<p>8 期 · 1531 · 廣西西北部核桃真菌性病害調查及 核桃炭疽 病防治試驗 汪筱雪 1 ，韋繼光 1* ，楊振德 1 ，羅 輯 2 ， 吳耀軍 2 ， 楊秀好 3 ， 羅基同 3 ， 謝代祖 4 （ 1 廣西大學 農學院/ 農業(yè)環(huán)境與農產品安全廣西重點實驗室培育基地/ 植物科學國家級實驗教學示范中心 ， 南寧 530004 ； 2 廣西林業(yè)科學研究院 ，南寧 530002； 3 廣西林業(yè)有害生物防治檢疫站 ， 南寧 530028 ； 4 河池市林業(yè)科學研究院 ， 廣西 河池 547000 ） 摘要 ： 【 目的 】 明確 廣西 西北 部核 桃真 菌性 病害 種類 ， 并篩 選可 有效 防治 核桃 炭疽 病的 藥劑 ， 為核 桃病 害防 治提 供 科 學 依 據 。 【 方 法 】 在 廣 西 西 北 部 的 河 池 市 金 城 江 區(qū) 、 環(huán) 江 縣 、 鳳 山 縣 和 百 色 市 樂 業(yè) 縣 等 核 桃 種 植 區(qū) ， 于 核 桃 病 害 發(fā) 生 期 開 展 真 菌 性 病 害 種 類 和 危 害 程 度 調 查 ， 計 算 其 發(fā) 病 率 及 病 情 指 數 。 測 定43% 戊 唑 醇 、 45% 咪 鮮 胺 、 25% 嘧 菌 酯 、 25% 吡 唑 醚 菌 酯 和40% 苯 醚 甲 環(huán) 唑 等5 種 殺 菌 劑 對 核 桃 炭 疽 病 菌 的 室 內 毒 力 ， 計 算 抑 制 中 濃 度 （EC50 ） ； 選 取 效 果 較 優(yōu) 的3 種 殺 菌 劑 進 行 核 桃 炭 疽 病 田 間 防 治 試 驗 ， 測 定 不 同 殺 菌 劑 的 防 治 效 果 。 【 結 果 】 調 查 區(qū) 核 桃 真 菌 性 病 害 主 要 有 核 桃 根 腐 病 、 核 桃 枝 枯 病 、 核 桃 莖 點 霉 黑 斑 病 和 核 桃 炭 疽 病4 種 ， 病 原 菌 分 別 為 腐 皮 鐮 刀 菌 （Fusarium solani ） 、 胡 桃 楸 擬 莖 點 霉 （Phomopsis juglandina ） 、 莖 點 霉 屬 （Phoma sp. ） 真 菌 和 膠 孢 炭 疽 菌 （Colletotrichum gloeosporioides ） ， 其 中 以 核 桃 炭 疽 病 發(fā) 病 最 嚴 重 。 殺 菌 劑 室 內 毒 力 測 定 結 果 顯 示 ， 5 種 殺 菌 劑 對 核 桃 炭 疽 病 菌 的 抑 菌 效 果 為 ： 25% 吡 唑 醚 菌 酯&gt;45% 咪 鮮 胺&gt;40% 苯 醚 甲 環(huán) 唑&gt;25% 嘧 菌 酯&gt;43% 戊 唑 醇 ； 田 間 防 治 試 驗 結 果 顯 示 ， 25% 吡 唑 醚 菌 酯 、 45% 咪 鮮 胺 和40% 苯 醚 甲 環(huán) 唑 對 核 桃 炭 疽 病 的 田 間 防 治 效 果 分 別 為82.23% 、 80.26% 和75.98% 。 【 結 論 】 核 桃 炭 疽 病 是 目 前 廣 西 西 北 部 核 桃 的 主 要 真 菌 性 病 害 。25% 吡 唑 醚 菌 酯 可 作 為 防 治 核 桃 炭 疽 病 的 藥 劑 使 用 ， 同 時 建 議 在 地 勢 較 高 、 排 水 良 好 且 通 風 狀 況 好的地點種植核桃， 以防止病害發(fā)生 。 關鍵詞： 核桃；真菌病害 ； 炭疽??； 殺菌劑；防治效果； 廣西西 北部 中圖分類號：S432.4 文獻標志碼： A 文章編號： 2095-1191 （2018 ） 08-1531-10 收稿日期 ： 2018-02-12 基 金 項 目 ： 廣 西 創(chuàng) 新 驅 動 發(fā) 展 專 項 項 目 （ 桂 科AA17204058-9 ， AA17204058-6 ） ； 廣 西 林 業(yè) 廳 科 技 項 目 （ 桂 林 科 字 2014 第25 號 ） ； 河池市科學研究與技術開發(fā)計劃項目 （ 河科轉1489-2-1 ） 作 者 簡 介 ： * 為 通 訊 作 者 ， 韋 繼 光 （1962- ） ， 博 士 ， 教 授 ， 主 要 從 事 植 物 病 理 學 研 究 工 作 ， E-mail ： jiguangweigxu.edu.cn 。 汪 筱 雪 （1991- ） ， 研究方向為真菌學及植物真菌病害防治 ， E-mail ： 280593191qq.com Investigation on fungal disease of walnut in northwest Guangxi and control experiment of walnut anthracnose WANGXiao-xue 1 ，WEIJi-guang 1* ， YANGZhen-de 1 ，LUOJi 2 ，WUYao-jun 2 ， YANGXiu-hao 3 ，LUOJi-tong 3 ，XIEDai-zu 4 （ 1 CollegeofAgriculture ，GuangxiUniversity/CultivationBaseofGuangxiKeyLaboratoryforAgro-environmentand Agro-productSafety/NationalDemonstrationCenterofExperimentalPlantScienceEducation ，Nanning 530004 ， China ； 2 GuangxiAcademyofForestrySciences ，Nanning 530002，China ； 3 GuangxiForestPestManagementStation ， Nanning 530028，China ；HechiForestryResearchInstitute ，Hechi ，Guangxi 547000 ，China ） Abstract ： 【Objective 】 Walnut fungal diseases in northwest of Guangxi were investigated in order to screen the effec- tive fungicides and provide scientific basis for the prevention of walnut anthracnose. 【Method 】Survey on fungal diseases andhazardousdegreeofwalnutdiseaseswereconductedinJinchengjiangDistrict ，HuanjiangCountyandFengshanCoun- ty in Hechi City and Leye County in Baise City during the pathogenic period of walnut diseases. And the incidence and disease index of walnut diseases were calculated. The indoor toxicity of five fungicides namely 43% tebuconazole ，45% prochloraz ，25% azoxystrobin ，25% pyraclostrobin and 40% difenoconazole that against walnut anthracnose was deter- mined ，and the median inhibitory concentration （EC50 ）was calculated. Three kinds of fungicides whose effects were the optimalinindoortest againstwalnutanthracnoseinfieldwereselectedandthecontroleffectsofdifferentfungicideswere measured. 【Result 】The results showed that four different kinds of walnut fungal diseases ，included walnut root rot ，wal- nut twig blight ，walnut sp. leaf spot and walnut anthracnose ，and their pathogens were Fusarium solani ，Phomopsis jug- 南方農業(yè)學報 JournalofSouthernAgriculture 2018 ， 49 （ 8 ） ： 1531 - 1540 ISSN 2095 - 1191 ； CODEN NNXAAB http:/www.nfnyxb.com DOI ： 10 . 3969 /j.issn. 2095- 1191 . 2018. 08. 10 49 卷 南 方 農 業(yè) 學 報 · 1532 · 0 引言 【 研 究 意 義 】 核 桃 （Juglans regia ） 又 稱 胡 桃 ， 是 胡 桃 科 核 桃 屬 多 年 生 落 葉 喬 木 （ 孫 俊 等 ， 2012 ） ， 被 譽 為 世 界 四 大 干 果 之 一 ， 具 有 非 常 高 的 營 養(yǎng) 價 值 和 經 濟 價 值 。 核 桃 在 我 國 栽 培 歷 史 悠 久 ， 因 其 適 應 范 圍 廣 、 抗 逆 性 強 ， 且 核 桃 果 實 產 量 可 觀 ， 因 此 成 為 我 國 第 一 大 干 果 樹 種 ， 同 時 是 我 國 極 受 歡 迎 的 藥 用 植 物 和 經 濟 樹 種 （ 王 紅 霞 等 ， 2007 ； 高 智 輝 等 ， 2009 ； 杜 慧 平 等 ， 2017 ） 。 廣 西 核 桃 主 要 在 鳳 山 、 樂 業(yè) 和 凌 云 縣 等 西 北 部 地 區(qū) 栽 培 ， 這 些 地 方 環(huán) 境 較 惡 劣 ， 多 石 山 ， 土 壤 貧 瘠 ， 是 廣 西 典 型 的 石 漠 化 地 區(qū) ， 許 多 作 物 無 法 栽 培 存 活 。20 世 紀90 年 代 核 桃 產 業(yè) 被 引 進 廣 西 ， 主 要 用 于 增 加 農 民 收 入 及 治 理 石 漠 化 環(huán) 境 問 題 。 目 前 廣 西 種 植 的 核 桃 品 種 有 鳳 優(yōu)1 號 、 鳳 優(yōu)2 號 、 云 新 核 桃 、 云 南 漾 濞 大 泡 核 桃 、 美 國 山 核 桃 和 山 東 遼 河1 號 等 ， 但 隨 著 核 桃 種 植 面 積 的 擴 大 ， 核 桃 病 害 的 發(fā) 生 也 日 益 嚴 重 ， 病 害 嚴 重 的 甚 至 導 致 核 桃 樹 整 株 死 亡 或 核 桃 苗 圃 整 片 死 亡 ， 已 嚴 重 影 響 了 核 桃 產 量 ， 因 此 ， 對 核 桃 病 害 進 行 深 入 調 查 及 防 治 方 法 研 究 迫 在 眉 睫 。 【 前 人 研 究 進 展 】 Pollegioni 等 （2012 ） 報 道 核 桃 褐 斑 病 的 病 原 菌 為 核 桃 日 規(guī) 殼 ， 其 無 性 世 代 為 核 桃 盤 二 孢 。 王 安 民 等 （2013 ） 報 道 核 桃 潰 瘍 病 病 原 菌 為 腔 孢 綱 球 殼 孢 目 的 群 生 小 穴 殼 菌 。Zheng 等 （2015 ） 報 道 核 桃 根 腐 病 的 病 原 菌 為 腐 皮 鐮 刀 菌 。 國 內 早 期 報 道 核 桃 枝 枯 病 的 病 原 菌 多 為 矩 圓 黑 盤 孢 菌 所 致 的 枝 枯 病 （ 胡 國 良 等 ， 1992 ； 李 會 欽 ， 2012 ； 張 力 元 ， 2017 ） ， 而 戚 佩 坤 等 （2007 ） 、 孫 俊 （2013 ） 、 李 星 月 等 （2017 ） 報 道 其 病 原 菌 為 擬 莖 點 霉 ， 尹 萬 瑞 和 朱 天 輝 （2016 ） 報 道 其 病 原 菌 為 新 殼 梭 孢 。 劉 曉 云 等 （1995 ） 在 陜 西 留 壩 、 楊 凌 等 地 的 核 桃 上 曾 分 離 得 到 尖 孢 炭 疽 菌 ； 何 興 文 等 （2003 ） 、 曲 文 文 等 （2011 ） 、 黃 雄 等 （2016 ） 、 王 清 海 等 （2016 ） 鑒 定 的 核 桃 炭 疽 病 病 原 菌 也 為 膠 孢 炭 疽 菌 ； Zhu 等 （2015 ） 分 離 鑒 定 得 到 廣 西 核 桃 炭 疽 病 病 原 菌 為 松 針 炭 疽 菌 （Colletotrichum fioriniae ） 。 在 核 桃 炭 疽 病 防 治 方 面 ， 肖 育 貴 等 （2010 ） 的 研 究 結 果 表 明 ， 世 高 和 晴 菌 唑 對 核 桃 炭 疽 病 病 原 菌 生 長 的 抑 制 作 用 較 好 ， 林 間 防 治 效 果 可 達85% 以 上 。 劉 霞 等 （2013 ） 研 究 表 明 ， 28 時 咪 鮮 胺 、 戊 唑 醇 和 三 唑 酮 對 核 桃 炭 疽 病 病 原 菌 膠 孢 炭 疽 菌 菌 絲 毒 力 最 強 ， 而 異 菌 脲 、 代 森 錳 鋅 和 咪 鮮 胺 對 其 孢 子 的 毒 力 最 強 。 王 凡 等 （2015 ） 測 定 了9 種 殺 菌 劑 對 核 桃 炭 疽 病 菌 的 抑 制 作 用 ， 結 果 表 明 以40% 咪 鮮 胺 水 乳 劑 對 膠 孢 炭 疽 菌 的 抑 菌 作 用 最 強 。 黃 雄 等 （2016 ） 的 室 內 防 治 試 驗 結 果 表 明 ， 25% 咪 鮮 胺500 倍 液 、 50% 福 美 雙500 倍 液 、 70% 甲 基 硫 菌 靈500 倍 液 和100% 鏈 霉 素3000 倍 液 對 核 桃 炭 疽 菌 的 防 治 效 果 最 佳 。 【 本 研 究 切 入 點 】 廣 西 核 桃 產 業(yè) 發(fā) 展 迅 速 ， 已 成 為 桂 西 北 部 分 農 民 的 重 要 經 濟 收 入 來 源 ， 為 廣 西 農 民 收 入 增 長 及 環(huán) 境 治 理 提 供 了 強 有 效 的 支 持 。 但 目 前 已 報 道 的 文 獻 多 為 核 桃 種 植 或 栽 培 等 方 面 的 研 究 （ 蔣 桂 雄 等 ， 2010 ； 張 武 貴 等 ， 2012 ； 曾 紀 維 ， 2014 ） ， 對 核 桃 病 害 方 面 的 研 究 報 道 較 少 ， 缺 乏 針 對 廣 西 西 北 部 核 桃 病 蟲 害 調 查 及 防 治 等 方 面 的 研 究 。 【 擬 解 決 的 關 鍵 問 題 】 為 明 確 廣 西 西 北 部 核 桃 真 菌 性 病 害 的 發(fā) 生 情 況 ， 在 廣 西 河 池 市 的 鳳 山 縣 、 環(huán) 江 縣 、 金 城 江 區(qū) 和 百 色 市 樂 業(yè) 縣 等 核 桃 種 植 區(qū) 開 展 核 桃 真 菌 性 病 害 種 類 調 查 ， 對 其 病 原 菌 進 行 形 態(tài) 學 及 分 子 生 物 學 鑒 定 ， 并 進 行 核 桃 炭 疽 病 防 治 藥 劑 室 內 篩 選 及 田 間 防 治 試 驗 ， 篩 選 出 可 有 效 防 治 核 桃 炭 疽 病 的 藥 劑 ， 為 核 桃 病 害 防 治 提 供 科 學 依據 。 1 材料與方法 1. 1 調 查地點 于20152017 年 進 行 核 桃 真 菌 性 病 害 種 類 調 查 ， 調 查 地 點 主 要 集 中 在 廣 西 西 北 部 的 河 池 市 金 城 江 區(qū) 、 環(huán) 江 縣 、 鳳 山 縣 和 百 色 市 樂 業(yè) 縣 ， 調 研 多 個 核 桃 示 范 基 地 ， 分 別 是 河 池 市 鳳 山 縣 金 牙 鄉(xiāng) 示 范 基 地 、 環(huán) 江 縣 水 源 鎮(zhèn) 核 桃 示 范 基 地 、 金 城 江 區(qū) 側 嶺 鄉(xiāng) 良 種 繁 育 基 地 、 金 城 江 區(qū) 水 任 收 費 站 核 桃 示 范 基 地 、 金 城 江 區(qū) 大 山 塘 示 范 基 地 、 金 城 江 區(qū) 齊 美 村 才 貴 屯 核 桃 示 范 基 地 、 金 城 江 區(qū) 三 才 村 內 文 屯 核 桃 種 植 地 及 樂 業(yè)縣央林大槽等苗圃 。 landina ，Phoma sp. andColletotrichumgloeosporioides. Walnut anthracnose was the most serious disease.The indoor to- xicity test of the five fungicides showed that the efficacy of the five fungicide against walnut anthracnose was as follows: 25% pyraclostrobin&gt;45% prochloraz&gt;40% difenoconazole&gt;25% azoxystrobin&gt;43% tebuconazole. The control efficien- cies of 25% pyraclostrobin ，45% prochloraz and 43% difenoconazole against walnut anthracnose in field were 82.23% ， 80.26% and 75.98% respectively. 【Conclusion 】Walnut anthracnose is the main fungal disease in northwest of Guangxi. 25% pyraclostrobin is recommended as preferable fungicide to control walnut anthracnose. Furthermore ，the occurrence degreeofthesediseasescanbepreventedbyavoidingplantingonlow-lying ，poordrainageandpoorventilationplace. Key words ：walnut ；fungaldisease ；anthracnose ；fungicides ；controlefficacy ；northwestofGuangxi 8 期 · 1533 · 汪筱雪等 ： 廣西西北部核桃真菌性病害調查及核桃炭疽病防治試驗 1 . 2 試驗材料 此 次 調 查 的 核 桃 品 種 主 要 有 鳳 優(yōu)1 號 、 鳳 優(yōu)2 號 、 云 新 核 桃 、 云 南 漾 濞 大 泡 核 桃 、 美 國 山 核 桃 、 山 東 遼 河1 號 和 香 玲 核 桃 等 。 采 集 感 病 植 株 的 葉 片 、 枝 條 和果實 ， 帶回實驗室作進一步試驗 。 主 要 儀 器 設 備 ： 電 熱 恒 溫 鼓 風 干 燥 箱 （DHZT- 9240A 型 ， 太 倉 精 宏 儀 器 設 備 有 限 公 司 ） ， 全 自 動 立 式 電 熱 壓 力 蒸 汽 滅 菌 鍋 （YXQ-LS-S 型 ， 上 海 博 訊 實 業(yè) 有 限 公 司 ） ， 光 照 培 養(yǎng) 箱 （LRH-400-G 型 ， 韶 關 市 泰 宏 醫(yī) 療 器 械 有 限 公 司 ） ， 生 物 光 學 顯 微 鏡 （OLYM- PUS CX21， 日 本 東 京 奧 林 巴 斯 公 司 ） ， PCR 儀 天 根 生 化 科 技 （ 北 京 ） 有 限 公 司 ， 電 泳 槽 （DYCZ-24A 型 ， 北 京 六 一 儀 器 廠 ） ， 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) （ 購 自Bio-Rad 公 司 ） ， DNA 提 取 試 劑 盒 新 型 植 物 基 因 組DNA 提 取 試 劑 盒 （NuClean PlantGen DNA Kit ） ， 康 為 世 紀 生 物 科技有限公司 。 1 . 3 病害田間調查方法 選 擇 天 氣 回 暖 、 高 溫 、 高 濕 時 節(jié) ， 即 核 桃 病 害 發(fā) 病 高 峰 期 開 展 核 桃 苗 圃 真 菌 性 病 害 調 查 及 采 樣 工 作 。 采 用 線 路 踏 查 法 進 行 核 桃 病 害 種 類 調 查 ， 具 體 方 法 ： 調 查 人 員 在 同 一 樹 種 苗 圃 間 行 走 觀 察 植 株 ， 記 載 病 害 發(fā) 生 的 種 類 、 嚴 重 程 度 ， 采 集 帶 有 典 型 癥 狀 的 樣 本 ， 歸 類 存 放 ， 帶 回 實 驗 室 后 進 行 分 離 鑒 定 。 病 害 發(fā) 生 嚴 重 程 度 調 查 根 據 同 一 樹 種 苗 圃 田 塊 形 狀 選 擇 調 查 方 法 及 采 樣 ， 當 田 塊 較 大 、 較 規(guī) 則 時 ， 可 采 用 五 點 取 樣 法 ， 每 個 點 為 邊 長 約2 m 的 正 方 形 ； 當 田 塊 為 長 條 形 時 ， 可 采 用 三 點 法 ， 即 兩 頭 選 兩個點 、 中間選 擇 一 個 點 ； 對 于 不 規(guī) 則 的 林 場 ， 可 采 取 隨 機 抽 樣 調 查 采 樣 。 病 害 嚴 重 度 分 級 標 準 （ 表1 ） 參 照 方 中 達 （1998 ） 的方法 。 發(fā)病率及病情指數按以下公式計算 ： 發(fā)病率 （% ） = 發(fā)病數/ 調查總數×100 病情指數= （ 各級發(fā)病數× 各級代表值 ） / （ 調 查總數× 最高級數 ） ×100 1 . 4 病原菌分離及鑒定 1. 4. 1 病 原 菌 分 離 純 化 選 取 新 鮮 的 帶 有 典 型 病 斑 的 核 桃 葉 片 或 根 莖 ， 用 解 剖 刀 取 病 健 交 界 處 5 mm×5 mm 大 小 的 組 織 塊 ， 先 用75% 酒 精 浸 潤10 s ， 再 用0.1% 升 汞 溶 液 消 毒30 s ， 最 后 用 滅 菌 水 沖 洗3 次 ， 待 組 織 塊 晾 干 后 ， 將 其 轉 入PDA 培 養(yǎng) 基 中 ， 置 于 25 的 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng) ， 待 組 織 上 長 出 的 菌 落 產 孢 后 進行單孢稀釋純化 。 1. 4. 2 病 原 菌 致 病 性 測 定 病 原 菌 致 病 性 測 定 的 寄 主 植 物 為 云 南 漾 濞 大 泡 核 桃 。 將 已 純 化 的 病 原 菌 用5 mm 打 孔 器 打 取 大 小 一 致 的 菌 絲 塊 ， 分 別 同 時 進 行 野 外 植 株 接 種 和 室 內 離 體 接 種 。 設 針 刺 法 和 無 傷 口 接 種 兩 種 處 理 ， 以 空 白 瓊 脂 塊 處 理 為 空 白 對 照 。 每 處 理 均 設3 次 重 復 。 室 內 離 體 接 種 各 處 理 使 用 有 機 玻 璃 罩 罩 住 后 置 于 溫 室 內 保 濕 ， 野 外 植 株 接 種 后 使 用 無 菌 保 鮮 袋 套 袋 進 行 保 濕 ， 此 后 每 天 觀 察 并 記 錄 發(fā) 病 情 況 ， 待 出 現 癥 狀 后 ， 根 據 柯 赫 氏 法 則 對 發(fā) 病 部 位 進 行 病 原 再 分 離 ， 若 仍 能 得 到 相 同 的 菌 ， 即 確 定 其為病原菌 。 1. 4. 3 病 原 菌 形 態(tài) 學 鑒 定 及rDNA-ITS 序 列 測 定 病 原 菌 形 態(tài) 學 鑒 定 ： 將 純 化 后 的 病 原 菌 菌 種 在 適 宜 的 溫 度 條 件 下 進 行 活 化 培 養(yǎng) 并 逐 日 觀 察 記 錄 病 原 菌 的 培 養(yǎng) 性 狀 ， 如 菌 落 大 小 、 顏 色 、 形 狀 等 。 采 用 插 片 法 在 光 學 顯 微 鏡 下 觀 測 病 原 菌 的 菌 絲 、 產 孢 梗 和 孢 子 等 的 大 小 及 形 態(tài) 特 征 。 觀 察 病 原 菌 孢 子 等 的 形 態(tài) 結 構 時 ， 使 用 奧 林 巴 斯CX21 型 生 物 光 學 顯 微 鏡 ， 先 于10 倍 物 鏡 視 野 下 觀 察 ， 后 使 用40 倍 物 鏡 觀 察 其 孢 子 等 的 具 體 形 態(tài) 特 征 ； 形 態(tài) 學 鑒 定 方 法 參 照 相 關 文 獻 （ 魏景超 ， 1982 ； 周茂繁 ， 1989 ； 許志剛 ， 2002 ） 。 病 原 菌rDNA-ITS 序 列 測 定 ： 將 純 化 后 的 病 原 菌 接 種 至PDA 培 養(yǎng) 基 上 ， 待 其 生 長68 d 后 刮 取 菌 絲 提 取DNA 。 將 所 提DNA 進 行PCR 擴 增 ， 擴 增 引 物 為 ITS4 ： 5&#39;-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3&#39; ； ITS1： 5&#39;- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3&#39; （ 周 穎 ， 2016 ） 。PCR 反 應 體 系25.0L ， 其 中 包 括2×Taq MasterMix 12.5 L ， 上 、 下 游 引 物 各1.0L ， DNA 模 板3.0L ， RNase- Free Water 補 足 至25.0L 。 擴 增 程 序 ： 94 預 變 性5 min ； 94 30 s ， 55 30 s ， 72 30 s ， 進 行30 個 循 環(huán) ； 72 延 伸7 min 。 擴 增 產 物 用 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 ， 將 成 像 條 帶 清 晰 明 亮 的PCR 產 物 委 托 生 工 生 物 工 程 （ 上 海 ） 股 份 有 限 公 司 和 康 為 世 紀 生 物 科 技 有 限 公 司 純 化 回 收 后 測 序 。 對 測 定 的 結 果 ， 采 用www.ncbi. nlm.nih.gov 網 站 中 的BLAST 比 對 程 序 進 行 比 對 分 析 ， 查 找 同 源 性 最 高 的 病 原 菌 序 列 。 根 據 病 原 菌 分 子 序 列 對 比 結 果 ， 使 用MEGA 7.0 、 DNAMAN 及 BioEdit v7.0.5進行分析 ， 明確其分類地位 。 1. 5 防治藥劑篩選試驗 1. 5. 1 供試藥劑 供試劑信息見表2 。 1. 5. 2 室 內 藥 劑 篩 選 試 驗 以43% 戊 唑 醇 、 45% 咪 級別 Grade 0 1 2 3 4 代表值 Value 0 1 2 3 4 各級發(fā)病特征 Characterofdiseaseatdifferentlevels 植株無病 病斑面積占采樣組織的1/4以下 病斑面積占采樣組織的1/41/2 病斑面積占采樣組織的1/23/4 病斑面積占采樣組織的3/4 以上 ， 至全部壞死 表 1 病害嚴重度分級標準 Table1 Gradingstandardsofdifferentdiseaseseverity 49 卷 南 方 農 業(yè) 學 報 · 1534 · 藥品名 Fungicide 43% 戊唑醇43%tebuconazole 45% 咪鮮胺45%prochloraz 25% 嘧菌酯25%azoxystrobin 25% 吡唑醚菌酯25%pyraclostrobin 40% 苯醚甲環(huán)唑40%difenoconazole 試劑種類 Reagenttype 懸浮劑 水乳劑 懸浮劑 懸浮劑 懸浮劑 有效成分含量 （g/L ） Activeconstitutecontent 430 450 250 250 400 生產廠家 Manufacturer 江西威力特生物科技有限公司 山東奧德利化工有限公司 江西威力特生物科技有限公司 濟南仕邦農化有限公司 河北卓誠化工有限責任公司 表 2 供試藥劑種類 Table2 Thetestedfungicidetypes 鮮 胺 、 25% 嘧 菌 酯 、 25% 吡 唑 醚 菌 酯 和40% 苯 醚 甲 環(huán) 唑 為 供 試 藥 劑 ， 以 在PDA 培 養(yǎng) 基 上 經 分 離 純 化 的 病 原 菌 為 供 試 材 料 。 將 供 試 藥 劑 按 計 算 好 的 量 加 入 PDA 培 養(yǎng) 基 ， 配 置 不 同 濃 度 藥 劑 培 養(yǎng) 基 ， 向 每 個 培 養(yǎng) 皿 內 倒 入10 mL 培 養(yǎng) 基 ， 以 不 加 藥 劑 的PDA 培 養(yǎng) 基 為 對 照 ， 各 處 理 重 復3 次 。 將 斜 面 保 存 的 菌 種 于 無 菌 的PDA 培 養(yǎng) 基 中 進 行 活 化 培 養(yǎng) ， 培 養(yǎng)6 d 后 于 菌 落 邊 緣 處 用5 mm 打 孔 器 打 取 大 小 一 致 的 菌 絲 塊 ， 將 菌 絲 塊 接 種 至 已 凝 固 的 藥 劑 培 養(yǎng) 基 及 空 白 對 照 培 養(yǎng) 基 正 中 央 ， 封 口 膜 封 口 ， 于25 恒 溫 條 件 下 培 養(yǎng) ， 每3 d 測 量 一 次 菌 落 直 徑 ， 直 至 空 白 對 照 組 菌 落 占 培 養(yǎng) 皿 的 80% 。 用 垂 直 十 字 交 叉 法 測 量 所 得 各 處 理 的 菌 落 直 徑 ， 計 算 菌 落 生 長 抑 制 率 ， 并 求 出 毒 力 回 歸 方 程 、 相 關系數和抑制中濃度 （EC50 ） 。 1. 5. 3 田 間 防 治 試 驗 在 金 城 江 區(qū) 齊 美 村 才 貴 屯 核 桃 示 范 基 地 進 行 田 間 防 治 試 驗 。 選 擇23 年 生 核 桃 苗 為 施 藥 對 象 ， 藥 劑 選 擇45% 咪 鮮 胺1000 倍 、 25% 吡 唑 醚 菌 酯1000 倍 和40% 苯 醚 甲 環(huán) 唑1000 倍 液 ， 以 清 水 處 理 為 對 照 （CK ） 。 因 試 驗 地 為 坡 地 ， 核 桃 種 植 不 規(guī) 則 ， 因 此 采 取 小 區(qū) 隨 機 設 計 ， 每 一 片 集 中 地 區(qū) 隨 機 設4 個 小 區(qū) ， 每 小 區(qū) 對 應 一 種 藥 劑 及 清 水 對 照 ， 確 保 同 一 片 集 中 地 區(qū) 內 每 種 處 理 核 桃 株 數 一 致 ， 每 處 理4 次 重 復 。 每 隔15 d 噴 藥1 次 ， 共 噴3 次 ， 最 后 一 次 施 藥 后15 d 調查其發(fā)病率及病情指數 。 病情指數增長率 （% ） = （ 用藥后病情指數 - 用藥 前 病 情 指 數 ） / （100- 用 藥 前病情指數 ） ×100 防治效果 （% ） = （ 對 照 組 病 情 指 數 增 長 率 - 處 理 組 病 情 指 數 增 長 率 ） / 對 照 組 病 情指數增長率×100 1 . 6 統(tǒng)計分析 采 用Excel 2010 對 試 驗 數 據 進 行 整 理 ， 使 用 SPSS 21.0 進 行 數據統(tǒng)計分析 。 2 結果與分析 2 . 1 核桃真菌性病害種類調查結果 2. 1. 1 核 桃 根 腐 病 危 害 核 桃 植 株 根 部 ， 根 部 腐 爛 導 致 病 株 葉 片 出 現 退 綠 、 黃 化 和 萎 蔫 等 癥 狀 ， 嚴 重 時 導 致 整 株 死 亡 ， 淹 水 后 容 易 發(fā) 病 （ 圖1 ） 。 此 病 只 在 金 城 江 區(qū) 三 才 村 內 文 屯 種 植 地 、 金 城 江 區(qū) 大 山 塘 示 范 基 地 （ 山 地 種 植 ） 、 鳳 山 縣 金 牙 鄉(xiāng) 示 范 基 地 和 樂 業(yè) 縣 央 林 大 槽 發(fā) 生 ， 多 數 只 有12 株 發(fā) 病 。 除 金 城 江 區(qū) 三 才 村 內 文 屯 種 植 地 外 ， 其 他 調 查 點 核 桃 根 腐 病 發(fā) 病 率 均 低 于5.00% 以 下 ； 金 城 江 區(qū) 三 才 村 內 文 屯 種 植 地 核 桃 根 腐 病 發(fā) 病 率 高 達53.85%， 因 該 地 地 處 山 內 盆 地 ， 地 勢 較 低 ， 接 連 陰 雨 造 成 大 面 積 淹 水 ， 導 致 根 腐病發(fā)生嚴 重 。 分 離 得 到 一 株 優(yōu) 勢 菌 株HTGF-1 ， 分 離 率 為64% 。 將 該 菌 進 行 純 培 養(yǎng) 后 ， 取5 mm 菌 絲 塊 接 種 于 健 康 的 核 桃 根 系 ， 利 用 柯 赫 氏 法 則 確 定HTGF-1 菌 株 為 核 桃 根腐病病原菌 。 病 原 菌 在PDA 培 養(yǎng) 基 上 培 養(yǎng) ， 初 期 為 白 色 絮 狀 菌 絲 ， 后 期 菌 落 背 面 產 生 黑 色 色 素 。 其 病 原 菌 有 兩 種 形 態(tài) 的 分 生 孢 子 ， 小 型 分 生 孢 子 呈 卵 形 ， 無 隔 或 只 有1 個 分 隔 ， 大 小 為10.05±2.50m×7.6±0.50m ； 大 型 分 生 孢 子 呈 鐮 刀 形 ， 有13 個 隔 ， 兩 端 鈍 圓 ， 大 小 為 43.35±6.30m×5.4±0.20m （ 圖2 ） 。 根 據 其 分 生 孢 子 的 鐮 刀 狀 初 步 判 定 為 鐮 刀 菌 屬 真 菌 ， 經rDNA- ITS 序 列 測 定 后 ， 與GenBank 中 的Fusarium solani （KJ528277.1 ） 同 源 性 達99% ， 進 而 確 定 核 桃 根 腐 病 病原菌為腐皮鐮刀菌 （F. solani ） 。 2. 1. 2 核 桃 枝 枯 病 主 要 危 害 小 枝 ， 尤 以12 年 生 枝 條 為 主 ， 開 始 時 病 原 菌 多 從 頂 梢 幼 嫩 的 斷 枝 進 行 侵 染 ， 隨 后 逐 漸 向 下 侵 染 直 至 主 干 。 侵 染 初 期 時 枝 條 呈 暗 灰 褐 色 ， 稍 凹 陷 ， 病 健 交 界 處 的 健 康 組 織 常 稍 隆 起 ， 后 逐 漸 變 為 淺 紅 褐 色 ， 最 后 變 為 深 灰 色 。 病 部 皮 層 壞 死 、 干 縮 ， 很 快 擴 展 繞 枝 條 一 周 ， 造 成 枝 枯 ， 其 上 葉 片 逐 漸 變 黃 脫 落 。 病 死 枯 枝 上 散 生 很 多 黑 色 小 圖 1 核桃根腐病田間危害癥狀 Fig.1 Symptomsofwalnutrootrotinfield 8 期 · 1535 · 汪筱雪等 ： 廣西西北部核桃真菌性病害調查及核桃炭疽病防治試驗 圖 2 核桃根腐病病原菌的分生孢子 Fig.2 Conidiaofpathogenofwalnutrootrot a ： 小型分生孢子 ； b ： 大型分生孢子 a ：Microconidia ；b ：Macroconidia 顆 粒 ， 直 徑0.20.3 mm ， 為 其 病 原 菌 的 分 生 孢 子 器 ， 濕 度 大 時 ， 分 生 孢 子 器 上 會 重 新 分 泌 出 分 生 孢 子 堆 （ 圖3 ） 。 調 查 結 果 顯 示 ， 核 桃 枝 枯 病 病 害 級 數14 級 不 等 ， 發(fā) 病 嚴 重 的 全 株80.00% 感 染 致 使 植 株 死 亡 。 在 金 城 江 區(qū) 三 才 村 內 文 屯 、 金 城 江 區(qū) 大 山 塘 示 范 基 地 、 環(huán) 江 縣 水 源 鎮(zhèn) 核 桃 示 范 基 地 、 樂 業(yè) 縣 央 林 大 槽 等 地 發(fā) 病 率 為25.00%40.00%， 其 中 樂 業(yè) 縣 央 林 大 槽 發(fā)病率最高 ， 為37.50% 。 將 感 病 組 織 帶 回 實 驗 室 后 對 發(fā) 病 部 位 進 行 切 片 觀 察 ， 發(fā) 現 病 原 菌 分 生 孢 子 器 扁 球 形 ， 單 腔 ， 保 濕 培 養(yǎng) 一 段 時 間 后 會 從 其 上 溢 出 分 生 孢 子 。 取 感 病 部 位 進 行 分 離 ， 得 到 一 株 優(yōu) 勢 菌 株ZK6-4。</p>