北京地區(qū)南瓜病毒病病原種類鑒定.pdf
<p>Molecular Identification of Tomato mottle mosaic virus CHEN Ling-zhi 1，ZHANG Ru 1，WEI Bing-qiang 1 ，WANG Lan-lan 1 ，GAO Yan-ping 2 ，ZHANG Wu 2 1 Institute of Vegetables，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，Gansu，China； 2 Gansu Potato Seed （Seedling）Virus Detection and Evaluation of Engineering Technology Research Center，Lanzhou 730070，Gansu， China Abstract： Using DAS-ELISA and RT-PCR methods，this study identified pepper pathogenetic virus in experimental fields of Vegetable Insititute，Gansu Academy of Agricultural Sciences. The results showed that in 72 disease infected samples，the total TMV detection rate was 66.7%，whereas CMV had not been detected as positive. Three pairs of primers were designed to amplify positive samples. A strip with similar segments was amplified only from primer TMV1，which had 97% sequence similarity with ToMMV by BLASTN comparison. Aiming at ToMMV，3 pairs of primers ToMMV1，ToMMVcp and ToMMVspe were designed to amplify ToMMV. A single target band with same size as expected was amplified. Its sequence was 98% accorded with ToMMV by sequencing，proving the virus found in the experimental fields of Vegetable Insititute was truly ToMMV. Key words：Pepper；Virus disease；DAS-ELISA；ToMMV；RT-PCR 北京地區(qū)南瓜病毒病病原種類鑒定 陳利達 曹金強 石延霞 柴阿麗 謝學(xué)文 *李寶聚 *（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要：為明確北京地區(qū)南瓜病毒病種類及其主要侵染病原，20162017年在北京周邊采集疑似感染病毒的南瓜病樣84份， 并根據(jù)南瓜上的6種病毒特異性引物對其進行反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測。結(jié)果表明：共有79份南瓜病樣檢測顯示陽性， 其中黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus ，CMV）的檢出率最高，為52.38%；其次是小西葫蘆黃花葉病毒（ Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus ，WMV），檢出率分別為44.01%、14.29%，其他病毒暫未檢出。 此外，16.67%的樣品受2種病毒復(fù)合侵染，CMV和ZYMV復(fù)合侵染占7.14%，ZYMV和WMV復(fù)合侵染占9.52%。北京地區(qū) 南瓜上優(yōu)勢病毒種類為CMV，且存在病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象。 關(guān)鍵詞：南瓜；病毒?。环N類鑒定 ficifolia Bouché）并列為世界上南瓜屬作物的5個 栽培種（李昕升 等，2017） 。南瓜因產(chǎn)量高、效益 好，且具有一定的保健作用，成為我國北方地區(qū)菜 糧兼用作物之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計， 2014年全世界南瓜產(chǎn)量約為2 519萬t，我國占世 界當(dāng)年總產(chǎn)量的28.74 %，居世界第1位（王璐， 2017） 。隨著南瓜種植規(guī)模的擴大，病毒病也愈發(fā) 嚴重，成為制約南瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一，尤 其在高溫干旱的年份，嚴重影響南瓜的品質(zhì)與產(chǎn) 量。據(jù)報道，能夠侵染南瓜的病毒種類有80多種， 其中小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic 陳利達，男，碩士，科研助理，專業(yè)方向：蔬菜病害檢測，E-mail： 1271840305qq.com *通訊作者（Corresponding authors） ：謝學(xué)文，男，博士，專業(yè)方向：蔬 菜病害綜合防治，E-mail：xiexuewencaas.cn；李寶聚，男，研究員， 專業(yè)方向：蔬菜病害綜合防治，E-mail：Libaojucaas.cn 收稿日期：2017-12-04；接受日期：2018-03-06 基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0201010），公益性行業(yè)（農(nóng) 業(yè)）科研專項經(jīng)費課題項目（201303112） 南瓜（Cucurbita moschata Duch.，中國南瓜）、 筍瓜（Cucurbita maxima Duch. ex Lam.，印度南瓜）、 西葫蘆（Cucurbita pepo L.，美洲南瓜） 、墨西哥南 瓜（ Cucurbita mixta Pangalo）和黑籽南瓜（ Cucurbita 43 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 43 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（6）：43 - 47 virus，ZYMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV） 、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV） 、南瓜花葉病毒（ Squash mosaic virus，SqMV） 、番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）和馬鈴薯Y病毒（Potato viurs Y， PVY）（Lecoq et al.，1997；Fletcher et al.，2000；周 賢，2013；劉嘉峪 等，2017）發(fā)生相對普遍。 近年來北京地區(qū)南瓜的種植面積逐年增加，南 瓜病毒病危害日趨嚴重，本文針對北京周邊地區(qū)采 集的疑似感染病毒病的南瓜葉片，采用反轉(zhuǎn)錄PCR （RT-PCR）技術(shù)進行檢測，以期了解北京地區(qū)南 瓜上主要病毒種類及其分布，為當(dāng)?shù)啬瞎喜《静〉?防控和抗病品種的選育提供參考。 1 材料與方法 1.1 樣品采集 20162017年，在北京周邊地區(qū)采集疑似感 染病毒病的南瓜樣本（葉片）共84份：順義區(qū)32 份、昌平區(qū)15份、大興區(qū)12份、海淀區(qū)25份。 所采樣品均保存在-80 冰箱備用。 1.2 試劑與儀器 試劑：TRIzol Reagent購自英濰捷基（上海） 貿(mào)易有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit 購自天根生物科技（北京）有限公司；2× Taq Mix（MT201）購自博邁德科技（北京）有限公司。 儀器設(shè)備：3K15型高速離心機，德國Sigma 公司生產(chǎn)；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠 生產(chǎn)；移液槍，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；Jel Doc 2001型凝膠成像系統(tǒng)、Bio-Rad S1000 PCR儀，美 國伯樂公司生產(chǎn)。 1.3 植物總 RNA提取 采用TRIzol法提取南瓜葉片總RNA。取100 mg南瓜葉片于液氮中研磨，將0.2 g粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，迅速加入1 mL TRIzol試劑，振蕩混勻， 室溫下靜置5 min；4 下12 000 r·min -1 離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入0.2 mL氯 仿混勻，室溫放置5 min；4 下12 000 r·min -1 離 心10 min；取水相（約400 L）加入等體積的異 丙醇，室溫下靜置10 min；4 下12 000 r·min -1 離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌 沉淀2次，4 下12 000 r·min -1 離心5 min；自然 干燥，加入50 L RNase-Free ddH 2 O溶解；以健 康南瓜葉片總RNA為陰性對照，-80 保存?zhèn)溆谩?1.4 南瓜病毒病樣本 RT-PCR檢測 以提取總RNA為模板，用FastQuant RT Kit試 劑盒反轉(zhuǎn)錄合成病毒的cDNA第一條鏈。使用已報 道的CMV-F/CMV-R、SqMV-1/SqMV-2、PRSV-F/ PRSV-R和PVY-1/PVY-2特異性引物（表1）對 不同樣本進行RT-PCR擴增，其中ZYMV-1/2和 WMV-1/2是根據(jù)GenBank已有的病毒外殼蛋白基 因（Coat Protein，CP）序列所設(shè)計。所用引物均 由博邁德科技（北京）有限公司合成。 表1 用于南瓜病毒病分子檢測的引物信息 引物編號引物序列（5-3） PCR產(chǎn)物/bp參考文獻 CMV-F CGTTTAGTGACTTCA GACAG 735 宋婷婷 CMV-R ATG GACAAATCTGAATCAAC 等，2007 ZYMV-1 AAAGAAGAAGACAAAGGGAA 582 自行設(shè)計 ZYMV-2 AGCGTATCGTGCTAAACT WMV-1 ACACCAGTGGCAAAGGG 697 自行設(shè)計 WMV-2 CCATCAAGTCCAAATAACC SqMV-1 CATGGTACAGCAGCTTGGAAC 597 廖富榮 SqMV-2 GAAGCCACAACAAAACCCAGA 等，2013 PRSV-F ATGAGGCTGTGGATGCTGGTTTA 325 任春梅 PRSV-R GATTGAGTGGCACGAGTATTAGA 等，2015 PVY-1 GCCAACTGTGATGAATGGGC 400 馮光惠 PVY-2 TGTACTGATGCCACCGTCCA 等，2014 PCR擴 增 體 系：2×Taq PCR Master Mix 10 L，上下游引物各 0.5 L，cDNA模板 1 L， ddH 2 O補足至20 L。PCR擴增條件：94 預(yù)變 性4 min；94 變性30 s，53 退火30 s，72 延 伸45 s，共34個循環(huán)；72 補充延伸10 min。擴 增結(jié)束后，取5 L PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠 電泳檢測，使用全自動凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。 PCR產(chǎn)物送至博邁德科技（北京）有限公司進行 測序，并利用NCBI序列比對工具BLAST（http：/ blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序，根據(jù)核酸序列同源性 確定病毒種類。 2 結(jié)果與分析 2.1 RT-PCR擴增結(jié)果 對采集的84份南瓜病毒病樣本（葉片）提取 總RNA，利用不同特異性引物進行RT-PCR檢測， 部分檢測結(jié)果見圖1。待測樣品中引物CMV-F/ CMV-R可擴增出大小735 bp的條帶（圖1-a）， 44 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 44 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 引物ZYMV-1/ZYMV-2可擴增出大小582 bp的條 帶（圖1-b），引物WMV-1/WMV-2可擴增出大小 697 bp的條帶（圖1-c），陰性對照均未擴增出目的 條帶。表明在待檢樣品中能分別測出CMV、ZYMV 和WMV，但未檢測到SqMV、PRSV、PVY。 2.3 南瓜植株上病毒的復(fù)合侵染情況 北京地區(qū)84份南瓜病毒病樣品中，發(fā)現(xiàn)14份 病樣為2種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為16.67% （表3） 。其中，北京順義區(qū)南瓜病毒病復(fù)合侵染 種類為CMV和ZYMV，侵染率為18.75%；海淀區(qū) 南瓜病毒病復(fù)合侵染種類為ZYMV和WMV，侵染 率為32.00%，未檢出3種病毒復(fù)合侵染。 表3 北京地區(qū)南瓜病毒復(fù)合侵染類型及分布 采樣地 樣品 數(shù)量 CMV+ZYMV ZYMV+WMV CMV+WMV 檢出 數(shù) 檢出 率/% 檢出 數(shù) 檢出 率/% 檢出 數(shù) 檢出 率/% 順義區(qū) 32 6 18.75 0 0 0 0 昌平區(qū) 15 0 0 0 0 0 0 大興區(qū) 12 0 0 0 0 0 0 海淀區(qū) 25 0 0 8 32.00 0 0 總計 84 6 7.14 8 9.52 0 0 2.4 北京地區(qū)南瓜病毒病田間癥狀 南瓜病毒病的發(fā)生可貫穿植株整個生長發(fā)育 期，為系統(tǒng)性侵染。北京地區(qū)南瓜病毒病主要包括 花葉、褪綠和皺縮等癥狀，經(jīng)室內(nèi)分子檢測后得知 田間病毒種類為CMV、ZYMV和WMV 3種。CMV 田間癥狀（圖2-a） ：葉片葉綠素分布不均，易出 現(xiàn)黃色或淡黃色病斑。嚴重時葉片變小變脆，出現(xiàn) 淺黃色部分斑駁，呈現(xiàn)黃綠分布不均的鑲嵌狀花葉 癥狀。ZYMV田間癥狀（圖2-b）：葉面出現(xiàn)花葉及 斑駁癥狀，部分葉肉逐漸褪綠黃化，易出現(xiàn)明脈。 嚴重時植株矮化，節(jié)間變短，葉緣卷曲形成雞爪狀， 圖1 南瓜部分樣品 RT-PCR檢測結(jié)果 a為CMV引物擴增結(jié)果，b 為ZYMV引物擴增結(jié)果，c 為WMV 引物擴增結(jié)果；M，BM5000 DNA Marker；N，健康植株；111， 部分感病植株。 M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp a 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp b M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp c M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2.2 南瓜主要病毒種類檢測結(jié)果 對采集的84份南瓜病毒病樣本進行PCR檢 測，其中79份病樣檢測顯示陽性，檢出3種病 毒分別為CMV、ZYMV和WMV，病毒檢出率 94.05%。其中CMV檢出率最高，可達52.38%；其 次為ZYMV，檢出率44.01%；WMV檢出率14.29% （表2） 。因此，CMV在北京地區(qū)南瓜上侵染最普 遍，為優(yōu)勢病毒種類。 北京不同地區(qū)南瓜病毒種類及發(fā)生程度有所 差異（表2） 。在南瓜植株上檢出的病毒種類最多 的是順義區(qū)和海淀區(qū)，檢測到3種病毒，這2個地 區(qū)南瓜病毒病發(fā)生最為嚴重；其次是昌平區(qū)和大興 區(qū)，分別檢測出2種病毒，該地區(qū)病毒病危害較輕。 表2 北京地區(qū)南瓜病毒種類及分布 采樣地 樣品 數(shù)量 CMV ZYMV WMV 檢出 數(shù) 檢出 率/% 檢出 數(shù) 檢出 率/% 檢出 數(shù) 檢出 率/% 順義區(qū) 32 21 65.63 11 34.38 4 12.50 昌平區(qū) 15 10 66.67 2 13.33 0 0 大興區(qū) 12 8 66.67 4 33.33 0 0 海淀區(qū) 25 5 20.00 20 80.00 8 32.00 總計 84 44 52.38 37 44.01 12 14.29 圖2 南瓜病毒病田間發(fā)病癥狀 a，CMV侵染南瓜葉片癥狀；b，ZYMV侵染南瓜葉片癥狀；c，WMV侵染南瓜葉片癥狀；d，CMV+ZYMV復(fù)合侵染南瓜葉片癥狀；e， ZYMV+WMV復(fù)合侵染南瓜葉片癥狀。彩色圖版見中國蔬菜網(wǎng)站：www.cnveg.org。 a b c d e 45 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 45 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 并常伴有蕨葉及葉面凹凸起伏癥狀。WMV田間癥 狀（圖2-c） ：葉片變小變硬，葉緣部分失綠并伴 有斑駁等癥狀。發(fā)病中后期植株表現(xiàn)皺縮矮化、葉 片卷曲，發(fā)病嚴重時莖蔓變短，發(fā)病組織呈瘤狀突 起。混合侵染的植株發(fā)病癥狀表現(xiàn)較為復(fù)雜，發(fā)病 較重。CMV和ZYMV復(fù)合侵染后植株矮化，葉緣 卷曲，葉片顏色變淺，出現(xiàn)蕨葉及葉面不平現(xiàn)象（圖 2-d）。ZYMV和WMV復(fù)合侵染現(xiàn)象廣泛存在，其 癥狀在葉片上表現(xiàn)明顯，葉片出現(xiàn)褪綠黃化，易形 成深淺綠色相間花葉，伴有皺褶卷曲現(xiàn)象。有時葉 緣處有斑駁突起，病株生長遲緩，開花結(jié)果后病情 趨于加重（圖2-e）。 3 結(jié)論與討論 病毒病是制約南瓜生產(chǎn)的重要因素之一，隨著 我國南瓜種植面積逐年增加，病毒病的危害日益加 重，給南瓜生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。南瓜病毒病 在我國長江地區(qū)、內(nèi)蒙古、新疆、黑龍江等地普遍 發(fā)生（馬英，2017） 。不同地區(qū)引起南瓜病毒病的 毒源種類不盡相同，新疆石河子地區(qū)南瓜病毒病毒 源種類主要為CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W（任 琛榮 等，2016） ；黑龍江地區(qū)南瓜病毒病的毒源 種類為CMV和WMV（楊國慧，2003）。本試驗結(jié) 果表明，侵染北京地區(qū)南瓜的主要毒源有CMV、 ZYMV和WMV 3種，未檢測到SqMV、PRSV、 PVY等其他病毒，由于病毒分布具有區(qū)域性，目 前SqMV只在黑龍江南瓜上有相關(guān)報道（李鳳梅， 2002） 。其他病毒種類也未檢出，可能是由于采樣 數(shù)量少或部分南瓜植株病毒癥狀表現(xiàn)不明顯，導(dǎo)致 漏采。在所有檢測樣品中CMV的檢出率較高，可 能是由于CMV寄主范圍廣，可侵染1 000多種單、 雙子葉植物（王海河 等，2001），且CMV可由60 多種蚜蟲進行非持久性傳播，因此成為北京地區(qū) 南瓜病毒病優(yōu)勢毒源。此外，本次采集樣本共84 份，其中有79份病樣顯示陽性，5份疑似感染南 瓜病毒病，但在該樣本內(nèi)未檢測到病毒，可能是生 理性病害或藥害所致。 瓜類病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象在不同地區(qū)均有報道， 部分學(xué)者對我國瓜類主產(chǎn)區(qū)進行病毒種類調(diào)查， 發(fā)現(xiàn)存在多種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，其中以PRSV和 WMV組合最為常見，占復(fù)合侵染組合的31.25% （尤毅 等，2016） ；重慶地區(qū)南瓜檢測樣品中有 93.22%的樣品受2種以上病毒復(fù)合侵染（青玲 等， 2010） 。本試驗中2種病毒復(fù)合侵染率為16.67%， 可能與連作、傳毒媒介、種子與土壤帶毒有關(guān)。 尤其是昆蟲傳毒，CMV、ZYMV 、WMV均可通過 蚜蟲進行傳播，部分蚜蟲可攜帶多種病毒進行再 侵染，導(dǎo)致一種植株上出現(xiàn)2種或2種以上病毒復(fù) 合侵染現(xiàn)象。也可能與病毒越冬習(xí)性有關(guān)，如國 內(nèi)學(xué)者在重慶地區(qū)對南瓜病毒病進行鑒定，發(fā)現(xiàn) 農(nóng)田周圍葎草上存在7 種病毒，且復(fù)合侵染的比 例高達80%（青玲 等，2009）。CMV、ZYMV和 WMV均為種傳病毒（楊國慧，2003） ，再加上田 間管理不當(dāng)、單一品種種植模式等，成為南瓜病 毒病發(fā)生嚴重且存在復(fù)合侵染的主要原因。 本試驗已檢測出北京地區(qū)南瓜病毒病的毒源種 類主要有CMV、ZYMV和WMV，但受采集數(shù)量和 地域性的限制，無法涵蓋北京地區(qū)南瓜病毒所有種 類， 因此， 是否存在其他病毒種類還有待進一步研究。 參考文獻 馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁.2014.陜北地區(qū)馬鈴薯Y病 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Identification of Pathogen Species of Virus Diseases Infecting Squash in Beijing Area CHEN Li-da，CAO Jin-qiang，SHI Yan-xia，CHAI A-li，XIE Xue-wen *，LI Bao-ju * （Insititute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China） Abstract ：In order to clear and definite species of squash virus diseases in Beijing area and their main infection pathogens，this paper collected 84 squash samples with suspected virus-like symptoms during 2016- 2017 from Beijing area，and carried out detection by RT-PCR used 6 pairs of specific virus primers.The results showed that 79 samples were positive，among which Cucumber mosaic virus （CMV） had the highest detection rate -52.38%，followed by Zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） and Watermelon mosaic virus （WMV）.Their detection rate were 44.01% and 14.29%，respectively.Other viruses were not yet detected.In addition，16.67% samples were mix-infected by 2 kinds of viruses.Mix infection of CMV and ZYMV took 7.14%.Mix infection of ZYMV and WMV took 9.52%.CMV was the prevalent pathogenic virus in Beijing area，where the mix infection of viruses on squash was existed. Key words：Squash；Virus diseases；Species identification 早佳（8424） 該品種為吳明珠院士選配的早熟西瓜一代雜種，為保 護地專用品種。果實發(fā)育期3035天，單瓜質(zhì)量36 kg， 中心含糖量12%以上，每667 m 2 （1畝）產(chǎn)量2 0003 000 kg；果實圓球形，果皮薄、綠色底覆青黑色條紋，果肉粉 紅色，質(zhì)地細松脆，品質(zhì)佳。 S-甜王 植株生長強健，坐果率高，早熟，坐果后28天左右 成熟；果實高圓形，果皮綠色覆明顯的深色條紋，單果質(zhì) 量810 kg左右，果肉鮮紅，細膩、甜脆，中心含糖量 13%；耐貯運，適合南北方保護地及露地栽培，深受市場 歡迎。 玉娘 生長勢強，耐枯萎病，坐果率高；果實高球至短橢圓 形，單瓜質(zhì)量1.5 kg左右，果皮白色，表面光滑或偶有稀疏 網(wǎng)紋，果肉淡綠色，肉厚，中心可溶性固形物含量17%左 右，肉質(zhì)柔軟細膩；播種至始收80100天，坐果至采收 4050天。 美都 中熟，開花至果實成熟約40天，一般單瓜質(zhì)量約5 kg以上；果實圓球至高球形，果皮綠色覆墨綠條紋，如 果實膨大期遇低溫，果皮底色和條紋會加深，果肉桃紅 色，中心含糖量約11%12%，品質(zhì)好；果皮稍硬，較耐 貯運。 · 封面說明 · 溫州市神鹿種業(yè)有限公司 地址：浙江省溫州市甌海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)西經(jīng)二路 17號 郵編： 325014 電話：0577-88623355 88623344 傳真： 0577-88623838 http:/www.slseed.com 47 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 47 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES</p>
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