山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2017， 49( 10) : 81 87 Shandong Agricultural SciencesDOI: 1014083/j issn1001 4942201710017收稿 日期 : 2017 02 06基 金 項目 : 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項目 ( 15003)作者簡介 : 馮友仁 ( 1983) ， 男 ， 碩士研究生 ， 助理研究員 ， 研究方向為植物保護及病蟲害生物防治 。E mail: znlfyr126 com新型月季葉枯病菌產(chǎn)毒條件及毒素化學(xué)成分分析馮 友 仁 ， 劉寶生 ， 白鵬華( 天津市植物保護研究所 ， 天 津 300384)摘要 : 為深入揭示月季葉枯病菌 ( Pestalotiopsis clavispora) 的致病機理 ， 本試驗研究了其最優(yōu)產(chǎn)毒條件 ， 測定了含毒濾液中蛋白質(zhì)和可溶性糖含量 ， 并借助氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀 ( GC MS) 對月季葉枯病菌所產(chǎn)毒素中的化學(xué)成分進行了分析 。結(jié)果表明 ， 不同產(chǎn)毒條件下病菌產(chǎn)毒能力存在明顯差異 ， 最佳產(chǎn)毒條件是 : pH 7 0的查彼 + 液體培養(yǎng)基 、培養(yǎng)溫度 25、晝夜交替條件 、連續(xù)振蕩 ( 120 r/min) 培養(yǎng) 25 d。含毒濾液的蛋白質(zhì)濃度為 180 g/mL， 可溶性糖含量為 2 05725 g/mL， 主要化學(xué)成分為三氧硅烷 、十甲基環(huán)五硅氧烷 、十二甲基環(huán)六硅氧烷 、1， 4 二甲氧基 6， 7， 8， 9 四氫環(huán)庚酮 、戊二酸 、氨基甲酸甲酯 。關(guān)鍵詞 : 新型月季葉枯病菌 ; 毒素 ; 產(chǎn)毒條件 ; 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀 ; 化學(xué)成分中圖分類號 : S68512 文獻標(biāo)識號 : A 文章編號 : 1001 4942( 2017) 10 0081 07Analysis on Production Condition and ChemicalComposition of Toxin in Pestalotiopsis clavisporaFeng Youren， Liu Baosheng， Bai Penghua( Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin 300384， China)Abstract To deeply reveal the pathogenesis of Pestalotiopsis clavispora， the toxin production conditionswere optimized， the contents of protein and soluble sugar in toxin filtrate were measured， and the toxin chemi-cal compositions were analyzed by GC MS The results showed that the toxin production ability varied signifi-cantly under different conditions The best toxin production conditions were Czapek liquid culture medium withpH value of 70， 25， day alternates with night， continuously shaking for 25 days with the rotational speedof 120 r/min Moreover， the protein content of toxin was 180 g/mL The soluble sugar content of toxin was2 05725 g/mL The chemical compositions of toxin were tripropoxysilane， decamethyl cyclopentasiloxane，dodecamethyl cyclohexasiloxane， 1， 4 dimethoxy 6， 7， 8， 9 tetraheptone， glutarate， methyl carbamateKeywords Pestalotiopsis clavispora; Toxin; Toxin production condition; Gas chromatogram and massspectra; Chemical composition月 季 ( osa chinensis Jacq ) 屬薔薇科薔薇屬 ，原產(chǎn)于中國 ， 因其花朵碩大 、花瓣鮮艷闊厚 、花香清新醉人而深受人們喜愛 ， 被我國多個城市定義為市花 1， 在 城 市園林綠化中被廣泛應(yīng)用 。但在種植生長過程中 ， 易受到病蟲危害 ， 出現(xiàn)生長不良 、掉葉 、萎蔫 、甚至死亡的現(xiàn)象 ， 既影響觀賞效果 ， 又降低了月季本身的經(jīng)濟價值 2。2013 年在天津市新 發(fā)現(xiàn)的月季葉枯病 3， 于2014 年 56 月 在 天津市西青區(qū)某大型花圃全面爆發(fā) ， 發(fā)病率達到 60% 以上 ， 引起了月季栽培人員和園林部門的高度重視 。新型月季葉枯病是由半知菌類黑盤孢目黑盤孢科暗色多孢族盤多毛孢屬棒狀擬盤多毛孢 Pestalotiopsis clavispora( Arth )Stey 引起的真菌性病害 。病害多發(fā)自月季基部葉 片 ， 造 成老熟葉片嚴(yán)重脫落 。由于該病害在天津地區(qū)屬新型病害 ， 有效的防治策略及方法尚不成熟 ， 因此該病害在天津地區(qū)有逐年加重趨勢 4。毒 素 是指由植物病原菌代謝產(chǎn)生的 、在生理濃度范圍內(nèi)即可干擾植物正常生理功能 、對植物有毒害作用的非酶類化合物 5。前 人 研究表明 ，不同培養(yǎng)基成分對病原菌產(chǎn)毒影響顯著 ， 培養(yǎng)時間 、培養(yǎng)溫度 、培養(yǎng)液酸堿度 、光照條件等也會造成病原菌產(chǎn)毒能力出現(xiàn)差異 6。擬 盤 多毛孢菌分泌的毒素是導(dǎo)致病害發(fā)生及給寄主植物造成傷害的關(guān)鍵影響因子 7， 而有關(guān)新型月季葉枯病菌毒 素 的產(chǎn)生條件國內(nèi)外均鮮見報道 ， 因此明確月季葉枯病菌分泌毒素的條件以及鑒定其毒素組分的結(jié)構(gòu) ， 可為深入揭示該病害的致病機理 、篩選新型殺菌劑以及制定新的防治方法提供理論依據(jù) 。1 材 料 與方法11 供 試 菌株由天津市植物保護研究所林木病蟲研究室經(jīng)分離 、純化 、鑒定后保藏的菌種 ， 并進行了致病性測定 。12 培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選121 生物活性測定方法 將含毒原液用無菌水稀釋為原濃度的 10%、20%、33 3%、50%、100%5 個濃度 ， 采用葉圓片浸漬法進行生物活性測定 。接毒后的葉片置于 25 培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng) ( 12 h/12 h 晝夜更替 ) ， 連續(xù)觀察 7 d 并記錄結(jié)果 。葉圓片浸漬法 : 分別吸取不同濃度的毒素溶液 2 mL 于培養(yǎng)皿中 ( 含濾紙 ) ; 取月季植株一定部位的葉片 ， 用清水沖洗干凈 ， 先用 70% 酒精表面消毒 ， 再用無菌水漂洗 3 次 ， 用滅菌濾紙吸干表面水分 ， 用直徑為 8 mm 的圓形打孔器打取葉圓片 ， 均腹面向下平放在培養(yǎng)皿中 ( 每皿 6 片 ) ， 用保 鮮袋封裝好 ， 以滅菌的純水為對照 ， 重復(fù) 3 次 。122 培養(yǎng)液種類 在無菌條件下 ， 分別采用PD 培養(yǎng)液 、PS 培養(yǎng)液 、月季葉煎汁蔗糖培養(yǎng)液( SB) 、月季葉煎汁馬鈴薯培養(yǎng)液 ( PB) 、查彼 +培養(yǎng)液對供試菌株進行培養(yǎng) ， 置于 25 搖床中 ，連續(xù)振蕩 ( 120 r/min) 暗培養(yǎng) 25 d， 重復(fù) 3 次 。用葉圓片浸漬法進行毒素的生物活性測定 ( 下同 ) 。123 培養(yǎng)時間 在無菌 、25條件下 ， 將接菌的 pH 70 的 PD 培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速 120 r/min 恒溫振蕩條件下分別暗培養(yǎng) 10、15、20、25、30 d， 重復(fù) 3次 。124 培養(yǎng)溫度 在無菌條件下 ， 將接菌的 pH7 0 的 PD 培養(yǎng)液分別在 10、15、20、25、30下 ， 轉(zhuǎn)速 120 r/min 恒溫振蕩暗培養(yǎng) 25 d， 重復(fù) 3 次 。125 通氣量 在無菌 、25條件下 ， 將接菌的pH 70 的 PD 培養(yǎng)液分別在以下 3 種方式暗培養(yǎng)25 d。靜置培養(yǎng) : 每天振蕩 0 5 h; 間歇振蕩培養(yǎng) : 每天振蕩 12 h; 連續(xù)振蕩培養(yǎng) : 全天振蕩 24 h。轉(zhuǎn)速均為 120 r/min， 重復(fù) 3 次 。126 光照條件 在無菌 、25條件下 ， 將接菌的 pH 70 的 PD 培養(yǎng)液分別置于全光照 、晝夜自然交替 、全黑 3 種條件下 ， 轉(zhuǎn)速 120 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng) 25 d， 重復(fù) 3 次 。13 月季葉枯病菌粗毒素的提取與化學(xué)性質(zhì)初步分析13 1 毒素溶液的制備 用直徑為 5 mm 的圓形打孔器在活化過的病原菌菌落邊緣打菌絲塊 ，接入裝有 100 mL PD 培養(yǎng)液的三角瓶中 ， 每瓶接4 個菌塊 。置于 25恒溫 、轉(zhuǎn)速為 120 r/min 的搖床中暗培養(yǎng) 14 d 后 ， 將培養(yǎng)的菌液先用雙層紗布濾去菌絲 ， 經(jīng)布氏漏斗 ( 含 2 層濾紙 ) 抽濾 ， 濾液于低溫冷凍離心 ( 5 000 r/min) 18 min， 上清液即為無菌絲的含毒濾液 。在 45 低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為原體積的 1/10， 于 5 000 r/min 下離心 18 min， 取上清液 ， 即為毒素原液 8。132 試 驗 試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 : 稱取 10 mg 牛血清蛋白 ， 溶于純水中 ， 用 100 mL 容量瓶定容至刻度 ， 即為 100g/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 ?？捡R斯亮藍溶液 : 精確稱取 1000 mg 考馬斯亮藍 G 250 溶解于 50 mL 95% 乙醇溶液中 ，加入 100 mL 85%的磷酸 ， 用純水定容到 1 L， 貯于棕色瓶中 。蒽酮乙酸乙酯試劑 : 取 1 g 分析純蒽酮 ， 溶于 50 mL 乙酸乙酯中 ， 貯于棕色瓶中 ， 放置在黑暗中 。1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液 : 取適量蔗糖于 80 烘箱28 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 第 49 卷烘 至 恒重 ， 先精確稱取 1 00 g 溶解于少量的純水 ， 再轉(zhuǎn)入 100 mL 的容量瓶中 ( 內(nèi)含 0 5 mL 濃硫酸 ) ， 最后用純水定容至 100 mL。100 g/mL 蔗 糖 標(biāo)準(zhǔn)液 : 取 1 mL 1% 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液于 100 mL 容量瓶中 ， 加純水稀釋至 100mL。133 蛋白質(zhì)濃度測定 考馬斯亮藍法測定含毒濾液的蛋白質(zhì)濃度 10。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 。取 6 支 試 管并編號 ， 按表 1 所示分別加入 100 g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和純水 。搖勻后 ， 各試管中都加入考馬斯亮藍 G 250溶液 5 mL， 將試管搖勻 ， 放置 5 min， 用紫外分光光度計比色測定吸光值 A595 nm。以 A595 nm為 縱 坐標(biāo) 、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo) ， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。表 1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑加入量試劑試管 編號1 2 3 4 5 6標(biāo) 準(zhǔn) 蛋白質(zhì) ( mL) 0 02 04 06 08 10純水 ( mL) 10 08 06 04 02 0蛋白質(zhì)含量 ( g) 0 20 40 60 80 100樣 品 的測定及計算 。吸取含毒濾液 0 2mL、純水 0 8 mL 于試管中 ， 再加入考馬斯亮藍G 250溶液 5 mL， 充分搖勻后 ， 放置 5 min， 在 595nm 下比色 ， 測定吸光值 A595 nm， 并 通 過對照標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量 。重復(fù) 3 次 。計算公式 : 樣品的蛋白質(zhì)濃度 ( g/mL) = 蛋白量 x( g) /02 mL。134 可溶性糖含量測定 蒽酮比色法測定含毒濾液中可溶性糖含量 。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 。取6 支試管并編號 ， 按表 2 中的順序依次加入試劑 ，搖勻后立即放入沸水浴中 1 min， 取出后自然冷卻 ，在 630 nm 下比色 ， 測定吸光值 A630 nm， 重 復(fù) 3 次 ， 以吸 光值 A630 nm為 縱 坐標(biāo) 、反應(yīng)蔗糖量 ( g) 為橫坐標(biāo) ， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。表 2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑加入量試 劑試 管 編號1 2 3 4 5 6100 g/mL 蔗糖 ( mL) 0 02 04 06 08 10純 水 ( mL) 20 18 16 14 12 10蒽酮乙酸乙酯試劑 ( mL) 05 05 05 05 05 05濃硫酸 ( mL) 5 5 5 5 5 5蔗糖 ( g) 0 20 40 60 80 100 樣品的測定及計算 。將月季葉枯病菌含毒 濾 液稀釋 5 倍 。在試管中依次加入稀釋后的毒素溶液 0 2 mL、純水 1 8 mL、蒽酮乙酸乙酯試劑05 mL、濃硫酸 5 mL， 立即放入沸水浴中 1 min，取出后自然冷卻 。在 630 nm 下比色 ， 測得吸光值 ， 并將平均值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出毒素濾液反應(yīng)蔗糖量 。重復(fù) 3 次 。計算公式 : 樣品的可溶性糖濃度 ( g/mL) =稀釋倍數(shù) × 可溶性糖 x( g) /02 mL。14 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法測定含毒濾液原液的化學(xué)成分采用安捷倫 7890A 氣相色譜 ， HP 5 石英毛細管柱 ( 30 m ×032 mm ×025 m) ; 程序升溫 :40 保持 1 min， 8 /min 升到 160， 再以 12 /min升到 250， 后運行 280 1 min; 柱流量 :10 mL/min; 進樣口溫度 : 250; 柱前壓 : 100kPa; 進樣量 : 1 L; 分流比 20 1; 載氣 : 高純99999%氦氣 。采用安捷倫 7200 型氣相色譜 /四極桿飛行時間質(zhì)譜儀 ， 電離源 : EI; 掃描質(zhì)量范圍 :50 700 m/z; 氣質(zhì)接口溫度 : 280; 離子源溫度 :230; 采用 NIST11 標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性 11。2 結(jié) 果 與分析21 毒素生物活性測定211 月 季 葉枯病菌毒素對葉圓片的影響 采用葉圓片浸漬法 9測定不同稀釋倍數(shù)的毒素溶液對月季離體葉片的影響 。月季葉圓片經(jīng)過不同濃 度 的毒素處理 ， 1 d 后邊緣均出現(xiàn)褪綠斑 ， 1 倍與 2 倍稀釋液出現(xiàn)褪綠斑的葉圓片數(shù)量增多 ， 褪綠斑不斷擴大 ， 顏色也相對不斷加深 。4 d 后所有葉圓片全部出現(xiàn)褪綠斑 ， 并且大部分完全變?yōu)楹诤稚?; 3 倍稀釋液的褪綠斑約為葉圓片面積1/2。5 倍釋液處理 7 d 后 ， 褪綠斑大約為葉圓片面積的 1/5; 10 倍稀釋液處理 7 d 后 ， 大部分葉圓片基本無明顯變化 ( 圖 1) 。212 月季葉枯病菌毒素對針刺離體葉片的影響 月季葉片經(jīng)過不同濃度的針刺 ， 1 d 后無明顯效果 ， 2 d 后 1 倍與 2 倍稀釋液處理下 ， 針刺部位出現(xiàn)明顯的褪綠斑 ， 3 d 后 5 倍稀釋液開始出現(xiàn)褪綠斑 ， 6 d 后 10 倍稀釋液處理開始出現(xiàn)褪綠斑 ，但現(xiàn)象不是很明顯 ， 隨著天數(shù)的增加 ， 病斑并沒有明顯改變 。38第 10 期 馮友仁 ， 等 : 新型月季葉枯病菌產(chǎn)毒條件及毒素化學(xué)成分分析圖 1 毒素 原液 1 倍和 5 倍稀釋液 7 d 后對月季葉碟的影響22 培 養(yǎng) 條件篩選221 最優(yōu)培養(yǎng)液 由表 3 可以看出 ， 培養(yǎng)液對病原菌產(chǎn)毒有很大的影響 ， 其中以在查彼 + 液體培養(yǎng)液中產(chǎn)毒量最高 ， 出現(xiàn)褪綠病斑的現(xiàn)象最為明顯 ， 其次是 PD 培養(yǎng)液和 PS 培養(yǎng)液 ， 月季葉枯病菌在月季葉煎汁蔗糖培養(yǎng)液中的產(chǎn)毒能力最弱 。表 3 不同培養(yǎng)液對月季葉枯病菌產(chǎn)毒的影響培養(yǎng) 液褪綠斑大小 ( mm)第 3 d 第 7 dPD 450 ±0dC 720 ±035abABPS 563 ±013bB 666 ±038bBCPB 510 ±010cB 573 ±005cCSB 133 ±030eD 423 ±023dD查 彼 + 780 ±056aA 800 ±0aA注 : 經(jīng) Duncans 新 復(fù) 極差法檢驗 ， 同列數(shù)據(jù)中不同小寫字母表示 005 水平上差異顯著 ， 大寫字母表示 001 水平上差異顯著 。222 最 優(yōu) 培養(yǎng)時間 不同培養(yǎng)時間對月季葉枯病菌毒素的產(chǎn)生有很大影響 。圖 2 結(jié)果表明 ，培養(yǎng)時間少于 25 d 毒素各處理對葉圓片褪綠程度隨毒素培養(yǎng)時間增加而加重 ， 說明毒素的產(chǎn)生量隨培養(yǎng)時間的增加而增加 。培養(yǎng) 30 d 的含毒培養(yǎng)液 1 d 就可以使全部葉碟出現(xiàn)褪綠病斑 ， 與培養(yǎng) 25 d 的含毒培養(yǎng)液效果相同 ， 從而推斷 25 d后毒素含量基本保持在 25 d 的水平上 。223 最優(yōu)培養(yǎng)溫度 月季葉枯病菌在試驗設(shè)定的溫度范圍內(nèi)均能產(chǎn)毒 ， 溫度對該菌的產(chǎn)毒能力影響顯著 。培養(yǎng)溫度低于 20時 ， 毒素產(chǎn)量隨溫度的升高而增加 ; 在 25和 30條件下得到的含毒培養(yǎng)液 2 d 后產(chǎn)生褪綠病斑的大小基本相同 。圖 2 不同培養(yǎng)時間對月季葉枯病菌產(chǎn)毒的影響圖 3 不同培養(yǎng)溫度對月季葉枯病菌產(chǎn)毒的影響224 最佳 通氣量 在其他條件一定的情況下 ，全天振蕩培養(yǎng)的產(chǎn)毒量最大 ， 葉碟浸泡 3 d 后平均產(chǎn)生 54 mm 左右的褪綠病斑 ; 間歇振蕩培養(yǎng)的產(chǎn)毒量次之 ， 葉碟浸泡 3 d 后平均產(chǎn)生 4 9 mm左右的褪綠病斑 ; 靜置培養(yǎng)的產(chǎn)毒量最低 ， 葉碟浸泡 3 d 后平均產(chǎn)生 4 7 mm 左右的褪綠病斑 。結(jié)果表明 ， 全天振蕩培養(yǎng)的情況下 ， 月季葉枯病菌產(chǎn)毒能力較強 。225 最優(yōu)光照條件 在其他條件一定的情況48 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 第 49 卷下 ， 自 然 晝夜交替條件下月季葉枯病菌產(chǎn)毒能力最強 ， 含毒培養(yǎng)液 7 d 可造成 5 8 6 5 mm 的褪綠病斑 ; 全黑培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒能力有所下降 ， 含毒培養(yǎng)液 7 d 可造成 4 9 5 9 mm 的褪綠病斑 ; 全光照條件下產(chǎn)毒能力最差 ， 7 d 所造成的褪綠病斑大小為 47 50 mm 左右 。說明 ， 光照對于該菌的產(chǎn)毒積累具有一定程度的抑制作用 ， 自然晝夜交替條件最有利于產(chǎn)毒 。23 月季葉枯病菌含毒濾液中蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的測定231 含毒濾液蛋白質(zhì)含量 經(jīng)測定 ， 月季葉枯病菌毒素的吸光值為 0 657， 根據(jù)圖 4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程求得毒素中蛋白質(zhì)含量為 36g， 代入公式 ( 1) ， 計算出毒素原液中蛋白質(zhì)濃度為 180 g/mL。圖 4 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線232 含毒濾液可溶性糖含量 經(jīng)測 定 ， 月季葉枯病菌毒素 5 倍稀釋液的吸光值平均值為 0581，根據(jù)圖 5 可溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程求得毒素中可溶性糖含量為 82 29 g， 代入公式 ( 2) 求得毒素原液中可溶性糖濃度為 2 05725 g/mL。圖 5 可溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線24 含毒濾液的化學(xué)成分借 助 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法對毒素原液中的主要化學(xué)成分進行分析 ， 采用 NIST11 標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性 ， 檢測出以下 6 種主要化學(xué)成分 ， 分別為三氧硅烷 、十甲基環(huán)五硅氧烷 、十二甲基環(huán)六硅氧烷 、1， 4 二甲氧基 6， 7， 8， 9 四氫環(huán)庚酮 、戊二酸 、氨基甲酸甲酯 ， 每種化學(xué)物質(zhì)的質(zhì)譜圖見圖 6 圖 10。圖 6 月季葉枯病菌毒素原液中三氧硅烷質(zhì)譜圖圖 7 月季葉枯病菌毒素原液中十甲基環(huán)五硅氧烷質(zhì)譜圖圖 8 月季葉枯病菌毒素原液中十二甲基環(huán)六硅氧烷質(zhì)譜圖圖 9 月季葉枯病菌毒素原液中 1， 4 二 甲 氧基 6， 7， 8， 9四氫環(huán)庚酮質(zhì)譜圖58第 10 期 馮 友 仁 ， 等 : 新型月季葉枯病菌產(chǎn)毒條件及毒素化學(xué)成分分析圖 10 月季葉枯病菌毒素原液中戊二酸質(zhì)譜圖圖 11 月季葉枯病菌毒素原液中氨基甲酸甲酯質(zhì)譜圖3 討 論 與結(jié)論本試驗分別采用葉圓片浸漬法和離體葉片針刺 法 對月季葉枯病菌進行生物活性測定 ， 發(fā)現(xiàn)葉圓片浸漬法效果較為顯著 ， 且操作相對簡便 ; 含毒濾液濃度越高 ， 毒素致病力越強 。與于麗娜等 12研究冬棗黑疔病病原菌毒素致病機制及黃秀萍 8研 究 雷公藤角斑病毒素致病機理的結(jié)果相近 ， 均發(fā)現(xiàn)毒素濃度越大 ， 對植物組織的傷害越大 。培養(yǎng)條件對真菌毒素活性影響明顯 ， 不同的培養(yǎng)條件如 : 培養(yǎng)基 、培養(yǎng)溫度 、培養(yǎng)時間 、通氣條件及光照條件等都是影響產(chǎn)毒的重要因素 。前人對致病真菌毒素的培養(yǎng)條件做了大量研究 。李小波等 13研 究 發(fā)現(xiàn)番茄葉霉病菌產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)液為 PS 培養(yǎng)液 ， 高洪敏和陳捷 14發(fā) 現(xiàn) 禾谷鐮孢菌在 ichard 培養(yǎng)基產(chǎn)生毒素的活性最高 ， 彭建華等 15發(fā) 現(xiàn) 橡膠多主棒孢病菌最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基是改良的 Fries3 號培養(yǎng)基 ， 可見不同菌株對培養(yǎng)基存在選擇性 。蔣繼志 16、朱 天 輝 17、潘 陽 18等分別對石楠擬盤多毛孢菌 、暗 孢 節(jié)菱孢菌 、大豆毛口殼葉斑病菌的產(chǎn)毒條件做了研究 ， 均發(fā)現(xiàn)不同病原真菌的最佳產(chǎn)毒條件不盡相同 。本研究發(fā)現(xiàn)月季葉枯病菌產(chǎn)毒條件為 : 最佳培養(yǎng)液查彼 + ， 最佳培養(yǎng)時間 25 d， 最適產(chǎn)毒溫度大約在 25 30之間 ， 通氣量越充足產(chǎn)毒越好 ， 在晝夜交替條件下最有利于產(chǎn)毒 。由于作者之前已研究過該菌的生物學(xué)特性 ， 因此本試驗未對產(chǎn)毒 pH 條件進行研究 。該菌的最佳產(chǎn)毒條件為溫度 25， 與其生物學(xué)特性研究中該菌的最適生長溫度相一致 ， 證明溫度對于新型月季葉枯病的發(fā)病條件有很強的制約性 。當(dāng)溫度達到適宜溫度左右 ， 病害便可以在月季葉片上迅速生長 ， 這也符合 2014 年的田間調(diào)查結(jié)果 ， 即該病害在當(dāng)年的 5 月下旬到 6 月上旬和 9 月中旬前后在天津花圃大規(guī)模爆發(fā) 。對病原菌毒素溶液中蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的初步研究發(fā)現(xiàn) ， 毒素粗提液中可溶性糖含量較高 ， 但后期仍需通過 萘酚反應(yīng) 、班乃德反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)等化學(xué)測定和薄層層析等手段進一步分析確定毒素中所含的具體是哪種或哪幾種多糖 19。氣 相 色譜和質(zhì)譜儀對毒素粗提液的化學(xué)成分的檢測發(fā)現(xiàn) ， 主要有 6 種化學(xué)物質(zhì) ， 分別為三氧硅烷 、十甲基環(huán)五硅氧烷 、十二甲基環(huán)六硅氧烷 、1， 4 二甲氧基 6， 7， 8， 9 四氫環(huán)庚酮 、戊二酸 、氨基甲酸甲酯 。近年來國內(nèi)外從內(nèi)生擬盤多毛孢菌 ( Pestalotiopsis sp ) 中發(fā)現(xiàn)了許多活性代謝產(chǎn)物 ， 其中有些甚至具備抗氧化 、抗高血壓 、抗真菌等生物活性 ， 具有很好的藥用開發(fā)潛質(zhì) 。其代謝產(chǎn)物復(fù)雜多樣 ， 除產(chǎn)生一些常見的化合物如齊墩果酸 、2 羥基 3 苯基丙酸甲酯 、菜油甾醇 、過氧麥角甾醇 、D 阿洛醇 、烏蘇酸 、3 羥基 4 甲氧基苯乙烯 、鄰苯二甲酸二異丁酯 、3， 4 二羥基苯乙醇 、對羥基苯乙醇 20等 ， 還 有 許多結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的代謝產(chǎn)物 ， 但大致可以將這些代謝產(chǎn)物分為萜類 、生物堿類 、異香豆素和香豆素類 、醌類和半醌類 、色酮類和脂類等 21。但 本 研究對象是從月季病葉上分離出來的致病真菌 ， 非月季本身內(nèi)生的擬盤多毛孢菌 ， 因此 ， 本研究發(fā)現(xiàn)的 6 種主要化學(xué)物質(zhì)對于擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分研究是一個很好的補充 。此外 ， 鄭永標(biāo)等 222011 年 從 一株擬盤多毛孢菌 ( Pestalotiop-sis sp ) 的靜置發(fā)酵培養(yǎng)液中通過硅膠和凝膠柱層析法分離和純化化合物 ， 然后借助核磁共振波普分離到一個倍半萜的新化合物和一個已知化合物 4 羥基苯乙醇 。早在 1997 年董金皋和李正平 23就 對 一些病原菌的致病毒素及其可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了總結(jié) ， 但其中并未涉及到由棒狀擬68 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 第 49 卷盤 多 毛孢菌引起的植物病害 ， 因此弄清不同化學(xué)物質(zhì)在對寄主植物毒害作用中所發(fā)揮的不同作用 ， 對今后進一步深入探討棒狀擬盤多毛孢菌毒素的致病機理具有十分重要的意義 。此外毒素對月季生理生化的影響還需深入研究 ， 主要是含毒濾液處理月季葉片后 ， 月季葉片受到脅迫并誘導(dǎo)自身產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性 ， 體現(xiàn)為超氧化物歧化酶 、過氧化物酶等防御酶活性的變化 。真菌毒素的穩(wěn)定性是毒素產(chǎn)生和積累的重要因素 。熱穩(wěn)定性 、酸堿穩(wěn)定性以及耐儲穩(wěn)定性等對于病原真菌毒素的活性都有較大影響 ， 這可能與毒性物質(zhì)的化學(xué)組成有關(guān) 。本研究發(fā)現(xiàn) ， 月季葉枯病菌毒素中可溶性糖含量要比蛋白質(zhì)含量高 ， 因此推測該菌的毒素穩(wěn)定性可能相對比較穩(wěn)定 ， 但具體結(jié)論仍需進一步穩(wěn)定性試驗結(jié)果的支持 。本研究內(nèi)容對于天津市新型月季葉枯病菌發(fā)病規(guī)律和防控措施的制定提供了重要的參考依據(jù) ， 具有重要的理論意義 。隨著月季葉枯病菌致病機理的進一步深入研究 ， 本文涉及的相關(guān)研究內(nèi)容略顯淺顯 ， 仍需后人進一步研究 。參 考 文 獻 : 1 于 紅 革 ， 崔紅 兩類月季病害的防治 J 中國花卉盆景 ，2002( 8) : 32 2 嚴(yán)桂 華 ， 曹萍 月季主要病蟲害及其防治 J 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 ， 2007( 22) : 94 97 3 Feng Y ， Liu B S， Sun B B First report of leaf blotch causedby Pestalotiopsis clavispora on osa chinensis in China J PlantDisease， 2014， 98( 7) : 1009 4 馮友 仁 ， 劉寶生 ， 白鵬華 天津市新型月季葉枯病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究 J 北方園藝 ， 2015( 14) : 125 129 5 許志 剛 普通植物病理學(xué) ( 第三版 ) M 北京 : 中國農(nóng)業(yè)出版社 ， 2003 6 張淑珍 植物病原菌毒素研究進展 J 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) ，2001( 2) : 42 43 7 李 向 彬 ， 蔣繼志 ， 郭會婧 草莓根腐病菌致病物質(zhì)的初步研究 J 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ， 2008， 31( 2) : 42 43 8 黃秀 萍 雷公藤角斑病菌的毒素提取及致病機理的初步研究 D 福州 : 福建農(nóng)林大學(xué) ， 2012 9 朱濤 ， 楊會敏 ， 盧東升 茶樹輪斑病病原菌毒素生物測定方法研究 J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2009， 37( 5) : 1991 1994 10 杜化 仿 ， 張茹琴 ， 夏淑春 ， 等 花生葉腐病菌毒素提取及致病性研究 J 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ( 自然科學(xué)版 ) ， 2011， 28( 2) : 99 102 11 蔣瀟 ， 田 靜 三個產(chǎn)地艾葉揮發(fā)油的化學(xué)成分分析 J 中國民族民間醫(yī)藥 ， 2015， 24( 17) : 19 22 12 于麗 娜 ， 閆紅飛 ， 宗淑萍 ， 等 冬棗黑疔病病原菌毒素致病機制研究 J 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ， 2008， 31( 1) : 33 36 13 李小 波 ， 康立功 ， 路盼 ， 等 番茄葉霉病菌產(chǎn)毒條件研究 J 植物保護 ， 2010， 36( 1) : 83 86 14 高 洪 敏 ， 陳捷 玉米莖腐菌毒素的產(chǎn)生條件和化學(xué)特征的初步研究 J 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ， 1999， 30( 3) : 223 226 15 彭建 華 ， 鄭春耀 ， 潘羨心 ， 等 橡膠樹多主棒孢病菌強致病菌株的篩選及產(chǎn)毒條件優(yōu)化 J 熱帶作物學(xué)報 ， 2009， 30( 4) : 520 524 16 蔣繼 志 ， 李向彬 ， 桂春爽 ， 等 石楠擬盤多毛孢毒素產(chǎn)生條件初探 J 微生物學(xué)通報 ， 2009， 36( 1) : 46 50 17 朱天 輝 ， 李姝江 ， 車冠男 暗孢節(jié)菱孢菌蛋白類毒素產(chǎn)生條件研究 J 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ， 2011， 29( 4) : 518 523 18 潘陽 ， 朱 曉峰 ， 王媛媛 ， 等 大豆毛口殼葉斑菌產(chǎn)毒素的研究 J 植物病理學(xué)報 ， 2011， 41( 6) : 596 603 19 王明 旭 ， 葉茂 ， 羅寬 ， 等 毛竹枯梢病病原菌毒素的生物測定及成分研究 J 湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報 ， 2001， 7( 1) : 28 32 20 鄧慧 穎 ， 邢建廣 ， 羅都強 海蓮內(nèi)生真菌 Pestalotiopsis clavis-pora 代謝產(chǎn)物研究 J 菌物學(xué)報 ， 2011， 30( 2) : 263 267 21 白志 強 ， 林秀萍 ， 劉永宏 內(nèi)生擬盤多毛孢菌化學(xué)成分研究進展 J 天然產(chǎn)物研究與開發(fā) ， 2013( 25) : 706 715 22 鄭永 標(biāo) ， 陳丹霞 ， 李軍進 ， 等 擬盤多毛孢菌中新倍半萜的分離與結(jié)構(gòu)解析 J 中國天然藥物 ， 2011( 9) : 421 424 23 董金 皋 ， 李正平 寄主選擇性植物病原真菌的毒素化學(xué) J 微生物學(xué)通報 ， 1997( 24) : 247 25078第 10 期 馮 友 仁 ， 等 : 新型月季葉枯病菌產(chǎn)毒條件及毒素化學(xué)成分分析