山 西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017， 45（ 11）： 1751- 1754， 1822 Journal of Shanxi Agricultural Sciences微型月季組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究梁 崢1，賈民隆1，李永平1，段九菊1，王云山1，曹冬梅1，鄭梅梅2（ 1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西 太原 030031； 2.山西梅芝園藝有限公司，山西 太原 030000）摘 要 ：以微型月季帶腋芽的幼嫩莖段為試材，對微型月季組培快繁中外植體消毒 、愈傷組織誘導(dǎo) 、叢芽增殖培養(yǎng)以及植株生根等關(guān)鍵技術(shù)進行研究 。結(jié)果表明，用 75% 酒精消毒 2 min 后，再用 HgCl2消毒 1015 min 時，外植體存活率最高；培養(yǎng)基 MS2 mg/L6- BA0.1 mg/LNAA 的愈傷組織誘導(dǎo)率可達 95%；愈傷組織增殖最適培養(yǎng)基為MS1 mg/L6- BA0.5 mg/LKT0.2 mg/LNAA；叢芽分化增殖最適培養(yǎng)基為 MS3 mg/L6- BA0.2 mg/LKT0.2 mg/LNAA；生根最適培養(yǎng)基為 1/2 MS0.1 mg/LNAA。關(guān)鍵詞 ：組織培養(yǎng)；微型月季；快繁中圖分類號 ：S685.12 文獻標識碼 ：A 文章編號 ：1002- 2481（ 2017） 11- 1751- 05Study on Key Techniques of Tissue Culture and Rapid Propagation of Rosa hybridaLIANGZheng1， JIAMinlong1， LI Yongping1， DUANJiuju1， WANGYunshan1， CAODongmei1， ZHENGMeimei2（ 1.Institute ofHorticulture， Shanxi AcademyofAgricultural Sciences， Taiyuan 030031， China；2.Shanxi Meizhi GardeningCo.， Ltd.， Taiyuan 030000， China）Abstract： Youngstem segments with axillarybuds from miniature rose（ Rosa hybrida） were employed for studies of tissue culture,which included explant sterilization, callus induction, shoots regeneration and plant rooting. The results showed that the survival rate ofexplants was the highest when sterilized with 75% alcohol for 2 min and HgCl2for 10- 15 min. The callus induction rate reached 95%when the mediumMS2 mg/L6- BA0.1 mg/LNAAwas used. The optimummediumfor callus proliferation was MS1 mg/L6- BA0.5 mg/L KT0.2 mg/L NAA. The optimal medium for shoots increased was MS3 mg/L 6- BA0.2 mg/L KT0.2 mg/L NAA. Theoptimummediumfor rootingwas 1/2 MS0.1 mg/LNAA.Key words： tissue culture; Rose hybrida; rapid propagation收稿日期 ：2017- 07- 14基金項目 ：山西省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項二批（ 201604D132045）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項目（ YGG1604）作者簡介 ：梁 崢（ 1987-），女，河北邢臺人，助理研究員，碩士，主要從事觀賞植物生物技術(shù)研究工作 。曹冬梅為通信作者 。doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.05微型月季（ Rosa hybrida）是薔薇科薔薇屬多年生木本 。與常見的灌木月季和藤本月季相比，其株型矮小，花小而多，全年都可以開放1-2，作為盆花具有天然的優(yōu)勢3-4，露地栽培也具有很高的觀賞價值5-9。同時微型月季還可以用于提取香料 、精油等產(chǎn)品 。傳統(tǒng)月季栽培以扦插為主10-11，但微型月季莖稈比較細弱，繁殖效率不高，難以滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要12。近年來，對于微型月季的繁殖方法研究主要集中在對扦插方法方面的探討上，包括不同品種不同基質(zhì)不同激素等因素對扦插繁殖的影響13-15。而對于組培快繁方面的研究則鮮有報道 。本研究探討使用組織培養(yǎng)的方法進行快速繁殖微型月季，旨在為工廠化生產(chǎn)育苗提供一定的技術(shù)支撐 。1 材料和方法1.1 植物材料微型月季帶腋芽的幼嫩枝條 。1.2 試驗方法1.2.1 外植體消毒 剪取月季幼嫩枝條，除去葉片，留葉柄，用帶腋芽的枝條莖段作外植體材料；將莖段沖洗干凈，切帶芽莖段約 4 cm 長度，放于燒杯中，滴少許洗潔精，加水搖勻流水沖洗 2 h；后放入超凈臺，用無菌水沖洗外植體 4 次，每次 1 min，然后將莖段切 1.5 cm左右，用 75%酒精消毒 2 min，無菌水沖洗 3 次，每次 2 min；用 0.1% HgCl2分別消毒5， 10， 15， 20 min，無菌水沖洗 4 次，每次 5 min。30 d后觀察記錄污染率 、褐化率 。1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 將消毒后的莖段置入不1751· ·山 西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017 年第 45 卷第 11 期同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，室溫（ 25±2） 培養(yǎng)，每天光照 12 h，光照強度 1 500 lx。30 d 后記錄愈傷組織誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)率 誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù) / 接種外植體數(shù) ×100%） 。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合設(shè)置為：（ 1） MS0.5 mg/L 6- BA0.1 mg/L NAA；（ 2） MS2 mg/L 6- BA0.1 mg/LNAA；（ 3） MS4 mg/L 6- BA0.1 mg/L NAA；（ 4）MS0.5 mg/L6- BA0.2 mg/LNAA；（ 5） MS2 mg/L6- BA0.2 mg/L NAA；（ 6） MS4 mg/L 6- BA0.2 mg/L NAA；（ 7） MS0.5 mg/L 6- BA0.1 mg/LIAA；（ 8） MS2 mg/L6- BA0.1 mg/LIAA；（ 9） MS4 mg/L 6- BA0.1 mg/L IAA；（ 10） MS0.5 mg/L6- BA0.2 mg/L IAA；（ 11） MS2 mg/L 6- BA0.2mg/LIAA；（ 12） MS4mg/L6- BA0.2mg/LIAA。1.2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng) 取狀態(tài)一致，大小相似的微型月季愈傷組織于不同激素組合的增殖培養(yǎng)基上，溫度（ 25±2） ，每天光照 12 h，光照強度1 500 lx。30 d 后記錄愈傷組織增殖情況，計算其增殖系數(shù)（愈傷組織增殖系數(shù) = 增殖培養(yǎng)后的愈傷質(zhì)量 / 接種愈傷質(zhì)量） 。愈傷組織增殖培養(yǎng)基激素組合設(shè)置為：（ 1） MS1 mg/L 6- BA0.2 mg/L KT0.2 mg/LNAA；（ 2） MS1 mg/L6- BA0.5 mg/LKT0.2 mg/LNAA；（ 3） MS2 mg/L6- BA0.2 mg/LKT0.2 mg/LNAA；（ 4） MS2 mg/L6- BA0.5 mg/LKT0.2 mg/LNAA；（ 5） MS1 mg/L6- BA0.2 mg/L KT0.2 mg/LIAA；（ 6） MS1 mg/L6- BA0.5 mg/LKT0.2 mg/LIAA；（ 7） MS2 mg/L6- BA0.2 mg/LKT0.2 mg/LIAA；（ 8） MS2 mg/L6- BA0.5 mg/LKT0.2 mg/LIAA。1.2.4 叢芽分化增殖培養(yǎng) 將 2 cm 左右萌發(fā)的腋芽插入不同激素組合的叢芽分化培養(yǎng)基上，置于溫度（ 25±2） ，每天光照 12 h，光照強度 1 500 lx。30 d 后觀察統(tǒng)計叢芽增殖情況，計算其增殖系數(shù)（叢芽增殖系數(shù) = 增殖培養(yǎng)后的芽數(shù) / 接種芽數(shù)） 。叢芽分化培養(yǎng)基激素組合設(shè)置為：（ 1） MS0.1 mg/L6- BA0.2 mg/L KT0.05 mg/L NAA；（ 2） MS0.5 mg/L 6- BA0.2 mg/L KT0.05 mg/L NAA；（ 3）MS1 mg/L 6- BA0.2 mg/L KT0.05 mg/L NAA；（ 4） MS3 mg/L 6- BA0.2 mg/L KT0.05 mg/LNAA；（ 5） MS0.1mg/L6- BA0.2mg/LKT0.2mg/LNAA；（ 6） MS0.5mg/L6- BA0.2mg/LKT0.2mg/LNAA；（ 7） MS1 mg/L6- BA0.2 mg/LKT0.2 mg/LNAA；（ 8） MS3 mg/L6- BA0.2 mg/LKT0.2 mg/LNAA。1.2.5 生根培養(yǎng) 將叢芽分離移入不同配方的生根培養(yǎng)基上，置于溫度（ 25±2） ，每天光照 12 h，光照強度 1 500 lx。30 d 后統(tǒng)計生根數(shù) 。生根培養(yǎng)基配方設(shè)置為：（ 1） MS0.1 mg/L NAA；（ 2） 1/2 MS0.1 mg/L NAA；（ 3） 1/3 MS0.1 mg/L NAA；（ 4） 1/4MS0.1 mg/LNAA；（ 5） MS（母液硝酸銨 800 mg/L）；（ 6） 1/2 MS （母液硝酸銨 800 mg/L）；（ 7） 1/3 MS（母液硝酸銨 800 mg/L）；（ 8） 1/4 MS（母液硝酸銨800 mg/L） 。2 結(jié)果與分析2.1 外植體消毒月季幼嫩枝條莖段的消毒試驗表明， HgCl2消毒時間長短對外植體材料污染率和褐死率有顯著的影響，其具體表現(xiàn)為：污染率隨 HgCl2消毒時間的延長而變小，褐死率隨消毒時間的延長而增大；其中， HgCl2消毒時間為 1015 min 時，外植體存活率最高，達到 75%（表 1） 。表 1 不同 HgCl2處理時間對微型月季莖段消毒的影響褐死率 /%05.02.517.5存活率 /%60.075.075.067.5污染率 /%40.020.022.515.0消毒方法75% 酒精 2 min0.1% HgCl25 min75% 酒精 2 min0.1% HgCl210 min75% 酒精 2 min0.1% HgCl215 min75% 酒精 2 min0.1% HgCl220 min樣本數(shù) / 個404040402.2 愈傷組織的誘導(dǎo)不同激素組合對微型月季愈傷組織誘導(dǎo)的試驗結(jié)果表明，不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基均能夠使外植體在莖段底部接觸培養(yǎng)基的部分產(chǎn)生少量淡黃色的愈傷組織，其中，（ 2） 號組合（ MS2 mg/L6- BA0.1 mg/LNAA）誘導(dǎo)率最高，達到了 95%（表2）；隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織有所增大，但增殖速度非常緩慢，因此，有必要進行愈傷組織增殖培養(yǎng)的條件優(yōu)化 。莖段底部愈傷組織緩慢增殖的同時，腋芽萌發(fā)，并在莖段上形成 12 cm 的嫩芽，嫩芽在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中稍出現(xiàn)玻璃化的現(xiàn)象，生長就會變緩 。1752· ·表 2 不同的激素組合對微型月季愈傷組織誘導(dǎo)的影響樣本數(shù) / 個202020202020202020202020愈傷組織誘導(dǎo)率 /%809585807570654545305040IAA0000000.10.10.10.20.20.2編號（ 1）（ 2）（ 3）（ 4）（ 5）（ 6）（ 7）（ 8）（ 9）（ 10）（ 11）（ 12）6- BA0.52.04.00.52.04.00.52.04.00.52.04.0NAA0.10.10.10.20.20.2000000激素組合 /（ mg/L）2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)不同激素組合對微型月季愈傷組織的增殖試驗結(jié)果表明，不同激素組合均能夠誘導(dǎo)其增殖生長，產(chǎn)生淺黃色的愈傷組織 。從所試組合總體上看，較高濃度的 6- BA 和 KT有利于微型月季愈傷組織的增殖生長，并且相同條件下， NAA 優(yōu)于 IAA；（ 2）號組合（ MS1 mg/L 6- BA0.5 mg/L KT0.2 mg/LNAA）的愈傷組織平均增殖系數(shù)最高，達到 2.6，但最優(yōu)組合并不是較高濃度 6- BA 的組合（表 3） 。因此認為，細胞分裂素在微型月季愈傷組織增殖作用上可能存在交互作用 。表 3 不同的激素組合對微型月季愈傷組織增殖的影響樣本數(shù) / 個2020202020202020愈傷組織平均增殖系數(shù)1.82.62.22.51.71.92.32.0NAA0.20.20.20.20000編號（ 1）（ 2）（ 3）（ 4）（ 5）（ 6）（ 7）（ 8）6- BA11221122KT0.20.50.20.50.20.50.20.5激素組合 /（ mg/L）IAA00000.20.20.20.22.4 叢芽分化增殖培養(yǎng)不同激素組合對微型月季叢芽分化增殖的試驗結(jié)果表明， 6- BA濃度在 0.10.5 mg/L時，植株生長緩慢，叢芽分化很少；當 6- BA 濃度達到 1 mg/L時，植株生長明顯變得旺盛起來，并且產(chǎn)生比較多的叢生芽；隨著細胞分裂素和生長素之比例的增大，微型月季叢芽增殖量有比較明顯的增加，但過大的比例容易誘發(fā)叢生芽的玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn) 。其中，（ 4）號組合（ MS3 mg/L 6- BA0.2 mg/L KT0.05 mg/L NAA） 的叢芽平均增殖系數(shù)最高，達到5.60，但新生叢芽存在玻璃化現(xiàn)象（表 4） 。綜合考慮，認為（ 8）號組合（ MS3 mg/L 6- BA0.2 mg/LKT0.2 mg/LNAA）為最適叢芽分化增殖培養(yǎng)基 。表 4 不同的激素組合對微型月季叢芽分化增殖的影響樣本數(shù) / 個2020202020202020叢芽平均增殖系數(shù)1.32.13.75.61.22.13.94.8NAA0.050.050.050.050.20.20.20.2編號（ 1）（ 2）（ 3）（ 4）（ 5）（ 6）（ 7）（ 8）6- BA0.10.51.03.00.10.51.03.0KT0.20.20.20.20.20.20.20.2生長狀態(tài)生長緩慢；叢芽少且小生長緩慢；叢芽少且小生長較旺盛；叢芽多，較細弱生長旺盛；叢芽多，較細弱并有玻璃化現(xiàn)象生長緩慢；叢芽少且小生長緩慢；叢芽少且小生長較旺盛；叢芽多，較粗壯生長較旺盛；叢芽多，較粗壯激素組合 /（ mg/L）梁 崢等：微型月季組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究1753· ·（下轉(zhuǎn)第 1822 頁 ）山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017 年第 45 卷第 11 期2.5 生根培養(yǎng)不同培養(yǎng)基對微型月季生根的試驗結(jié)果表明，減小培養(yǎng)基中硝酸銨含量 、添加低濃度的生長素均有利于微型月季根系的分化 。隨著硝酸銨含量的降低，微型月季根的分化進程提前，其中，（ 5）號處理于繼代后 12 d 最早出現(xiàn)不定根，當硝酸銨含量繼續(xù)降低，根系分化所需時間不再縮短，并且根系出現(xiàn)發(fā)褐發(fā)黑現(xiàn)象；添加了 NAA 的處理根系較細長，呈白色（表 5） 。綜合比較，認為（ 2）號培養(yǎng)基（ 1/2 MS0.1 mg/LNAA）為最適微型月季生根培養(yǎng)基（圖 1） 。3 討論叢芽增殖培養(yǎng)中，細胞分裂素濃度過高會導(dǎo)致叢芽出現(xiàn)玻璃化，這與雷穎等16的報道一致，但是如果降低細胞分裂素 6- BA 的濃度，叢芽增殖速率就會受到明顯的抑制 。本試驗中，當 6- BA 質(zhì)量濃度上升至 3 mg/L時，新生叢芽開始出現(xiàn)明顯的玻璃化現(xiàn)象，玻璃化的細小叢芽剝離后，經(jīng)過 23 次繼代成長雖能夠自行脫離玻璃化，但在恢復(fù)期間增殖速度會明顯受到影響 。在不改變 6- BA濃度的情況下適當提高 NAA 的濃度，希望通過調(diào)節(jié)生長素與細胞分裂素之比的方法解決高增殖系數(shù)下玻璃化的影響 。本試驗證明，適當提高 NAA 濃度，能夠較好地控制細胞分裂素濃度過高導(dǎo)致的叢芽玻璃化現(xiàn)象，抑制玻璃化現(xiàn)象的同時保持了比較高的增殖效率 。在繼代過程中發(fā)現(xiàn)，底部較老的莖容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象 。本試驗中，只是在繼代時將底部的褐化莖做了切除處理，莖底褐化現(xiàn)象對微型月季增殖快繁的影響還有待探究 。利用添加活性炭 、水解乳蛋白17-18等方法探究莖底部褐化現(xiàn)象對于微型月季組培快繁的影響，或許能夠進一步提高微型月季的工廠化育苗水平 。叢芽分化培養(yǎng)過程中偶見花芽分化，說明微型月季在一定條件下能夠在瓶內(nèi)開花，這也表明，在組培條件下存在研究微型月季整個生活史的可能 。關(guān)于微型月季試管開花的研究可見少量報道19-20，微型月季在組培條件下完成生活史的適宜條件尚有待研究 。參考文獻 ： 1李奎，胡曉雪 . 微型月季創(chuàng)造神奇價值 J. 中國花卉園藝， 2014（ 3）： 58- 59. 2王耘 . 最佳陽臺花卉 微型月季 J. 中國花卉盆景， 2009（ 10）： 9. 3呂金花 . 花卉業(yè)是前景廣闊的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè) J. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007（ 7）： 95- 96. 4顧蓉，李燕，曹建琴 . 太原市年宵盆花調(diào)查 J. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016， 44（ 1）： 63- 66. 5彭華，管幫富，彭火輝，等 . 江西南昌引種豐花及微型月季品種的鑒定評估 J. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2012（ 4）： 34- 37. 6 宋尚平 . 微型月季相關(guān)研究通過鑒定 N. 中國花卉報，2010- 05- 13. 7牟會斌，陸紅梅 . 盆栽和地被好材料 微型月季 J. 園林，2000（ 12）： 38- 39. 8王松，付寶春，劉琛彬，等 . 太原市城區(qū)冬季園林植物調(diào)查與景觀效果評價 J. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（ 1）： 48- 53.表 5 不同的培養(yǎng)基對微型月季生根的影響樣本數(shù) / 個2020202020202020平均生根數(shù)2.44.33.31.54.73.62.81.9NAA濃度 /（ mg/L）0.10.10.10.10000編號（ 1）（ 2）（ 3）（ 4）（ 5）（ 6）（ 7）（ 8）鹽濃度MS1/2 MS1/3 MS1/4 MSMS1/2 MS1/3 MS1/4 MS母液硝酸銨含量 /（ g/L）1.651.651.651.650.80.80.80.8根系生長狀態(tài)出現(xiàn)晚，較細長，白色出現(xiàn)較早，較細長，白色出現(xiàn)較早，較細長，白色較細長，黃褐色出現(xiàn)早，較短粗，黃褐色出現(xiàn)較早，較短粗，黃褐色較短粗，黑褐色較短粗，黑褐色1754· ·（上接第 1754 頁 ） 9付寶春，李志娟，劉琛彬，等 . 太原市城區(qū)園林植物應(yīng)用現(xiàn)狀調(diào)查與分析 J. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（ 6）： 594- 598， 649. 10劉和風(fēng)，孟吉強，代經(jīng)亮 . 微型月季出口生產(chǎn)管理 J. 中國花卉園藝， 2009（ 18）： 44- 45. 11周家杏 . 微型月季扦插繁殖技術(shù)及扦插苗對溫度的適應(yīng)性研究 D. 上海：上海交通大學(xué)， 2008. 12陳蘭芬 . 7 個微型月季組織培養(yǎng)研究 J. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院學(xué)報， 2015（ 2）： 35- 39. 13汪有良 . 微型月季扦插生根能力初步研究 J. 江蘇林業(yè)科技，2012（ 5）： 16- 19， 38. 14季春娟，曾麗，周家杏，等 . 不同基質(zhì)對微型月季扦插繁殖的影響 J. 上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版）， 2010（ 3）： 275- 279. 15閆小紅 . 微型盆栽月季微體扦插快繁及其配套技術(shù)的研究 D.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2006. 16雷穎，劉宇 . 微型月季快速繁殖與優(yōu)化培養(yǎng)瓶內(nèi)開花試驗研究J. 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