<p>西北 植 物學(xué)報(bào) ，（）： 文章編 號(hào) ：（） &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ：收稿 日 期 ：；修改稿收到日期 ：基金 項(xiàng) 目 ：山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目 （）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目 （）；山西省研究生教育改 革研究課題 （）作者簡(jiǎn) 介 ：張浩宇 （），女 ，在讀碩士研究生 ，主要從事百合花香研究 。：通信作 者 ：杜方 ，博士 ，教授 ，主要從事花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與育種研究 。：東方 百 合演員基因的克隆與表達(dá)分析張浩 宇 ，樊 俊苗 ，王婷 ，杜方（山西 農(nóng) 業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 ，山西太谷）摘要 ：以東 方 百合 演員 花瓣為試驗(yàn)材料 ，采用 技術(shù) ，克隆 得到百合 脫氧 木 酮糖磷酸合成酶基因的 全長(zhǎng)，命名 為（登錄號(hào) 為 ）。序列分 析表明 ，基 因 序列全長(zhǎng) ，其中開(kāi)放閱讀框包含 ，編碼個(gè)氨基 酸，相對(duì)分子量大小約為，等電點(diǎn) 為，化學(xué)式為 。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示 ，與獼猴桃和萬(wàn)壽菊 聚為一 類，屬于型 ，是功能較保守的一類 。實(shí) 時(shí)熒光定量 結(jié) 果分 析表明 ，基因在不同品種百合花瓣中均有表達(dá) ，且濃 香 型百合 基因表達(dá)量比淡香型和無(wú)香型百合高 。該研究結(jié)果為百合 生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ) ，同時(shí) 也 為百合花香育種提供了理論依據(jù) 。關(guān)鍵詞 ：百合 ；脫氧木 酮糖磷酸合 成酶 ；表 達(dá)特 征中圖分類號(hào) ：； 文獻(xiàn)標(biāo) 志碼 ： ， ， ， （ ， ， ，）： （） ， （ ） ， ， ， ， ， ：； （）； 萜類物 質(zhì)廣泛存在于自然界生物體內(nèi) ，大約有 種 ，構(gòu)成了 最大的天然產(chǎn)物家族。在高等植 物中 ，有些萜類物質(zhì)參與生理代謝活動(dòng) ，如光合作用 、呼吸作用和細(xì)胞周期控制等，有些萜 類化合物如丹參中的丹參酮類具有藥理活性，有些萜 類化合物為食品工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原料，同時(shí)低分子 量的萜類也是百合花香成分中的重要物質(zhì)。萜類物 質(zhì)合成途徑有位于質(zhì)體的甲基赤 藻 糖 醇磷 酸 （ ，）和位于 胞質(zhì)的甲羥戊酸 （，）兩條途 徑。脫氧木 酮糖磷酸合成 酶 （ ，）是途徑中 的關(guān)鍵酶，并且已 有研究表明其在擬南芥中發(fā)揮著限速酶作用，是萜類 次生代謝物質(zhì)等下游產(chǎn)物的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn) 。百合作為主要的切花和盆花材料 ，在國(guó)內(nèi)外花卉市場(chǎng)占有重要地位。百合不 僅具有艷麗的色彩 ，還有豐富的香型 ，有墨香 、濃香 、甜香 、淡香以及無(wú)香。近年來(lái) ，百合花香是學(xué)者研 究的一大熱點(diǎn) 。從揭 示 花 香 成 分、釋 放 器 官、散 發(fā) 規(guī)律到代謝 通路的挖掘以及相 關(guān)基因 、調(diào)控基因的克隆和原核 生物表達(dá)驗(yàn)證，都取得 了突破性的進(jìn)展 。通常亞洲百合無(wú)香味 ，而東方百合香味濃烈 ，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的購(gòu)買欲 。因此 ，改良花香是育種家孜孜以求的育種目標(biāo) 。已有研究表明 ，與有香百合相比 ，無(wú)香百合中單萜類化合物的釋放量很低或根本檢測(cè)不到。因此 ，研究 百合單萜類花香物質(zhì)的代謝通路及其關(guān)鍵基因?qū)τ诮沂净ㄏ悴町惐举|(zhì)原因具有重要意義 。本研究采用技術(shù)從東 方百合 演員 （ ）花瓣中 克隆得到的全長(zhǎng) ，并對(duì)其 在不同香型百合品種間表達(dá)特征進(jìn)行了研究 ，為今后通過(guò)基因工程改良百合花香提供了理論依據(jù) 。 材料 和 方法 材料試 驗(yàn)材 料 （表）種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝站百合圃 。年月陸續(xù) 取不同品種百合盛開(kāi)期花瓣 ，經(jīng)液氮速凍 ，保存 ，備用 。 方法 提取與第一鏈 合成使 用公 司 裂 解 液 ，采 用法 提 取 百 合 總。使 用生 物光度計(jì)檢測(cè)的 濃度 和純度 ，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量 ，按照試劑盒 說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成。 基因的 克隆從核酸數(shù) 據(jù)庫(kù)中查詢獲得條百合序列信 息 ，登錄號(hào)為。分別設(shè) 計(jì)和引物 （表），以 演員 為模板 ，利 用表 引物 序 列 引 物 名 稱 引物序 列 （） &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;表 試驗(yàn)用材料基本信息 編號(hào) 品種名 雜種系 香型 特 里昂 菲特 麝?yáng)|百 合 甜香 完美 喇叭百 合 墨香 演員 東方百 合 濃香 八 點(diǎn)后 東方百 合 濃香 白夢(mèng) 東方百 合 濃香 羅賓娜 東喇百 合 濃香 黃 色風(fēng) 暴 東喇百 合 濃香 金石 麝亞百 合 淡香 布林迪 西 麝亞百 合 淡香 佩 維亞 麝亞百 合 淡香 朱麗葉 新鐵炮 百合 淡香 羅馬廣 場(chǎng) 亞洲百 合 無(wú)香 小 珍珠 亞洲百 合 無(wú)香 西北植物學(xué)報(bào)卷公司試劑盒 進(jìn)行擴(kuò) 增 。反應(yīng)總 體系為，其中 ，×引物，（）引物， ，× ， 。擴(kuò)增條 件為 ：，個(gè)循環(huán) ；，個(gè)循環(huán) ，個(gè)循環(huán) 。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) ，切膠回收目的片段 ，加反應(yīng)按照天根加試劑的方法標(biāo)準(zhǔn)操作 。加后 ，連接 載 體（），轉(zhuǎn) 化 感 受態(tài) 細(xì)胞 （全式金 ），菌液驗(yàn) 證后送 生工生物工程 （上海 ）股份有限公司測(cè)序 。利用軟件拼 接測(cè)序結(jié)果 ，得到編碼序列 。 生物信 息學(xué)分析利用（：）預(yù) 測(cè)分子 量 和 理 論 等 電 點(diǎn)。用在 線 軟 件（：）預(yù)測(cè)蛋白結(jié) 構(gòu)域。通過(guò)（：）在線軟 件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。用在線 軟件（：）分 析 蛋 白 質(zhì) 親 水 性 疏 水性 ；用 （：）在線軟 件對(duì)進(jìn) 行 跨 膜 性 分 析。用（： ）預(yù)測(cè)蛋 白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。用 軟件進(jìn) 行序列比對(duì)及翻譯 ，用軟件構(gòu) 建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 實(shí)時(shí)熒 光定量分 析根據(jù) 已克隆的百合的序列分 析結(jié)果 ，設(shè)計(jì)熒光定量引物 ，比對(duì)確 定引物特異性 。分別以不同品種盛開(kāi)期花瓣的為模板 ，以基因作 為內(nèi)參基因 ，反應(yīng)引物、見(jiàn)表。參照 杜方等的步驟 進(jìn)行熒光定量，研 究不 同品種百合基因表 達(dá)差異 ，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行次重復(fù) 。所得數(shù)據(jù)采用進(jìn)行平 均數(shù)統(tǒng)計(jì) ，法計(jì)算相 對(duì)表達(dá)量 ，以 軟件進(jìn)行 方差分析 ，多 重比 較 ，利用 繪圖 。 結(jié) 果 與 分析 基因全 長(zhǎng)的克隆通 過(guò)法 ，以東方 百合 演員 花瓣為模板 ，分 別進(jìn)行和擴(kuò)增 、克隆和測(cè) 序分析 ，獲得末端序列長(zhǎng)度 ，獲得末端序列 長(zhǎng)度 （圖），與預(yù)期 結(jié)果一致 。命名該基因?yàn)?，登錄?hào) 為。該基因 全長(zhǎng) ，其中包 含 ， 和開(kāi)放 閱讀框 ，編碼個(gè)氨基酸 。通 過(guò)軟件翻 譯獲得基因編碼的氨基酸序列 （圖）。 蛋白結(jié) 構(gòu)分析預(yù)測(cè)氨 基酸序列中含有個(gè)功能結(jié)構(gòu)域 ，分別是端合 成結(jié) 構(gòu)域 、結(jié) 合結(jié) 構(gòu)域和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域 （圖）。分析該 蛋白相對(duì)分子量為，理論等 電點(diǎn)為，化學(xué)式為，原子量。信號(hào)肽 結(jié)果分 析 表 明 ，不 屬 于 分 泌 蛋 白 。（ ）值為負(fù)值 ，表 明蛋白屬于親水性蛋白 。蛋白跨膜性分析顯示無(wú)跨膜區(qū)域 ，不屬于膜蛋白 。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示 ，其氨基酸組成螺旋 （）為個(gè) （），延伸鏈 （）為個(gè) （），轉(zhuǎn)角 （）為個(gè)（），無(wú)規(guī)則 卷曲為個(gè) （）。 多序列比對(duì)與聚類分 析百合 演員 中克隆的基因分 別與已分離獲得的基因、序列一 致性都高達(dá)（圖），與無(wú)油 樟 （ ）、蔓花生 （ ）、黃芪 （ ）的 一 致 性 分 別 達(dá)、。用軟件對(duì)種可以產(chǎn)生萜類化合物的植物進(jìn)行聚 類分 析 ，結(jié)果表明所獲得的百合基因?qū)儆诘谝活惢?，是 較為保守的管家基因 （圖）。 百 合基因在品種間的表達(dá) 模式采用方 法檢 測(cè)在個(gè)百合品 種的表達(dá)情況 。由圖可知 ，在不同 品種中均有表達(dá) ，在濃香型東方百合 白夢(mèng) 中表達(dá)量最高 ，在無(wú)香的亞洲百合 小珍珠 中最低 ；濃香型百合圖 基因 片 段 電泳圖 期張浩宇 ，等 ：東 方百合 演員 基因的克隆與表達(dá)分析為 起始 密碼子；為 終止 密碼子；粉色 、藍(lán)色和綠色箭頭分別表示 端 合 成結(jié) 構(gòu)域 （）、結(jié)合結(jié)構(gòu) 域 （）和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域 （）在氨基酸序列中的起止位置圖 百 合 基因的核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列 ； ； ， ， ， （） （） 表達(dá)量 與淡香型和無(wú)香型之間差異顯著 ，但淡香型和無(wú)香型百合基因表達(dá)差異不顯著 ；同一香型百合之間基因表達(dá)差異也不盡相同 ，濃香型百合之間存在顯著差異 。在百合不同品種間的 表達(dá)量表明 ，不同品種百合花香的差異與基因表達(dá) 有關(guān) 。 討論萜類物 質(zhì)在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和自身防御等方面發(fā)揮重要作用。張輝秀 等研究表 明濃香型百合萜烯類釋放量最高 ，在淡香類中沒(méi)有檢測(cè)到 ，并且認(rèn)為其中兩種單萜成分是百合花致香的關(guān)鍵成分 。基因是 萜類物質(zhì)合成途 徑的第 一個(gè)關(guān)鍵酶基因 ，萜類含量與的表達(dá) 水平密切相關(guān)，目前已 在種植物中分離和克隆?；蜻^(guò) 表達(dá)或干擾表達(dá)均能夠改變次生代 謝 物 質(zhì) 合 成 ，在 擬 南 芥 （ ）、胡 蘿 卜 （ ）、寬 葉 薰 衣 草（ ）和 獼 猴 桃 （）等植物 中都已進(jìn)行了初步功能驗(yàn)證 。不同物種基因家 族成員數(shù)不同 ，以前的研究認(rèn)為酶 由個(gè)基 因編碼 ，基于測(cè)序的研 究表明 ，胡蘿卜和煙草 （ ）有中分 別有個(gè)和個(gè) ，對(duì)于百合基因研究 甚少 ，目前 ，已知的百合家族成 員至少有個(gè) ，前人只在 中獲得 部分序列，張騰旬 在東方百合 西伯利亞 品種中也克隆得 到個(gè)基 因全 長(zhǎng) ，屬 于型，但序列 信息尚未公布 。本研究通過(guò)技術(shù) ，克隆 了百合基因全長(zhǎng) ，并利 用生物信息學(xué)手段分析研究其編碼的蛋白特性 ，該蛋白具有親水性特點(diǎn) ，不屬于分泌蛋白 ，由此推測(cè)它只在質(zhì)體中發(fā)揮功能 。通過(guò)對(duì)基因的表達(dá)規(guī)律研究 ，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與器官 、花 、果實(shí)發(fā)育程度 、晝夜節(jié)律 、品種等有關(guān) 。研究表明在夜香 樹(shù) （ ）葉片中 的表達(dá)量總體高于花器官。隨著花 朵開(kāi)放級(jí)數(shù)和果實(shí)成熟 ，玫瑰花瓣和獼猴 桃果實(shí)中基因表達(dá)量逐級(jí)增加 。茉莉花 瓣中基因的 表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。課題組 之前的研究表明 ，在百合 索 邦 花和鱗片中顯著高表達(dá) ，但只在 朱麗葉 花中顯著高表達(dá)。本研究發(fā) 現(xiàn) ，基因的表達(dá)水平與花香的 釋放呈現(xiàn)一定的規(guī)律 ，濃香型百合基因表達(dá)量顯著高于淡香型西北植物學(xué)報(bào)卷紅 色 部 分為 個(gè)序列不完全一致位點(diǎn) ；黑色方框中 為 起始 密碼子 ，方框中 為 終止 密碼子圖 百合 基因多序列比對(duì) ； ， 圖 與其他 植物 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 和無(wú)香 型百合 。的研究 結(jié)果表明 ，濃香型百合 比淡香 型 基因表達(dá) 量高，與本研 究結(jié)果一致 。本試驗(yàn)主要從百合中分離獲得一個(gè)基因品種 名 稱同表 ；不同小寫(xiě)字母代表不同品種的差異顯著性 （）圖 在不同品種百合的相對(duì)表達(dá)量 ； （） 期張浩宇 ，等 ：東 方百合 演員 基因的克隆與表達(dá)分析全長(zhǎng) ，對(duì)其 進(jìn)行了初步研究 ，發(fā)現(xiàn)屬于，是 功能 較為保守的一類 ，分析了該基因在不同品種中的表達(dá)模式 ，推測(cè)在百合 花香萜類化合物合成途徑中起重要作用 ，后期需進(jìn)一步對(duì)百合基因家 族成員數(shù)目 、分類和功能以及在百合花香代謝調(diào)控中的作用機(jī)制進(jìn)行研究 ，對(duì)于明確花香差異的本質(zhì)原因 ，以及利用現(xiàn)代生物育種技術(shù)改良百合花香具有一定的意義 。參考文獻(xiàn) ： ， ， ， ： ，（）：趙恒偉 ，葛鋒 ，孫穎 ，等 植物萜類物質(zhì) 生物合成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用前景 中草藥 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： 馬 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) ，龐 瀟卿 ，諶容 ，等 萜類化合物生物合成途徑中關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展 杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：唐彪 ，胡增輝 ，冷 平生 ，等 濃香型和淡香型百合單萜合酶基因差異表達(dá) 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ， ，： ， ，： ， ， ， ，（）： 陳莉 ，辛海波 ，李 曉艷 ，等 百合 基因的克隆與表達(dá)分析 林 業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， ，（）：杜方 百合引種栽培及分 子研究 北京 ：中國(guó)林業(yè)出版社 ，：范燕萍 ，范 麗琨 不同類型百合花瓣揮發(fā)性香氣成分分析中 國(guó)園 藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專業(yè)委員會(huì)年學(xué)術(shù) 年會(huì) 張輝秀 ，胡 增輝 ，冷平生 ，等 不同品種百合花揮發(fā)性成分定性與定量分析 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ： ，： ， ， ， ，（）：張 輝秀 ，冷 平生 ，胡增輝 ，等 西伯利亞 百合花香隨開(kāi)花進(jìn)程變化及日變化規(guī)律 園藝學(xué)報(bào) ，（）： ， ， ， ，（）：孔瀅 ，孫明 ，潘會(huì)堂 ，等 花香代謝與調(diào)控研究進(jìn)展 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ，（）： ， ， ， ，（）：李 路路 ，王歡 ，孫明 ，等 岷江百合單萜合酶基因克 隆與表達(dá)分析 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：王歡 百合苯甲酸甲酯代謝相關(guān) 基因 的 克隆與分析 北京 ：北京林業(yè)大學(xué) ，李紹翠 ，姜 新強(qiáng) ，丁愛(ài)琴 ，等 月季 基因的 克隆及表西北植物學(xué)報(bào)卷達(dá)特 征 分析 華北農(nóng)學(xué)報(bào) ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ： ， ，（ ）： ， ， ， ： ，（）：徐麗 ，陳新 ，宗曉娟 ，等 甜 櫻桃砧木 基 因 的 克隆與分析 核農(nóng)學(xué)報(bào) ，（）： ， ， ， ，（）：董慧霞 ，理 永霞 ，賈秀貞 ，等 楊樹(shù) 基因的克隆與分析西北 農(nóng) 林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版 ），（）：， ， ， ， （ ），（）：，趙佳 ，劉榮 ，等 月季花青素苷相關(guān) 蛋 白基 因的克隆和表達(dá)分析 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ，（）： 杜方 ，樊 俊苗 ，王婷 ，等 百合品種和器官中花香和抗性基因 的表達(dá)模式 分子植物育種 ，（）： ， ， ， </p>