<p>，（）： &nbsp; 研 究 簡(jiǎn) 報(bào) 收稿日期 ： &nbsp; 修訂日期 ：基金項(xiàng)目 ：國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目 （）通信作者 ：；湖南省番茄和牽牛花上雙生病毒的分子鑒定班一云 ，丁波，周雪平（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 ，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，北京）摘要雙生病毒是一類在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的單鏈環(huán)狀 病毒 。本文對(duì)從湖南采集到的 例 （洋姜 、番茄 、蘿卜 、賽葵 、甘薯 、牽?；?）疑似雙生病毒侵染的植物葉片進(jìn)行了分子鑒定 。利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù) （）對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，分別對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并將酶切得到的片段測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示番茄樣品中的病毒分離物與番茄黃化曲葉病毒相似性最高 （），牽牛花樣品中的病毒分離物與甘薯卷葉病毒相似性最高（），證明這兩個(gè)分離物是單組分雙生病毒。這是在湖南省首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道雙生病毒的全核酸序列 。關(guān)鍵詞番茄黃化曲葉病毒 ；甘薯卷葉病毒 ；中圖分類號(hào) ： &nbsp;文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： &nbsp;： ， （ ， ， ， ，） （）， （） （）， ， ； ；雙生病毒是一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物單鏈病毒 ，一般發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū) ，寄主范圍十分廣泛 ，在全球范圍內(nèi)造成重大損失。番茄黃化曲葉病毒 （）和甘薯卷葉病毒 （）均屬于雙生病毒科的菜豆金色花葉病毒屬，該屬病毒主要以煙粉虱傳播 ，危害極為嚴(yán)重。番茄黃化曲葉病毒是侵染番茄 的主要病毒之一 ，最早在以色列被發(fā)現(xiàn) ，年正式被命名。該病毒引起植株曲葉 、黃化 、矮化等癥狀 ，常對(duì)番茄栽培地區(qū)造成毀滅性危害。我國(guó)是世界上最大的甘薯 生產(chǎn)國(guó) ，而甘薯卷葉病毒主要侵染旋花科植物 ，其危害嚴(yán)重阻礙了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。牽?；?是一種觀賞植物 ，并且具有藥用價(jià)值 ，其生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng) ，田間路邊隨處可見 。研究表明 ，雙生病毒可經(jīng)煙粉虱在牽?；ㄅc作物之間相互傳播，因此牽牛花對(duì)雙生病毒重組 、傳播及擴(kuò)散都有重要的作用 ，對(duì)作物生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。目前 ，受全球氣候變暖 、國(guó)際貿(mào)易加強(qiáng)及人類活動(dòng)等影響 ，雙生病毒病害在我國(guó)的危害范圍不斷擴(kuò)大。因此 ，對(duì)不同地區(qū) 、不同寄主卷第 期 班一云等：湖南省番茄和牽?；ㄉ想p生病毒的分子鑒定的雙生病毒進(jìn)行鑒定 ，進(jìn)一步明確該病害在我國(guó)的發(fā)生 、分布及危害情況可為病毒病防控打下基礎(chǔ) 。本研究對(duì)從湖南省采集的樣品進(jìn)行了分子鑒定 ，發(fā)現(xiàn)番茄樣品被侵染 ，而牽?；悠繁磺秩?，和分離物的全基因組大小均約的單鏈環(huán)狀分子 。病毒基因組共編碼個(gè)開放閱讀框 （ ，），分別為 、 、和，并未檢測(cè)到和組分 。 材料與方法 材料 樣品采集年月在湖南省長(zhǎng)沙市采集到疑似被雙生病毒侵染的植物葉片樣品份 ，分別為洋姜 、番茄（圖）、蘿卜 、賽葵 、甘薯和牽牛花 （圖）。陽性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保存的番茄黃化曲葉病毒和甘薯卷葉病毒 。圖 從湖南省采集的番茄和牽?；悠返母胁“Y狀 試劑及儀器內(nèi)切酶 ，購(gòu)自 公司 ；零背景快速克隆試劑盒 ，購(gòu)自天根生化科技公司 ；× ，購(gòu)自全式金生物技術(shù)公司 ；高保真酶試劑盒 ，購(gòu)自公司 ； ，購(gòu)自 公 司 ； ，購(gòu)自公司 ； 離心機(jī) ，購(gòu)自公司 ； 凝膠成像系統(tǒng) ， 儀 ，購(gòu) 自公 司 ；全自動(dòng)快速樣品研磨儀 ，購(gòu)自上海凈信科技公司 。 方法 葉片總提取采用法提取樣品葉片總。分別取葉片組織放入預(yù)先加入一枚鋼珠的離心管中 ，液氮速凍后利用全自動(dòng)快速樣品研磨儀將樣品研磨至粉狀 ，加入 水浴預(yù)熱的抽提緩沖液 ，水浴保溫后加入等體積的的氯仿 異戊醇振蕩混勻 ， 離心，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中 。然后加入體積醋酸鈉 （）和倍體積的預(yù)冷的無水乙醇 ，混勻后于放置， 離心以沉淀，棄上清后用 乙醇將沉淀清洗次 ， 離心棄上清后干燥 ，最后加入適量去離子水溶解，置于保存 。 病毒基因組的滾環(huán)擴(kuò)增及酶切鑒定利用 對(duì)樣品總進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增 。將 （約）加入到樣品緩沖液中 ，變性后立即置于冰上，然后加入反應(yīng)緩沖液和 聚合酶 ，混勻后置于反應(yīng)，最后加熱以終止反應(yīng) 。選取多種雙生病毒含有的酶切位點(diǎn) ，采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別對(duì)個(gè)樣品的產(chǎn)物進(jìn)行酶切以獲得特異性片段 。 病毒基因組的克隆測(cè)序及全長(zhǎng)序列獲取將酶切得到的片段連接至載體 ，由北京擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序 ，在網(wǎng)站對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì) ，結(jié)果表明番茄樣品分離物與的相似性最高 ，牽?；悠贩蛛x物與的相似性最高 。根據(jù)測(cè)得的部分序列設(shè)計(jì) 特 異 引 物 對(duì) ：（）（）和（）（）分別擴(kuò)增番茄樣品和牽?；悠贩蛛x物的全長(zhǎng) 。同時(shí)分別利用組分的通用引物和的通用引物對(duì) 樣 品 進(jìn) 行擴(kuò) 增 ，以 期 獲 得和序列 。 病毒基因組序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建利用 軟件對(duì)篩選的陽性克隆··序列進(jìn)行比對(duì) ，最終確定病毒分離物的基因組全序列 。在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)分析 ，并從中選取已報(bào)道的和的代表性同 源 序 列 ，在 中 采 用 鄰 接 法（）構(gòu)建全基因組序列進(jìn)化樹 ，系統(tǒng)進(jìn)化樹中參數(shù)值設(shè)置為 。 結(jié)果與分析 產(chǎn)物酶切檢測(cè)以提取的植物基因組總為模板分別進(jìn)行擴(kuò)增 ，通過酶切樣品的產(chǎn)物 ，從番茄和牽?；悠分芯玫搅俗笥业臈l帶 （圖），割膠純化后克隆測(cè)序 ，序列比對(duì)結(jié)果顯示 ，番茄樣品的分離物與中番茄黃化曲葉病毒 （）的 相 似 性 最 高 （），命 名 為（）；牽?；悠分械姆蛛x物與甘薯卷葉病毒 （）的相似性最高 （），命名為（）。利 用 通 用 引 物和對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增 ，結(jié)果均未檢測(cè)到或組分 ，推測(cè)和均 為 僅 含 有組分的單組分雙生病毒 。圖 湖南省采集樣品的 產(chǎn)物的酶切鑒定 病毒基因組的序列測(cè)定和分析通過酶切產(chǎn)物得到番茄和牽?；悠贩蛛x物的基因組片段 ，分別設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增全長(zhǎng) （圖），每個(gè)分離物均檢測(cè)個(gè)陽性克隆 ，測(cè)序結(jié)果表明各分離物病毒基因組序列之間無任何差異 。其中 ，全長(zhǎng)為 ，為單鏈閉合環(huán)狀，共編碼個(gè)，其中病毒鏈編碼個(gè)：（）和（），互補(bǔ)鏈編碼個(gè)：（）、（）、（）和（）。全長(zhǎng)為 ，為單鏈閉合環(huán)狀，共編碼個(gè)，其中病毒鏈編碼個(gè)：（）和（），互 補(bǔ) 鏈 編 碼個(gè)：（）、（）、（）和（）。圖 利用特異引物擴(kuò)增番茄樣品和牽?；悠分须p生病毒分離物基因組全長(zhǎng) 及的序列分析從中選取有代表性的同源序列和和序列進(jìn)行序列比對(duì) ，采用鄰接法 （）分別對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹 （圖）。從進(jìn)化樹圖中可以看出 ，與云 南 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 最 近 （圖），與江蘇 、安徽等地分離物的親緣關(guān)系最近 （圖）。 討論本研究通過對(duì)從湖南省采集的例樣品進(jìn)行檢測(cè)及鑒定 ，證明雙生病毒的危害進(jìn)一步擴(kuò)大到了··卷第 期 班一云等：湖南省番茄和牽?；ㄉ想p生病毒的分子鑒定湖南省 ，為進(jìn)一步研究我國(guó)雙生病毒的分布情況及分子變異情況提供了一定的科學(xué)依據(jù) 。根據(jù)雙生病毒科病毒的命名規(guī)則 ，全基因組核酸序列的相似性大于被命名為同種病毒的不同株系 ，小于則被命 名 為 不 同 種 的 病 毒，因 此 將確 定 為的 一 個(gè) 分 離 物 ，為的一個(gè)分離物 。這是首次在湖南省發(fā)現(xiàn)并報(bào)道雙生病毒 。圖 和 不同分離物的核苷酸序列進(jìn)化樹 番茄在湖南省的生產(chǎn)生活中占有重要地位 ，它不僅是人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹饕卟?，番茄產(chǎn)業(yè)也為當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)民增加了收入 。然而 ，番茄黃化曲葉病毒病是一種發(fā)生于番茄上的毀滅性病害，它嚴(yán)重制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 。目前 ，該病害在我國(guó)傳播呈現(xiàn)出由南向北的發(fā)展趨勢(shì) ，并且逐年加重。從進(jìn)化樹關(guān)系圖中可以看出 ，和云南等省市的分離物的序列親緣關(guān)系最近 ，并且其保守性也很高 ，所以我們推測(cè)從湖南省檢測(cè)到的雙生病毒很可能是從周邊省份傳入 。湖北省與湖南省相鄰 ，并且在年已有雙生病毒發(fā)生的報(bào)道，但是兩地分離物的親緣關(guān)系卻不是最近 （圖），可見分離物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近并不與地域呈正相關(guān) 。由于可隨種苗等傳播 ，所以有必要在調(diào)種前進(jìn)行檢測(cè) ，同時(shí)也建議加強(qiáng)田間管理工作 ，及時(shí)清除病苗和適時(shí)施肥等；而積極培育選擇抗病品種也會(huì)在很大程度上減少經(jīng)濟(jì)損失 。甘薯卷葉病毒主要侵染旋花科植物 ，在中國(guó)從南到北均有發(fā)生 ，不但危害了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 ，還嚴(yán)重影響了牽?；ǖ慕?jīng)濟(jì)價(jià)值。作為一種主要的觀賞植物 ，牽牛花在田間路邊隨處可見 。研究表明 ，雙生病毒可經(jīng)煙粉虱在牽?；ㄅc作物之間互傳 ，作為雙生病毒的中間寄主 ，牽?；▽?duì)其重組 、傳播及擴(kuò)散都有重要的作用。因此 ，在平時(shí)作物生產(chǎn)過程中應(yīng)加 強(qiáng) 檢 疫 ，使 用 無 毒 種 苗 ，發(fā) 現(xiàn) 病 株 后 及 時(shí)拔除 。是一種新近發(fā)展起來的恒溫核酸擴(kuò)增方法 ，可以直接從樣品總擴(kuò)增目的，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶病毒的信號(hào)放大 ，在生物大分子檢測(cè)方面有重要的應(yīng)用價(jià)值 ，同時(shí)也提高了雙生病毒的檢出率。本研究通過酶切樣品的產(chǎn)物快速準(zhǔn)確地檢測(cè)到番茄和牽?；悠分械碾p生病毒序列 ，進(jìn)一步明確了該病害在我國(guó)的發(fā)生及分布情況 ，為雙生病毒病害的防控提供了參考 。參考文獻(xiàn) ， ， ， ： ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：·· ， ， ， ： ，（）： ， ， ， （ ） ，（）：宋建軍 ，劉紅宵 ，仇燕 ，等 番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生分布及防治對(duì)策 北方園藝 ，（）：?jiǎn)特懾?，秦艷紅 ，喬奇 ，等 甘薯卷葉病毒江蘇分離物基因組全長(zhǎng)序列測(cè)定及其外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá) 河南農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）：， ， ， ，（）： ， ， ， ： ， （：） ，（）： ， ， ， ，（）：王向陽廣西勝紅薊黃脈病樣中發(fā)現(xiàn)多種菜豆金色花葉病毒屬的病毒 植物病理學(xué)報(bào) ，（）：周雪平雙生病毒種類鑒定、分子變異及致病機(jī)理研究 中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì) 年學(xué)術(shù)年會(huì) ， ， ， ，（）： ， ， ：， ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ，植物病理學(xué)報(bào)，（）： ， ， ， ： ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ，（）：苗相偉番茄黃化曲葉病毒病的研究進(jìn)展中 國(guó) 果 菜，（）：湯亞飛 ，何自福 ，杜振國(guó) ，等番茄黃化曲葉病毒在湖北首次報(bào)道 植物保護(hù) ，（）：徐德利 ，楊靜 ，鮑繼友 ，等番茄黃化曲葉病毒病綜合防控技術(shù)研究進(jìn)展 農(nóng)業(yè)科技通訊 ，（）： ， ， ， ，（）： ，ü ， ， ，（）：（責(zé)任編輯 ：楊明麗櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍）（上接頁(yè)）李儒海 ，褚世海 二氯喹啉酸對(duì)水稻后茬作物的安全性研究湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，（）：黃翅 ，羅坤 降解菌 對(duì)茄科作物二氯喹啉酸藥害的修復(fù)作用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ，（）：王一茹 ，劉長(zhǎng)武 ，牛成玉 ，等 二氯喹啉酸及其代謝物在稻田水土作物中的氣譜和液譜殘留分析方法研究 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù) ，（）：陳澤鵬 ，王靜 ，萬樹青 ，等 廣東部分地區(qū)煙葉畸形生長(zhǎng)的原因及治理的研究 中國(guó)煙草學(xué)報(bào) ，（）：李晶新 ，韓錦峰 ，劉華山 ，等 二氯喹啉酸對(duì)烤煙種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響 河南農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）：李麗春 ，陳澤鵬 ，張萬良 ，等二氯喹啉酸在土壤、畸形煙葉和烤煙中殘留量的比較分析 農(nóng)藥 ，（）：張倩 ，郭偉 ，宋超 ，等二氯喹啉酸在不同土壤中的降解規(guī)律及其影響因子 中國(guó)煙草科學(xué) ，（）：賈菲 ，高貴 ，鄭良玉除草劑二氯喹啉酸的毛細(xì)管電泳分析分析化學(xué)，（）：陳虹 ，鐘明 ，唐昊冶 ，等高效液相色譜法測(cè)定土壤中的二氯喹啉酸 土壤 ，（）：鄭雄志 ，曾維愛 ，趙松義 ，等高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)煙草和植煙土壤中的二氯喹啉酸殘留量 中國(guó)煙草學(xué)報(bào) ，（）：陳澤鵬 ，王靜 ，萬樹青 ，等煙區(qū)土壤殘留二氯喹啉酸的消解動(dòng)態(tài) 農(nóng)藥 ，（）：（責(zé)任編輯 ：楊明麗 ）··</p>