞縣 發(fā)現(xiàn)甘蔗 赤條 病 J . 甘蔗糖 業(yè) ， 1987（ 7）： 50 . 12 Comstock J C ， Shine Jr J M ， Davis M J ， et al . Relation - ship between resistance to Clavibacter xyli subsp . xyli colonization in sugarcane and spread of ratoon stunting disease in the field J . Plant Disease ， 1996 ， 80 （ 6）： 704-708 . 13 Hobbs H A . Use of direct antigen coating and protein a coating ELISA procedures for detection of three peanut 14 · · 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18 ,VoI. 38 .No. 6 viruses J . Plant Disease ， 1987， 71（ 8）： 747-749 . 14 Hoy J W ， Grisham M P ， Damann K E . Spread and in - crease of ratoon stunting disease of sugarcane and com - parison of disease detection methods J . Plant Disease ， 2007， 83（ 12）： 1170-1175 . 15 Harrison N A ， Davis M J . Comparison of serological techniques for diagnosis of ratoon stunting disease J . Sugar Cane ， 1990. 16 李文鳳 ， 黃應(yīng)昆 ， 王嘵燕 ， 等 . 甘蔗宿根矮化病的 TBIA 快速檢測 J . 云南農(nóng)業(yè)大學學報 ， 2010（ 1）： 132-134 . 17 沈萬寬 ， 鄧海華 ， 周國輝 ， 等 . 應(yīng)用 DB- EIA技術(shù)快速 檢測甘蔗宿根矮化病研究 J . 植物保護 ， 2007， 33 （ 2）： 110-113 . 18 Davis M J . Direct-count techniques for enumerating Clavibacter xyli subsp . xyli which causes ratoon stunting disease of sugarcane J . Phytopathology ， 1985， 75（ 11）： 1226-1231 . 19 Young A J ， Kawamata A ， Ensbey M A ， et al . Efficient diagnosis of ratoon stunting disease of sugarcane by quantitative PCR on pooled leaf sheath biopsies J . Plant Disease ， 2016， 100（ 12）： 2492-2498. 20 Liu J ， Xu L P， Guo J L ， et al . Development of loop - medi- ated isothermal amplification for detection of Leifsonia xyli subsp . xyli in sugarcane J . BioMed Research In - ternational ， 2013（ 2）： 357692 . 21 Li W F， Shen K， Huang Y K ， et al . Incidence of sugarcane ratoon stunting disease in the major cane - growing regions of China J . Crop Protection ， 2014， 60（ 6）： 44-47 . 22 Pan Y B， Grisham M P ， Burner D M ， et al . A polymerase chain reaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp . xyli ， the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease J . Plant Disease ， 1998， 82（ 3）： 285-290. 23 Gao S J ， Pan Y B， Chen R K ， et al . Quick detection of Leifsonia xyli subsp . xyli by PCR and nucleotide se - quence analysis of PCR amplicons from Chinese Leifso - nia xyli subsp . xyli isolates J . Sugar Tech ， 2008， 10 （ 4）： 334-340 . 24 楊湛端 ， 劉睿 ， 沈萬寬 ， 等 . 番禺果蔗宿根矮化病調(diào)查 及分析 J . 廣東農(nóng)業(yè)科學 ， 2012（ 9）： 75-76 . 25 王恒波 ， 陳平華 ， 高三基 ， 等 . 甘蔗宿根矮化病菌實時 熒光定量 PCR檢測方法的建立 J . 植物病理學報 ， 2015,45（ 3）： 232-238 . 26 Berna A Z ， Wang X R， Cassells J ， et al . Indirect detec - tion of ratoon stunting disease in sugar cane J . Journal of Plant Pathology & Microbiology ， 2016， 7（ 5）： 57 . 27 Fontana P D ， Rago A M， Fontana C A ， et al . Isolation and genetic characterization of Acidovorax avenae from red stripe infected sugarcane in Northwestern Argentina J . European Journal of Plant Pathology ， 2013， 137 （ 3）： 525-534 . 28 Song W Y， Sechler A J ， Hatziloukas E， et al . Use of PCR for Rapid Identification of Acidovorax avenae andA . avenae subsp . citrulli M / Pseudomonas syringae and Related Pathogens:Biology and Genetics . Netherlands: Springer ， 2003： 531-544 . 29 傅華英 ， 葛丹鳳 ， 李曉燕 ， 等 . 甘蔗赤條病菌巢式 PCR 檢測 J . 植物保護學報 ， 2017， 44（ 2）： 276-282 . 30 Rott P， Davis M J ， Baudin P . Serological variability in Xanthomonas albilineans ， causal agent of leaf scald dis - ease of sugarcane J . Plant Pathology ， 1994， 43（ 2）： 344-349 . 31 Comstock J C ， Irey M S . Detection of the sugarcane leaf scald pathogen ， Xanthomonas albilineans ， using tissue blot immunoassay， ELISA， and isolation techniques J . Plant Disease ， 1992， 76（ 10）： 1033. 32 Wang Z K， Comstock J C ， Hatziloukas E， et al . Compari - son of PCR ， BIO- PCR， DIA， ELISA and isolation on semiselective medium for detection of Xanthomonas albi - lineans ， the causal agent of leaf scald of sugarcane J . Plant Pathology ， 1999， 48（ 2）： 245-252. 33 劉婧 . 甘蔗宿根矮化病菌 （ Leifsonia xyli subsp . xyli ） 檢 測技術(shù)研究 D . 福州 ： 福建農(nóng)林大學 ， 2011： 77 . 34 James G . A review of ratoon stunting disease J . Sugar Cane ， 1997. 35 Grisham M P . Effect of ratoon stunting disease on yield of sugarcane grown in multiple three - year plantings J . Phytopathology ， 1991， 81（ 3）： 337-340 . 36 徐景升 ， 許莉萍 ， 闕友雄 ， 等 . 甘蔗宿根矮化病研究進 展 J . 熱帶亞熱帶植物學報 ， 2008（ 2）： 184-188. 37 戴友銘 ， 李松 ， 余坤興 ， 等 . 果蔗拔地拉種性恢復試驗 研究 J . 廣西農(nóng)業(yè)科學 ， 2008（ 1）： 26-29. 38 蔡文偉 ， 曾軍 ， 張樹珍 ， 等 . 新臺糖 22號甘蔗脫毒種苗 宿根性研究 J . 廣西糖業(yè) ， 2014（ 5）： 11-12. 39 陳仲華 ， 沈萬寬 . 利用熱水處理結(jié)合心葉愈傷組織培 養(yǎng)脫除甘蔗宿根矮化病菌研究 J . 甘蔗糖業(yè) ， 2007 （ 5）： 16-20. 40 沈萬寬 ， 鄧海華 ， 陳仲華 ， 等 . 粵北翁源蔗區(qū)甘蔗宿根 矮化病調(diào)查 J . 廣東農(nóng)業(yè)科學 ， 2009（ 1）： 60-62. 15 · ·