番茄褪綠病毒在湖南省首次發(fā)生王雪忠1，2張戰(zhàn)泓3鄭立敏2唐 鑫2史曉斌2劉 勇1，2 *（1湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；2湖南省植物保護研究所，湖南長沙 410125； 3湖南省蔬菜研究所，湖南長沙 410125）摘 要：2016 年 7 月在湖南省蔬菜病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，4 種茄科蔬菜表現(xiàn)出葉脈間褪綠、葉片黃化等癥狀，疑似被番茄褪綠病毒（ Tomato chlorosis virus，ToCV）感染，同時葉片背面聚集了大量煙粉虱。采用 ToCV 熱激蛋白（heat shockprotein70，HSP70）序列的特異性引物對采集的番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯樣品和煙粉虱樣品進行 RT-PCR 檢測，均擴增出目標(biāo)條帶，且擴增序列與北京番茄 ToCV 分離物（KC887999.1）部分序列相似度為 99.0%，確認采集樣品被 ToCV 感染。4 種茄科蔬菜ToCV 的感染率達 70%100%；發(fā)病葉片上煙粉虱的帶毒率為 66.7%87.5%；鑒定出煙粉虱的生物類型為 MED 煙粉虱。這是湖南省首次確認該病毒，需要引起關(guān)注和加強防范。關(guān)鍵詞：番茄褪綠病毒；茄科蔬菜；煙粉虱等 6 個 科 植 物（Wintermantel &Wisler，2006；Landeo-Ríos etal.，2015），其 中對番茄造成的產(chǎn)量損失最為顯著。ToCV 只能通過韌皮部侵染的方式侵染植物，由媒介昆蟲以半持久的方式傳播，其媒介昆蟲包括煙粉虱（ Bemisia tabaci）、溫室白粉虱（ Trialeurodes vaporariorum）、銀葉粉虱（ B. argentifolii）和紋翅粉虱（ T. abutilonea），其中以煙粉虱的傳播能力最為高效（Wintermantel &Wisler，2006）。目前國內(nèi)外暫未獲得ToCV的抗性番茄品種（Orfanidou etal.，2016） ，又因媒介昆蟲反復(fù)發(fā)生，雜草清理具有難度，導(dǎo)致 ToCV 防治存在困難。2016 年 7 月對湖南省蔬菜研究所基地進行病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯的葉片出現(xiàn)褪綠黃化、葉脈仍然保持綠色等疑似 ToCV 感染的癥狀，同時在病葉上發(fā)現(xiàn)了大量的煙粉虱。故分別采集癥狀明顯的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片樣品，利用 ToCV 特異性引物進行分子鑒定，并檢測發(fā)病植株上煙粉虱攜帶 ToCV 的帶毒率以及煙粉虱的生物類型。1 材料與方法1.1 樣本采集在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染 ToCV的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株葉片各 20 份，王雪忠，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病毒與昆蟲互作，E-mail：1401163317qq.com* 通訊作者（Corresponding author）： 劉勇，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜病毒病防治，E-mail：haoasliu163.com收稿日期：2018-05-09；接受日期：2018-07-11基金項目 ： 國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 項 目（31571981，31571982，31672003），湖南省科技計劃項目（2016RS2019）番茄褪綠病毒（ Tomato chlorosis virus，ToCV）屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（ Crinivirus），于 1998 年在美國佛羅里達州首次發(fā)現(xiàn)（Wisler etal.，1998）。截 至目前，ToCV 已在我國臺灣、北京、山東、天津、河北和河南等地發(fā)生流行，對各地番茄生產(chǎn)造成了嚴重影響（Tsai etal.，2004；Zhao etal.，2013；劉永 光 等，2014；周濤 等，2014；胡京 昂 等，2015；孫國 珍 等，2015）。ToCV 侵染的典型癥狀是植株下部葉片先觀察到葉脈間黃化褪綠。發(fā)病初期葉片除葉脈仍保持綠色外，脈間變黃，葉片變厚；發(fā)病中期，整個葉片由邊緣向內(nèi)開始出現(xiàn)壞死斑；發(fā)病后期，整個植株死亡，果實受到嚴重影響（趙黎明，2015）。早期感染 ToCV 的番茄產(chǎn)量損失可達到 75%，甚至絕產(chǎn)；中后期感染 ToCV 仍會對番茄造成 10%40%的產(chǎn)量損失（劉永光 等，2 014）。該病毒的寄主主要有茄科（Solanaceae）和夾竹桃科（Apocynaceae） 27新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2018（8）：27 -31以健康番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片作為陰性對照；以實驗室 ToCV 侵染性克隆接種的感病葉片作為陽性對照。采集基地內(nèi)發(fā)病番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株上的煙粉虱，每種植株采集約 100 頭煙粉虱成蟲。將樣品置于液氮中速凍，-80 保存?zhèn)溆谩?.2 試驗試劑TRIzol、氯 仿、無水乙醇、ddH2O、RNase-free H2O、限制性核酸內(nèi)切酶（ AseI酶）、 樹脂溶液（10 mg·mL-1）。1.3 植物總 RNA 的提取樣品總 RNA 的提取采用北京華越洋生物公司多酚多糖植物 RNA 提取試劑盒，步驟依照試劑盒說明書操作。1.4 煙粉虱總 RNA 的提取煙粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修改。研磨棒充分研磨蟲體后加入1 mLTRIzol振蕩 15 s， 室 溫 放 置 4 min； 加 入 200L 氯 仿，漩 渦振蕩 30 s，室溫 放置 3 min；4 下 12 000r·min-1離心 15 min；移取 上清液 500 L 至新的 RNasefree離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 放置 30min；4 下 12 000r·min-1離心10 min；棄上清液，用現(xiàn)配的75%乙醇 洗滌沉淀，8 000r·min-1離心 3 min；重復(fù)洗 滌 1 次；棄上清液，8 000r·min-1離心 30 s，小心吸出上清液 ；室溫晾干3 min，取30 L RNase-freeH2O溶解，測定OD260/OD280值， 檢測RNA的含量和純度，-80 保存?zhèn)溆?。試驗?復(fù)3次。1.5 cDNA 的合成以提取的總 RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系步驟參照 Vazyme 生物公司 Hiscript 1stStrandcDNASynthesisKit 產(chǎn)品 說明書進行：在 RNase free離心管 中分別加入 1 L RNase-freeH2O，4 L Radomhexamers，3 L 總 RNA；65 加熱 5 min，迅速置于冰上驟冷，并在冰上靜置 2 min；向上一步混合液中加入 10 L 2×RT Mix，2 L Hiscript EnzymeMix；混勻 后按照 25 5min，50 15min，85 5min 合成 cDNA，-20 保存?zhèn)溆谩?.6 RT-PCR 和電泳檢測ToCV 的 檢測采用 ToCV 特異性引物 ToCV-3（表 1）進行 PCR 擴增。PCR 擴增體系為：ddH2O7L，2×Taq MasterMix（Dye Plus）10 L，ToCV-3R1L（10 mol· L-1），ToCV-3F 1L（10 mol·L-1），cDNA 模板 1 L。PCR 程序 為：95 5min；95 30s，56 30s，72 1min，35個循環(huán)；72 延伸 10 min，4 保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果，產(chǎn)物純化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。表 1 引物信息引物名稱 引物序列（5-3）ToCV-3 F：AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTCR：GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGTWT F：CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTTR：CCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC1.7 煙粉虱帶毒率的檢測從每種植株上采集的煙粉虱中隨機選取 8 頭，采用 ToCV 特異性引物 ToCV-3（表 1）進行 ToCV檢測，每種植株 3 次重復(fù)，統(tǒng)計煙粉虱的帶毒率。煙粉虱帶毒率 =攜帶 To CV 的煙粉虱數(shù)目 / 檢測煙粉虱數(shù)目 ×100%1.8 煙粉虱生物類型的鑒定煙粉虱總 DNA 的提?。喝?3 L 蛋白酶 K 于封口膜上，將每只煙粉虱置于其中研磨成勻漿后移至 PCR 管中，加入 20 L 10mg·mL-1的樹脂溶液混勻，然后置于 37 孵育 1 h，96 10min。PCR 擴 增 體 系 為 20 L：2×Taq MasterMix10L，上、下 游引物 WT（表 1）各 1 L（10 mol·L-1），模板 1 L，ddH2O7L。PCR 程序：95預(yù)變性 5 min；95 15s，53 45s，72 1min，35 個循 環(huán)；72 10min，PCR 產(chǎn)物 取 5 L進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。酶切體系：加入 AseI0.5L，3.1×buffer 2L，ddH2O7.5L，與 10 L 擴增 產(chǎn)物混勻后置于 37 34 h，酶切后取 5 L 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從每種植株上采集的煙粉虱中隨機選取 20 頭進行檢測，試驗重復(fù) 3 次。2 結(jié)果與分析2.1 茄科蔬菜田間感染 ToCV 的癥狀與健康植株相比，田間番茄、茄子、辣椒、 28新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES馬鈴薯病株的葉片表現(xiàn)出底部葉片黃化，葉脈濃綠而脈間褪綠黃化，葉片變脆且易折。感病嚴重的植株整株褪綠黃化、果實不能正常膨大，顏色偏白；葉片脈間褪綠黃化，變厚、變脆且易折（圖 1）。2.2 茄科蔬菜 ToCV 的發(fā)生率對4種茄科蔬菜上疑似感染ToCV的樣品進行 RT-PCR 檢測，擴增出條帶大小為 449bp 的特異性條帶，與目標(biāo)條帶一致（圖 2）。對目標(biāo)條帶純化回收測序后在 NCBI 上進行比對，結(jié)果顯示與北京番茄 ToCV 分離物（KC887999.1）部分序列相似度達到99.0，表明所擴增到的基因片段屬于ToCV的基因序列，確認此次采集的樣品被ToCV感染。檢出率結(jié)果顯示，番茄樣品的 ToCV 感染率為 100%，茄子、辣椒和馬鈴薯樣品的感染率分別為 80%、85%和 70%（圖 2）。2.3 煙粉虱體內(nèi) ToCV 的帶毒率檢測收集病葉上的煙粉虱，并進行ToCV的RT-PCR 檢測，PCR 擴增得到條帶大小為 446bp 的特異性條帶，與目標(biāo)片段大小一致（圖 3）。從采集的煙粉虱中，每種植株隨機選取 8 頭進行 ToCV 帶毒率檢測（表 2），番茄上煙粉虱 ToCV 的平均感染率最高，為 87.5%，其次為茄子和馬鈴薯，辣椒上煙粉虱 ToCV 的平均感染率最低。圖 1 4 種茄科作物感染 ToCV 的癥狀A(yù)，感病番茄；B，感病辣椒；C，感病馬鈴薯；D，感病茄子；E，健康番茄；F，健康辣椒；G，健康馬鈴薯；H，健康茄子。彩色圖版見中國蔬菜網(wǎng)站：www.cnveg.org。圖 2 4 種茄科蔬菜 ToCV PCR 檢測結(jié)果M，DNAmarker；120，樣品；A，番茄；B，茄子；C，馬鈴薯；D，辣椒；CK，陰性對照；P，陽性對照。2.4 煙粉虱生物類型鑒定對 4 種茄科蔬菜上采集的煙粉虱進行生物種群鑒定，提取單頭煙粉虱總 DNA 并進行 PCR 擴增，A B C DE F G H圖 3 煙粉虱體內(nèi) ToCV PCR 檢測結(jié)果 M，DNAmarker；12，番茄上煙粉虱樣品；34，茄子上煙粉虱樣品；56，辣椒上煙粉虱樣品；79，馬鈴薯上煙粉虱樣品；CK，陰性對照；P，陽性對照。100bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CK P5000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 CKP500bp500bp500bp500bpABCD29新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控研究論文中國蔬菜CHINAVEGETABLES產(chǎn)物經(jīng) AseI 消化酶切電泳（圖 4），結(jié)果顯示該基地?zé)煼凼鶠?MED 煙粉虱（Q 煙粉虱）。3 結(jié)論與討論本試驗采集了湖南省蔬菜研究所基地 4 種茄科蔬菜植株葉片，利用 RT-PCR 方法檢測疑似發(fā)病植株葉片感染 ToCV 的情況，經(jīng)序列分析比對，確認了 ToCV 已經(jīng)侵染湖南省的茄科作物，證實該病毒已經(jīng)在湖南省發(fā)生。近年來，ToCV 對我國以番茄為主的蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)造成了重大損失，目前針對ToCV 的研究工作主要在其分布、田間診斷和優(yōu)化檢測技術(shù)、致病機理、病蟲互作等方面展開。2004 年 Tsai 等（2004）在我國臺灣首次發(fā)現(xiàn)ToCV，隨后 Zhao 等（2013）報道了 ToCV 在北京的發(fā)生，劉永光等（2014）發(fā)現(xiàn) ToCV 在山東暴發(fā)，目前 ToCV 已在天津（高利利 等，2015） 、河北（孫國珍 等，2015）、河 南（胡京昂 等，2015）、山西、 陜西、浙江、內(nèi)蒙古（鄭慧新 等，2016）、吉林、 遼寧（王翠琳 等，2017）、廣 東（湯亞飛 等，2017）、海南（Tang etal.，2017） 、云南（劉微 等，2018）等地相繼被發(fā)現(xiàn)。近年來國際貿(mào)易的頻繁交流，工廠化苗木調(diào)運可能使感染 ToCV 的植株進入我國，加之煙粉虱在我國擴散流行，這些原因使得ToCV 在我國自沿海向內(nèi)陸迅速蔓延。湖南省周邊省市中目前只有廣東省已經(jīng)報道了 ToCV 的發(fā)生，由于湖南省蔬菜種植種類眾多，苗木調(diào)運繁雜，這些原因都使得調(diào)查 ToCV 病毒最初來源的工作巨大且復(fù)雜，因此需要進一步分離純化和鑒定分離物的病毒株系，對比確認其株系來源，從而精準地對ToCV 進行防控，同時應(yīng)通過加強對煙粉虱的檢疫檢驗，減少人為因素造成煙粉虱的傳播。在我國 ToCV 主要依靠煙粉虱進行傳播。2003年首次在云南省一品紅（ Euphorbia pulcherrima）上發(fā)現(xiàn) MED 煙粉虱以來（Chu etal.，2006），MED煙粉虱現(xiàn)已遍布全國。目前的研究顯示 ，與其他煙粉虱相比，MED 煙粉虱具有分布廣泛、擴散能力強、繁殖率高、抗藥性強且廣的特點。同時，在我國的大多數(shù)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，MED 煙粉虱已經(jīng)快速取代 MEAM1 煙 粉 虱（Chu etal.，2010；Xi，2010；Xinetal.，2016）。已 有研究表明，MED 煙粉虱比MEAM1 煙粉虱傳播 ToCV 的能力更強（Shi etal.，2017）。因此，應(yīng)正確識別煙粉虱的生物類型，從而采取正確措施對煙粉虱進行防治，以達到治蟲防病的目的。本試驗中煙粉虱 ToCV 的帶毒率較高，但由于本試驗采集的樣本數(shù)量較少，后期應(yīng)擴大煙粉虱采集數(shù)量，加強對煙粉虱攜帶 ToCV 的監(jiān)測。目前 ToCV 的防治仍以預(yù)防為主，可以通過選用無病蟲害的幼苗、培育 ToCV 抗性新品種、田間設(shè)置防蟲網(wǎng)、懸掛粘蟲板、合理換茬，達到早預(yù)防、早控制的效果。目前 ToCV 的發(fā)生和流行情況日趨嚴重，本試驗首次報道 ToCV 在湖南省的發(fā)生，表明 ToCV 有從沿海向內(nèi)陸擴散的趨勢，因此必須提高警惕防止 ToCV 的進一步蔓延，同時要加強對煙粉虱 -ToCV- 植物互作的研究，為 ToCV 的防治和治理奠定理論基礎(chǔ)。參考文獻高利利，孫國珍，王勇，高葦，張春祥，張安勝，竺曉平2015天津地區(qū)番茄褪綠病毒的分子檢測和鑒定華北農(nóng)學(xué)報，30（3）：211-215胡京昂，萬秀娟，李自娟，黃文，李武高，應(yīng)芳卿2015河南番茄褪綠病毒的分子鑒定中國蔬菜，（12）：25-28劉微，史曉斌，唐鑫，張宇，張德詠，周序國，劉勇2018云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定 園藝學(xué)報，45（3）：552-560劉永 光，魏家鵬，喬寧，李美芹，劉曉明，竺曉平2014番茄褪綠病毒在山東暴發(fā)及其防治措施中國蔬菜，（5）：67-69孫國珍，高利利，陸文利，王勇，張安勝，竺曉平2015河北省設(shè)施番茄褪綠病毒分子檢測和鑒定研究北方園藝，（9）：95-98圖 4 煙粉虱生物類型鑒定結(jié)果M，DNA marker；120，單頭煙粉虱樣品。表 2 4 種茄科蔬菜上煙粉虱帶毒率統(tǒng)計宿主植物 平均帶毒煙粉虱數(shù)目 平均感染率/%番茄 7.0 87.5茄子 6.7 83.3辣椒 5.3 66.7馬鈴薯 6.7 83.3M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 205000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp 30新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES湯亞飛，何自福，佘小漫，藍國兵2017侵染廣東番茄的番茄褪綠病毒分子鑒定 植物保護，43（2）：133-137王翠琳 ，馮佳，孫曉輝，王少立，趙靜，劉金亮，竺曉平2017北方四省區(qū)番茄褪綠病毒的分子鑒定 植物保護，4 3（2）：141-145趙黎明2015番茄褪綠病毒的分子鑒定、全基因組序列分析及檢測技術(shù)的建立碩士論文泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭慧新，夏吉星，周小毛，張友軍2016警惕煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒病在我國快速擴散 中國蔬菜，（4） ：22-26周濤，楊普云，趙汝娜，師迎春，原鍇，范在豐2014警惕番茄褪綠病毒在我國的傳播和危害植物保護，（5）：196-199ChuD，Zhang YJ，Brown JK，Cong B，Xu BY，Wu QJ，Zhu GR2006The introductionoftheexoticQbiotypeofBemisia tabacifromtheMediterraneanregionintoChinaonornamentalcropsFloridaEntomologist，89（2）：168-174ChuD，Wan FH，Zhang YJ，Brown JK2010Change inthebiotypecompositionofBemisia tabaciinShandongprovinceofChinafrom2005to2008Envi ronmentalEntomology，39（3）：1028-1036Landeo-Ríos YM，Nav as-CastilloJ，Mori onesE，Ca nullizaresMC2015Genetic diversityandsilencingsuppressionactivityofthep22proteinofTomato chlorosis virus，is olatesfromtomatoandsweetpepperVirus Genes，51（2）：283-289OrfanidouC，Pappi PG，Efthimiou KE，Katis N，Maliogka VI2016Transmission ofTomato chlorosis virus（ToCV）by Bemisia tabacibiotypeQandevaluationoffourweedspeciesasviralsources PlantDisease，100（10）：10.1094/PDIS-01-16-0054-REShiX，Tang X，Zhang X，Zhang DY，Li 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suitabilityofbiotypesQandBofBemisia tabaci（ Gennadius）（ Hemiptera：Aleyrodidae）at differentnymphalinstarsashostsforEncarsia formosa Gahan（ Hymenoptera： Aphelinidae）Peerj，4（4）：e1863ZhaoRN，Wang R，Wang N，F(xiàn)an ZF，Zhou T，Shi YC，Zho uT2013First reportofTomato chlorosis virusinChinaPlant Disease，97（8）：1123First Report of the Occurance of Tomato chlorosis virus in Hunan ProvinceWANGXue-zhong1，2，ZHANG Zhan-hong3，ZHENG Li-min2，TANG Xin2，SHI Xiao-bin2，LIU Yong1，2*（1 Subcollege of Longping， Graduate School of Hunan University， Changsha 410125， Hunan， China；2 Plant Protection InstituteofHunan Province， Changsha 410125， Hunan， China；3HunanVegetable Research Institute， Changsha 410125， Hunan， China）Abstract：During theinvestigationforvegetablediseasesofHunanProvinceinJuly2016，symptoms of interveinchlorosisandleafyellowingwerediscoveredonSolanaceaevegetableleaves，including tomato，pepper，eggplantandpotatoplants.ThesymptomsweresuspectedasTomato chlorosis virus（ToCV）and alargenumberofBemisia tabaciwerefoundonthebackofleaves.Theinfectedleavesoftomato，pepper，eggplant andpotatoandBemisia tabacisamplesweredetectedbyRT-PCRusinggenespecificprimersofToCVheatshockprotein70（HSP70）sequence，and anexpectedfragmentwereobtained.Theresultsofsequenceanalysisrevealedthatthefragmentsharedthehighestnucleotideidentityat99.0%withtheisolatesfromBeijing（KC887999.1）. TheinfectionrateofToCVofthese4kindsofSolanaceaevegetableswas70%-100%.ViruliferousrateofBemisia tabaciwas66.7%-87.5%.ThewhiteflybiotypewasMED.ThisisthefirsttimethatHunanProvinceconfirmstheexistingofToCV，which needsspecialattentionandstrongerprevention.Key words： Tomato chlorosis virus；Solanaceae vegetablecrops； Bemisia tabaciPanH，Chu D，Ge D，Wang S，Wu Q，Xie W，Jiao X，Liu B，Yang X，Yang N，Su Q，Xu B，Zhang Y2011Further spreadofanddominationbyBemisia tabaci（ Hemiptera： Aleyrodidae）biotype QonfieldcropsinChinaJournal ofEconomicEntomology，104 （3）：978-985Garcíacano E，Navascastillo J，Moriones E，F(xiàn)ernándezmu ñ ozR2010 ResistancetoTomato chlorosis virusinwildtomatospeciesthatimpairvirusaccumulationanddiseasesymptomexpressionPlantDisease，100（6）：582-592 31新優(yōu)品種栽培管理本期視點產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES