第 14 期第 57 卷第 3 期2018 年 1月湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)Hubei Agricultural SciencesVol 55 No.10May.，201655 26Vol 55 No.1Jan.14期757 4Jul. 18于舒怡，劉志恒，邵 丹，等.辣椒菌核病菌毒素的產(chǎn)生及其生物活性測定J.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，57（14）：53-55，63.收稿日期：20180330作者簡介：于舒怡（1982），男，山東煙臺人，副研究員，博士，主要從事園藝作物病害病理學(xué)和流行學(xué)研究，（電話）13998882718（電子信箱）crea0115163com；通信作者，劉志恒，教授，主要從事植物病理學(xué)研究，（電子信箱）lzzh1954163com。辣椒菌核?。⊿clerotinia rot of pepper）是由子囊菌門核盤菌屬核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum（Lib） de Bary侵染引起的一種真菌病害1。 隨著設(shè)施辣椒種植面積逐年擴(kuò)大和連茬種植， 辣椒菌核病發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重， 已成為遼寧辣椒生產(chǎn)的主要病害之一2，3。 辣椒菌核病菌分泌的草酸產(chǎn)物是其產(chǎn)生致病性的基本決定因子4，5。 草酸可破壞植物細(xì)胞壁的完整性，促進(jìn)細(xì)胞溶解酶的活性，通過酸化寄主組織誘導(dǎo)植株萎蔫，使寄主組織液外滲，利于病菌的侵入和擴(kuò)展6。 前人在油菜、大豆、向日葵等作物上對草酸毒素產(chǎn)生的培養(yǎng)條件6，7、致病性8、致病機(jī)制9、寄主的抗病機(jī)制10等方面均有深入的研究。 然而， 目前尚未見有關(guān)辣椒菌核病菌毒素產(chǎn)毒條件及生物測定方法的報道。因此，本研究采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)和室內(nèi)接種試驗， 開展辣椒菌核病菌毒素的時間序列分析及其生物活性測定， 為選育抗病品種、 有效控制辣椒菌核病提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。辣椒菌核病菌毒素的產(chǎn)生及其生物活性測定于舒怡1，劉志恒2，邵 丹3，劉長遠(yuǎn)1（1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，沈陽 110161；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866；3安華農(nóng)業(yè)保險股份有限公司沈陽中心支公司，沈陽 110141）摘要：采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)和室內(nèi)接種試驗，開展辣椒菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）毒素的時間序列分析及其生物活性測定。 結(jié)果表明，辣椒菌核病菌分泌的毒素產(chǎn)物為草酸，隨著菌絲的不斷生長，病菌分泌的草酸濃度逐漸上升，當(dāng)病菌生長速度最快時，草酸含量也達(dá)到最大值，pH則相應(yīng)降低到最小值。 草酸毒素可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基質(zhì)的pH。 草酸毒素和菌絲的共同作用才能有效侵染寄主組織，且草酸毒素對辣椒種子的萌發(fā)活力、幼苗的生長和植株的發(fā)育均有較強(qiáng)的抑制作用。關(guān)鍵詞：辣椒菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；草酸毒素；生物活性中圖分類號：S4324；S436418 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：04398114（2018）140053-03DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.012 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：Determination of Production and Biological Activity ofToxin of Sclerotinia sclerotiorumYU Shuyi，LIU Zhiheng，SHAO Dan，LIU Changyuan（1Institute of Plant Protection， Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161，China；2College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；3Shenyang Central Subbranch Company，An Hua Agricultural Insurance Co，Ltd，Shenyang 110141，China）Abstract： The time series analysis and biological activity of toxin of Sclerotinia sclerotiorum were carried out by artificialculture and inoculation test The results showed that the main toxin product produced by S sclerotiorum was oxalic acid，andthe concentration of oxalic acid increased gradually with the mycelium growth When the growth rate of pathogen was thefastest，the content of oxalate reached the maximum value，and the pH correspondingly decreased to a minimum Oxalate couldregulate the pH of the culture matrix The combined action of oxalic acid and mycelium could effectively infect host tissues，andoxalate toxin had a strong inhibitory effect on seed germination vigor，seedling growth and plant development of pepperKey words： Sclerotinia sclerotiorum； toxalic acid toxin； biological activity湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2018年1材料與方法11 供試菌株供試菌株采自遼寧省朝陽北票市蒙古營鄉(xiāng)躍進(jìn)示范園試驗田， 經(jīng)組織分離法分離純化獲得純凈的核盤菌菌絲，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌實驗室提供。12 產(chǎn)毒培養(yǎng)液選擇馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液進(jìn)行毒素培養(yǎng)。馬鈴薯 200 g， 葡萄糖 20 g， 去離子水 1 000 mL，121 高溫濕熱滅菌30 min后備用。13 病菌產(chǎn)生的時間序列分析將菌核在PDA平板上培養(yǎng)3d，待長出新鮮菌絲時，取一片直徑 65 mm 菌餅移入裝有 60 mL PD 培養(yǎng)液的 150 mL 三角瓶中， 置于搖床中，110 rmin、25 恒溫振蕩培養(yǎng)，以不接菌的PD培養(yǎng)液為對照，試驗設(shè)置3次重復(fù)。 培養(yǎng)2 d后逐日測定菌絲干重、pH和草酸含量，連續(xù)測定14 d。14 菌絲干重的測量先將備好的濾紙在80 的恒溫箱中烘至恒重，用電子天平稱得所用每張濾紙的重量， 再用雙層濾紙過濾病原菌的培養(yǎng)液， 將過濾后的濾紙及其上面的菌絲體在80 的恒溫箱中烘干至恒重，然后用電子天平稱取其重量， 這兩次稱量數(shù)據(jù)的差值即為菌絲干重。15 毒素pH的測定采用 METTLER TOLEDO （Five Easy）pH 計進(jìn)行毒素pH的測量。16 草酸毒素含量的測定將毒素用去離子水定容到60 mL， 取30 mL 于三角瓶中，加入 25 CaCl22 mL，并加熱 5 min，然后放置過夜，充分沉淀，離心（3 000 rmin，10 min），棄去上清液，用去離子水洗滌沉淀 3 次，將沉淀溶于 5 mL H2SO4中（水硫酸91），充分溶解后，移入滴定瓶中，并用 20 mL 去離子水洗滌溶液，在溶液中加入1 mL 10 MnSO4溶液，加熱到6070 ，用158 gL KMnO4滴定至顯玫瑰色， 且30 s 不退色，計算草酸含量。1 mL 158 gL KMnO4相當(dāng)于0145mg草酸（H2C2O4）。 3次重復(fù)的平均值為培養(yǎng)液草酸濃度。17 病菌毒素生物活性測定產(chǎn)毒培養(yǎng)條件同“13”，培養(yǎng)7 d后，分別采用雙層紗布和細(xì)菌過濾器過濾， 將辣椒菌核病菌培養(yǎng)濾液平均分為兩份， 一份于 121 高溫蒸汽滅菌 30min，離心取上清液為毒素粗提液；另一份為菌核病菌培養(yǎng)液。用辣椒葉片、幼苗、種子進(jìn)行毒素的生物活性測定。 用毒素粗提液200L分別直接接種、針刺接種和脫脂棉包葉柄處理成株期辣椒葉片， 并保濕處理，每個處理 20 片離體葉片，以無菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)液為對照，3 d后觀察處理的癥狀表現(xiàn)。 用病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液分別處理辣椒幼苗， 各使用20 mL和10 mL 兩個梯度，每個處理 20 株，以無菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)液為對照，7 d后觀察其癥狀表現(xiàn)。 用病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液各20 mL浸泡辣椒種子， 每個處理100粒種子，以無菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)液為對照，進(jìn)行發(fā)芽試驗，計算各處理種子的萌發(fā)率及胚根平均長度。18 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 130統(tǒng)計軟件進(jìn)行測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析21 病菌產(chǎn)生的時間序列分析辣椒菌核病菌在毒素培養(yǎng)液中培養(yǎng) 112 d，每天測定菌絲生長量、草酸含量及pH的變化。 結(jié)果表明，辣椒菌核病菌在生長過程中菌絲干重增長迅速，與時間呈正比，并呈“S”型曲線增加，培養(yǎng) 1 d 后，病菌即開始生長，610 d 生長速度最快， 第十天其菌絲生長量達(dá)到最大值，隨之，增殖速度逐漸降低（圖1a）。 培養(yǎng)1 d后毒素的pH開始下降，9 d后呈現(xiàn)上升的趨勢（圖1b）。圖1c顯示，培養(yǎng)1 d后，草酸毒素開始積累，69 d 草酸含量變化速度最快，第九天草酸含量達(dá)到最高峰，隨后其含量略有下降，其中的原因未明。 綜合分析表明，隨著病菌的不斷生長，病菌分泌的毒素濃度逐漸上升，當(dāng)病菌生長速度最快時，草酸含量也達(dá)到最大值，pH 則相應(yīng)降低到最小值；隨著營養(yǎng)成分的不斷利用，病菌生長速度減慢，草酸的積累逐步減少，pH也相應(yīng)略有回升。22 病菌毒素的生物活性測定221 毒素對辣椒成株期葉片生物活性測定 毒素粗提液接種辣椒葉片， 處理方法不同， 癥狀差異明顯。 直接接種處理的葉片無明顯癥狀； 經(jīng)針刺處理的葉片，在侵染點周圍出現(xiàn)水漬狀斑點，病斑中間進(jìn)一步變?yōu)辄S褐色，7 d后葉片腐爛； 使用脫脂棉包裹葉柄的處理，癥狀最為明顯，葉片逐漸退綠，3 d即可腐爛（圖2）。由試驗結(jié)果分析， 辣椒菌核病毒素只有與菌絲共同作用才能侵染成功，在無病原菌菌絲的情況下，不能侵染寄主組織；在組織受傷的情況下，毒素可以使葉片組織退綠、萎蔫、腐爛；同時，毒素經(jīng)葉脈擴(kuò)散較快，通過導(dǎo)管傳輸。54第 14期（下轉(zhuǎn)第63頁）圖 1 辣椒菌核病菌菌絲生長過程中菌絲干重（a）、pH（b）、草酸含量（c）的變化12345678910112時間/d0.60.40.20.0菌絲干重/ga1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12時間/d86420pHb1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12時間/d876543210產(chǎn)生草酸含量/mLc222 毒素對辣椒幼苗的生物活性測定 用辣椒菌核病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液處理幼苗，葉片退綠，幼苗出現(xiàn)萎蔫、生長緩慢、落葉等病狀，植株生活力減弱（圖3）。其中，20 mL病菌培養(yǎng)液處理的植株，根系組織壞死，莖部有水漬狀病斑，并不斷擴(kuò)展，7 d后死亡；毒素粗提液對植株的致萎作用較病菌培養(yǎng)液弱，植株葉片略黃，有落葉現(xiàn)象。223 毒素對辣椒種子生物活性的測定 用辣椒菌核病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液處理辣椒種子， 辣椒種子萌發(fā)率極低，分別為 1800和 2250，與對照相比，差異極顯著（表1）。 第九天胚根平均長度分別為3560 和 3130 mm，且根尖變黃；對照培養(yǎng)處理的種子，其萌發(fā)率為 9233，胚根生長正常，生命力旺盛（圖4）。3小結(jié)與討論人工培養(yǎng)條件下， 隨著辣椒菌核病菌的不斷生長，病菌分泌的毒素濃度逐漸上升，當(dāng)病菌生長速度最快時， 草酸含量也達(dá)到最大值，pH 則相應(yīng)降低到最小值；隨著營養(yǎng)成分的不斷利用，病菌生長速度減慢，草酸的積累逐步減少，pH也相應(yīng)略有回升，表明作為酸性物質(zhì)的草酸成分， 對培養(yǎng)基質(zhì)的 pH 有調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者認(rèn)為草酸毒素可使向日葵葉片的細(xì)胞膜透性逐漸增大，造成電解質(zhì)外滲，即草酸毒素對向日葵葉片細(xì)胞具有一定的破壞作用11。然而，本研究結(jié)果表明， 辣椒菌核病毒素必須在有自然傷口或菌核病菌菌絲侵染形成病斑的條件下才能侵染寄主組織，而在健康寄主上直接接種草酸毒素則無法侵染，說明核盤菌在侵染不同寄主作物上的致病力存在一定差異， 草酸毒素可以加速受病組織迅速分解、破壞，甚至造成組織腐爛；同時，毒素經(jīng)葉脈擴(kuò)散較快，通過導(dǎo)管傳輸，因此病菌在田間危害時，常會在短時間內(nèi)導(dǎo)致寄主組織的破壞和腐解。辣椒菌核病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液對辣椒葉片、 幼苗以及種子均有一定的抑制作用。 草酸毒素圖 2 辣椒菌核病菌毒素對辣椒離體葉片生物活性的影響CK 直接處理 針刺處理 包柄處理圖 4 辣椒菌核病菌毒素對辣椒種子生物活性的影響CK 病菌培養(yǎng)液 毒素粗提液圖 3 辣椒菌核病菌毒素對辣椒幼苗生物活性的影響毒素粗提液20 mL毒素粗提液10 mL病菌培養(yǎng)液20 mLCK病菌培養(yǎng)液10 mL表 1 辣椒菌核病菌毒素對辣椒種子生物活性的影響處理對照培養(yǎng)液病菌培養(yǎng)液毒素粗提液萌發(fā)率%92.3318.0022.50P0.05acbP0.01ACB第九天胚根平均長度mm64.0035.6031.30P0.05abcP0.01ABC差異顯著性 差異顯著性于舒怡等：辣椒菌核病菌毒素的產(chǎn)生及其生物活性測定 55第 14期!（上接第55頁）可使葉片退綠，幼苗出現(xiàn)萎蔫、生長緩慢、落葉、植株生活力減弱，辣椒種子萌發(fā)率極低、胚根長度較短、且根尖變黃、生命力差。說明草酸對辣椒種子的萌發(fā)活力、幼苗的生長和植株的發(fā)育均有較大影響。通過對辣椒菌核病菌草酸毒素進(jìn)行生物活性測定， 為今后用草酸接種鑒定辣椒品種對菌核病的抗性研究提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1 戴芳瀾中國真菌總匯M北京：科學(xué)出版社，19792 劉志恒，邵 丹，楊 紅，等辣椒菌核病菌生物學(xué)特性的研究J沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，39（5）：5565603 郭予元中國農(nóng)作物病蟲害（中冊）M第三版北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，20144 劉勝毅油菜菌核病菌的遺傳變異及病原與寄主的互作關(guān)系J中國油料，1994，17（增刊）：951005 熊秋芳，劉勝毅，李合生抗、感菌核病油菜品種幾種酶活性對草酸處理的響應(yīng)J華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，17（1）：10136 劉 秋，于基成，房德純，等向日葵菌核病菌毒素的產(chǎn)生及其生物活性的測定J沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，32（6）：4224257 劉勝毅，周必文，余 琦，等菌核菌生長和產(chǎn)生草酸的營養(yǎng)和環(huán)境條件研究J微生物學(xué)通報，1993，20（4）：1961998 劉 勇，劉紅雨，曾正宜油菜菌核病菌系致病性研究J中國油料作物學(xué)報，2001，23（3）：54569 李玉芳，官春云油菜菌核病菌侵染的組織病理學(xué)、致病及抗病機(jī)制的研究J作物研究，2005（5）：32733110 劉澄清，杜德志，黃有菊，等甘藍(lán)型油菜的抗病性及其遺傳效應(yīng)的研究J中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991，24（3）：434911 劉 佳，張勻華，孟慶林，等菌核病菌毒素對向日葵葉片生理生化的影響J中國油料作物學(xué)報，2015，37（5）：719723成影響不大。閃蒸工序樣品中芽孢菌數(shù)量有一定的增加，閃蒸車間投料口與真空干燥間未完全隔斷， 在真空干燥間轉(zhuǎn)用車、 閃蒸車間入料口及出料口均采集到一定數(shù)量的芽孢菌，空氣環(huán)境、轉(zhuǎn)用過程、閃蒸管道衛(wèi)生這些因素均有可能造成真空干燥工序產(chǎn)品一定程度的二次污染，閃蒸工序采用氣流干燥，干燥溫度較低，僅為 50 左右，可能對管道及半成品中潛在的芽孢菌滅活能力減弱， 從而造成該工序末端產(chǎn)品中含有芽孢菌。內(nèi)包間為潔凈車間，其空氣中存在一定數(shù)量的芽孢菌，來源可能是半成品粉塵。芽孢菌在空氣中較難清除，可長期存在，可能給環(huán)境及產(chǎn)品帶來持續(xù)污染。 空氣環(huán)境、接觸面、半成品及終產(chǎn)品中的優(yōu)勢菌具有一致性，原料微粉、空氣環(huán)境及閃蒸管道可能為芽孢菌的主要來源。3小結(jié)與討論從魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品中分離得到 32株菌，其中 29 株屬于芽孢菌屬，芽孢菌屬為魔芋膳食纖維固體飲料菌相優(yōu)勢菌。 從生產(chǎn)環(huán)境中亦分離到大量的芽孢菌， 魔芋膳食纖維生產(chǎn)工藝中需用乙醇對魔芋精粉進(jìn)行純化，乙醇可使細(xì)菌蛋白凝固從而對大多數(shù)細(xì)菌具有較強(qiáng)的殺滅作用， 同時生產(chǎn)工藝中涉及高溫真空干燥過程，可殺滅大多數(shù)細(xì)菌，但部分芽孢可耐受高溫不被殺死。因此，本試驗得出的宜昌地區(qū)魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品菌相構(gòu)成主要為芽孢菌屬，與產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及環(huán)境有一定的關(guān)聯(lián)性。由于魔芋膳食纖維固體飲料生產(chǎn)過程中經(jīng)過洗粉、高溫真空干燥等工藝，菌落總數(shù)會大大降低。 但芽孢菌屬對惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)的抗性， 芽孢可在環(huán)境中長期存活9，較難清除，部分條件致病芽孢菌數(shù)量達(dá)到一定限值后會對人體造成一定損害， 本試驗排除所用材料中存在蠟樣芽孢的可能， 但空氣及管道中芽孢菌的長期積累依然可能造成產(chǎn)品衛(wèi)生指標(biāo)不合格，企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對芽孢菌的控制，由于粉塵及空氣可能為污染的主要來源， 建議企業(yè)各工序之間采取全封閉管道生產(chǎn)，可有效降低產(chǎn)品污染。本試驗從產(chǎn)品中所分離菌株未能鑒定到種，需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，確認(rèn)其危害性，同時需采取其他技術(shù)手段10，11分析加工過程中各環(huán)節(jié)的微生物種群多樣性，比較各環(huán)節(jié)菌群的差異，對比各環(huán)節(jié)分離菌株的一致性，進(jìn)一步確認(rèn)產(chǎn)品芽孢菌污染主要來源，以便更好地指導(dǎo)企業(yè)對環(huán)境及工藝進(jìn)行改造。參考文獻(xiàn)：1 鐘 燕，索化夷魔芋葡甘聚糖的功能及在食品領(lǐng)域的應(yīng)用J中國釀造，2014，33（8）：692 廖 鑫巴氏鮮奶中優(yōu)勢腐敗微生物的菌相分析與生長預(yù)測模型的研究D武漢：武漢工業(yè)學(xué)院，20113 GBT 162932010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法S4 GBT 162942010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法S5 GB 159822012，醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)WS3672012醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范S6 孫承鋒，南慶賢，牛天貴醬牛肉中腐敗細(xì)菌的分離與鑒定J中國食品學(xué)報，2001，1（1）：56607 劉勤華，黃 明，潘潤淑，等真空包裝醬牛肉中腐敗細(xì)菌的分離、初步鑒定與菌相變化分析J食品科學(xué)，2009，30（23）：2973008 傅 鵬，李平蘭冷卻豬肉初始菌相分析與冷藏過程中的菌相變化規(guī)律研究J食品科學(xué)，2006，27（11）：1191249 李興佳，王玉英，柴艷兵，等嬰幼兒配方奶粉中的菌相分析J食品科技，2015，40（9）：28929310 董 洋真空包裝鹽水鵝菌相變化規(guī)律及貨架期預(yù)測研究D南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，201111 馬含笑，李 春，周曉宏，等真空包裝醬豬肝中污染微生物的分離鑒定和抑菌研究J食品研究與開發(fā)，2012，33（8）：204210劉 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