華北農(nóng)學(xué)報(bào)·2018，33( 2) : 87-94收稿日期:2018 01 27基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471904);安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A871);安徽省高校質(zhì)量工程項(xiàng)目(2015jyxm221)作者簡介:隋娟娟(1981 )，女，山東濰坊人，副教授，博士，主要從事園林植物栽培生理與生物技術(shù)研究。重瓣百合LiAGL6基因的克隆與表達(dá)分析隋娟娟1，李曉昕2，吳 健2，曹 興3，吳 澤2，何俊娜2，義鳴放2(1阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽阜陽 236037;2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞園藝與園林系，花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;3聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252059)摘要:為了深入研究重瓣百合花形成的分子機(jī)制，以重瓣百合比羅尼卡為試驗(yàn)材料，從中分離得到1 個 AGL6 基因，其開放閱讀框?yàn)?44 bp，共編碼247 個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為28 3 ku。親水性平均系數(shù)為 0 748，等電點(diǎn)為823。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，百合AGL6 蛋白具有典型的MADS-box結(jié)構(gòu)域、K-box區(qū)及2個AGL6 基序。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，百合AGL6 編碼的蛋白屬于AP1/AGL9 亞家族AGL6 分枝的單子葉植物類群，與同為單子葉植物的風(fēng)信子親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)到78%，說明克隆得到的基因即為AGL6 的同源基因，將其命名為LiAGL6。亞細(xì)胞定位表明，LiAGL6 在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，具備轉(zhuǎn)錄因子的基本特征。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果分析表明，LiAGL6基因在花中表達(dá)量最高，在莖、葉中幾乎不表達(dá);在整朵花中，LiAGL6 在第7輪花瓣中的相對表達(dá)量最高，其次依次是第6輪和第3輪，第2輪花瓣中幾乎檢測不到表達(dá)。研究表明，LiAGL6基因可能在百合重瓣花形成方面發(fā)揮了調(diào)控作用。關(guān)鍵詞:重瓣百合;MADS-box;基因克隆;LiAGL6 基因;表達(dá)分析中圖分類號:Q78;S64403 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1000 7091(2018)02 0087 08doi:107668/hbnxb201802013Cloning and Expression Analysis of LiAGL6 in Double LilySUI Juanjuan1，LI Xiaoxin2，WU Jian2，CAO Xing3，WU Ze2，HE Junna2，YI Mingfang2(1 Biology and Food Engineering School，F(xiàn)uyang Normal University，F(xiàn)uyang 236037，China;2 Beijing Key Laboratory of Development and Quality Control of Ornamental Crops，Department ofOrnamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China; 3 College of Agronomy，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China)Abstract:To explore flower development molecular mechanism of the Double lily，the AGL6 homologous genewas cloned from Double lily cv Belonica The open reading frame of LiAGL6 gene was 744 bp，encoded a protein of247 amino acids The LiAGL6 protein molecular weight was 28 3 ku，the grand average of hydropathicity was0748 and the theoretical pI was 823 The protein structure analysis showed that LiAGL6 protein had a typicalMADS-box domain，a K-box region and two AGL6 motifs Phylogenetic tree analysis showed that LiAGL6 belongedto monocotyledon group，AGL6 branch of the AP1/AGL9 subfamily，and had the highest similarity with Hyacinthusorientalis which was also belonged to monocotyledons，the similarity reached 78% All the results indicated LiAGL6was the homologous gene of AGL6，so named it LiAGL6 Cellular localization assay revealed LiAGL6 expressed in thenucleus of onion epidemical cells，which was the basic characteristics of the transcription factors The qRT-PCR re-sult showed the highest expression of LiAGL6 was in flowers while no expression occurred in leaves and stems LiA-GL6 was expressed most in the seventh whorl petals followed by the sixth and third whorl petals，however，there wasalmost no expression in the second whorl petals The research showed the LiAGL6 gene might play a regulatory roleon formation of Double lily flowersKey words:Double lily;MADS-box;Gene cloning;LiAGL6 gene;Expression analysis88 華 北 農(nóng) 學(xué) 報(bào) 33 卷顯花植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L是生活史中的一個重要?dú)v程，花是顯花植物重要的繁殖器官，花的形成和發(fā)育受到多個基因的調(diào)控。Coen等1研究提出了花器官發(fā)育的ABC模型，將調(diào)控花發(fā)育的基因分為A、B、C這3 類，在花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊的發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的作用。隨著研究的進(jìn)一步深入，人們又發(fā)現(xiàn)了調(diào)控胚珠發(fā)育的 D類基因以及對各輪花器官發(fā)育均有調(diào)控作用的 E類基因，因此，ABC 模型進(jìn)一步擴(kuò)展為 ABCDE模型2。MADS-box 家族基因廣泛分布于動物、植物及真菌中，其編碼的蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)，對植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用3。植物的開花過程精密而復(fù)雜，受到很多基因的調(diào)控，其中，MADS-box 基因在植物的花形態(tài)建成方面發(fā)揮了重要作用。MADS-box基因是一個龐大的基因家族，在長期進(jìn)化過程中分化為Type和 Type兩大類，其中，Type基因含有4 個不同的結(jié)構(gòu)域，分別為MADS( M)、Inter-vening( I)、Keratin-like( K)和 Carboxyl-terminal( C)，因此被稱為MIKC基因;而Type基因缺少Keratin-like( K)結(jié)構(gòu)域，目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控植物花發(fā)育的相關(guān)基因大部分屬于MIKC亞家族基因4 6。AGL6( AGAMOUS like 6) 亞家族基因是一個古老的遺傳冗余基因，屬于 MIKC 家族的 AP1/AGL9組，該組由AP1、AGL6/AGL13 以及SEP這3 個分枝組成，AGL6 與SEP互為姊妹系，在300 萬年以前就已經(jīng)出現(xiàn)在被子植物與裸子植物的共同祖先中3，5，7 8。目前，已經(jīng)從多種植物中克隆得到AGL6的同源基因，如裸子植物輻射松( Pinus radiata)9、挪威云杉( Picea abies)10、柳杉( Cryptomeria japoni-ca)11，被子植物玉米( Zea mays)12、水稻( Oryzasativa)13 14、擬南芥( Arabidopsis thaliana)15、矮牽牛( Petunia hybrida)16等。前人研究表明，AGL6 基因與花器官發(fā)育密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)開花時(shí)間、生殖分生組織及花器官的決定性方面17。在擬南芥中將AGL6 基因過表達(dá)或由T-DNA插入使其表達(dá)增強(qiáng)后，會導(dǎo)致擬南芥早花現(xiàn)象18 19;水稻中的AGL6-like基因 OsMADS6 突變后，水稻會喪失花分生組織屬性的決定性，導(dǎo)致小穗的分生組織形成額外的小穗14，20;玉米中的 AGL6-like 基因 ZAG3 突變后，雌花和雄花的表型會發(fā)生多樣化21;樊金會等22研究表明，風(fēng)信子中的 HoAGL6 能夠通過促進(jìn)SOC1、LFY 基因的表達(dá)調(diào)節(jié)開花時(shí)間，通過激活A(yù)G、SEP1 基因參與花器官發(fā)育，在擬南芥中異位過表達(dá)后引起開花提前、植株矮小及器官之間發(fā)生同源轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象; Melzer 等23 24研究認(rèn)為，AGL6/SEP1/SQUA-like轉(zhuǎn)錄因子家族是花發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，其通過相互作用將分生組織和花器官的決定性聯(lián)合起來，最終發(fā)育形成有正常功能的花器官。百合( Lilium spp)屬于單子葉植物，是百合科百合屬觀賞花卉，單瓣百合花器官主要由3 枚瓣化的萼片、3 枚花瓣、6 枚雄蕊及1 枚雌蕊組成。花的發(fā)育是影響百合花品質(zhì)的生物學(xué)基礎(chǔ)，目前，市場上百合多以單瓣品種為主，復(fù)瓣和重瓣百合品種繁育技術(shù)尚不成熟，品種較少，市場認(rèn)知度不高，因此，開展百合花瓣發(fā)育相關(guān)基因的研究，對通過生物技術(shù)改善百合觀賞瓣性，提高百合品種多樣性與穩(wěn)定性，具有重要的意義。本研究以雌雄蕊瓣化的重瓣百合比羅尼卡為試驗(yàn)材料，從中克隆了 AGL6基因，并對其蛋白特性和表達(dá)特性進(jìn)行了分析，以期探討出 AGL6 基因在百合重瓣花中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示E類基因AGL6 在花發(fā)育方面的作用機(jī)制以及通過基因工程改善百合的觀賞瓣性提供理論參考。1 材料和方法11 試驗(yàn)材料以重瓣百合比羅尼卡( Belonica) 為試驗(yàn)材料，種球購自荷蘭，規(guī)格為18 20 cm，種植于北京市盛斯通生態(tài)科技有限公司南口試驗(yàn)基地，常規(guī)栽培管理。比羅尼卡的花器官由外至內(nèi)共由 7 輪花瓣組成，雌雄蕊全部瓣化，其中最內(nèi)側(cè)的第7 輪花瓣上偶見殘存的花藥(圖1)。A重瓣花;B1 7 輪花瓣。A The double flower;B1 7 wheel petals圖1 百合比羅尼卡的重瓣花及花瓣Fig1 The double flower pattern and thepetals of lily Belonica2 期 隋娟娟等: 重瓣百合LiAGL6 基因的克隆與表達(dá)分析 89試驗(yàn)所用的 RNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司; DNA 片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;pMD18-T 載體、SYBRPremix Ex TaqTM( TliRNaseH Plus)熒光定量試劑盒以及試驗(yàn)中所用的各種常規(guī)酶類均購自 TaKaRa 公司;卡那霉素( Kan)、氨芐青霉素( Amp)購自 Sigma 公司;大腸桿菌感受態(tài)DH5購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;擴(kuò)增引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;DNA 測序由北京華大科技有限公司完成。12 試驗(yàn)方法121 總RNA提取及 AGL6 基因的克隆 取比羅尼卡盛花期的花瓣，用液氮速凍并保存于 80 的超低溫冰箱中備用，按照RNA提取試劑盒中的說明書提取 RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。利用 Reverse Transcriptase M-MLV 進(jìn)行 cDNA第1 鏈的合成，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞植物栽培生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室前期從百合中克隆得到的 AGL6 基因 ORF(開放閱讀框)序列(未發(fā)表)設(shè)計(jì)1 對引物( F1:5'-ATGGGTAGAGGAAGAGTTGAGTTGAAGAG-3'R1:5'-CTACCATCCCATACTCAAAGAACCCAAACC-3')，以重瓣百合比羅尼卡花瓣的 cDNA 為模板，使用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件:98 5 min;98 10 s，63 15 s，72 1 min，35個循環(huán);72 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5感受態(tài)中，Amp 抗性培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測，將含有目的基因片段的陽性克隆送北京華大科技有限公司測序，獲得比羅尼卡AGL6基因的ORF全長序列。122 基因序列分析 將獲得的基因 ORF 序列使用NCBI( http: / /www ncbi nlm nih gov/)在線工具進(jìn)行序列分析;使用 ProtParam( http: / /www webexpasy org/protparam)在線工具預(yù)測分析百合AGL6蛋白的基本性質(zhì); 使用 NCBI( http: / /www ncbinlm nih gov/)的 Blast 功能搜索同源基因并進(jìn)行蛋白的相似性分析;使用 DNAMAN 5 0 軟件對 AGL6蛋白進(jìn)行多重比對分析;使用 MEGA 5 0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。123 亞細(xì)胞定位分析 結(jié)合 pCAMBIA1300 載體特點(diǎn)，使用DNAMAN 5 0 軟件對百合 AGL6 基因的 ORF 序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，選用 Sal 和Spe 作為構(gòu)建融合表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異引物( F2:5'-GTCGACATGGGTAGAGGAAGAGTTGAG-3'，R2:5'-ACTAGTCTACCATCCCATACTCAAAG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將pCAMBIA1300 空載質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，之后將酶切產(chǎn)物純化并用T4連接酶16 連接過夜，獲得重組表達(dá)載體。通過基因槍轟擊法將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轟擊到經(jīng)過MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24 h的洋蔥( Allium cepa)表皮細(xì)胞中，24 h后在激光共聚焦顯微鏡( Nikon E-clipse TE2000-E)下進(jìn)行觀察及拍照，以空載pCAM-BIA1300-GFP為對照。124 基因表達(dá)分析 分別取比羅尼卡盛花期的莖、葉、整朵花瓣及1 7 輪不同花瓣用液氮速凍并保存于80 的超低溫冰箱中備用，按照說明書提取RNA，電泳檢測完整性，并進(jìn)行cDNA第1 鏈的合成(方法同 1 2 1)。用 ABI Step One Plus SystemPCR儀，以上述材料反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，將百合AGL6 基因 ORF 序列結(jié)合3'端 UTR 序列設(shè)計(jì)定量特異引物( F3:5'-GGTTCTACTGAAGAAGCTATGCCAT-3'R3:5'-CGATCCAATCCGAAATAAAGTTCG-3')，進(jìn)行重瓣百合AGL6 基因的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析。以18S rRNA為內(nèi)參(18SF:5'-AGTTGGTGGAGCGATTTGTCT-3'，18SR:5'-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3')進(jìn)行百合 AGL6 基因的相對表達(dá)水平檢測。PCR 反應(yīng)體系為:95 3 min;95 3 s，58 30 s，72 20 s，40 個循環(huán);95 15 s，60 60 s，95 15 s，1 個循環(huán)。每個樣品設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)，采用2CT法對基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。2 結(jié)果與分析21 百合LiAGL6 基因克隆將重瓣百合花瓣提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得比羅尼卡重瓣百合基因ORF 序列744 bp，共編碼247 個氨基酸(圖2)。Blast的結(jié)果顯示，百合 AGL6 基因與其他物種的AGL6 基因有較高的同源性，因此，將其命名為 LiA-GL6 基因。22 百合LiAGL6蛋白特性與同源比對分析ProtParam在線工具預(yù)測百合LiAGL6 蛋白的分子式為C1216H1956N364O384S15，分子量為283 ku，半衰期在大腸桿菌( Escherichia coli)中大于10 h，在酵母菌( Saccharomyces cerevisiae) 中大于20 h，親水性平均系數(shù)( GRAVY)為0748。對氨基酸組成成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，LiAGL6 蛋白肽鏈負(fù)電荷殘基(天冬氨酸 Asp + 谷氨酸 Glu) 為30，正電荷殘基(精氨酸Arg + 賴氨酸Lys)為32，預(yù)測等電點(diǎn)(PI)為823( 7)，推測LiAGL6蛋白為堿性蛋白。將LiAGL690 華 北 農(nóng) 學(xué) 報(bào) 33 卷圖2 百合LiAGL6基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列Fig2 The open reading frame of LiAGL6 andthe amino acid sequences encoded by LiAGL6與擬南芥、番紅花( Crocus sativus)、春蘭( Cymbidiumgoeringii)、油棕( Elaeis guineensis)、風(fēng)信子( Hya-cinthus orientalis) 及海棗( Phoenix dactylifera) 的AGL6 氨基酸序列進(jìn)行同源比對，結(jié)果表明，百合Li-AGL6 蛋白與其他物種的 AGL6 蛋白一樣，在 N 端1 60個氨基酸殘基內(nèi)含有一個典型的 MADS-box結(jié)構(gòu)域，在中間90 155 氨基酸殘基內(nèi)含有一個K-domain區(qū)，在靠近C 端部分含有2 個特有的 AGL6-motif和AGL6-motif基序(圖3)。23 百合LiAGL6系統(tǒng)進(jìn)化樹分析為確定百合LiAGL6 基因的系統(tǒng)發(fā)育位置，對其進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，AP1/AGL9 亞家族有3 個分枝，分別為 SEP 分枝、AP1 分枝及 AGL6分枝，其中 AGL6 分枝與 SEP 分枝互為姊妹分枝。AGL6 分枝可分為3 個類群，分別為裸子植物類群、單子葉植物類群及雙子葉植物類群，百合 LiAGL6歸屬于AP1/AGL9 亞家族AGL6 分枝的單子葉植物L(fēng)iAGL6 百合AGL6;AtAGL6 擬南芥 AGL6( NP_182089 1); CsAGL6 番紅花 AGL6( ABK35281 1); CgAGL6 春蘭 AGL6( ADI58464 1);EgAGL6 油棕AGL6( XP_0109340131);HoAGL6 風(fēng)信子AGL6 ( AAT880881);PdAGL6 海棗AGL6( XP_0087976461)。LiAGL6 Peptide sequences of AGL6s from Lily;AtAGL6 Peptide sequences of AGL6s from Arabidopsis thaliana ( NP_182089 1);CsAGL6 Peptidesequences of AGL6s from Crocus sativus ( ABK352811);CgAGL6 Peptide sequences of AGL6s from Cymbidium goeringii ( ADI58464 1); EgAGL6Peptide sequences of AGL6s from Elaeis guineensis ( XP _ 010934013 1); HoAGL6 Peptide sequences of AGL6s from Hyacinthus orientalis( AAT880881);PdAGL6 Peptide sequences of AGL6s from Phoenix dactylifera ( XP_0087976461) 圖3 百合LiAGL6與其他植物AGL6氨基酸序列同源比對Fig3 Homology alignment of the amino acid sequences of LiAGL6 and AGL6 from other plants2 期 隋娟娟等: 重瓣百合LiAGL6 基因的克隆與表達(dá)分析 91 百合LiAGL6。 Lily LiAGL6圖4 LiAGL6蛋白與其他物種AP1/AGL6亞家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig4 Analysis of phylogenetic relationship between LiAGL6 protein and subfamily protein of AP1/AGL6 in other species類群，與風(fēng)信子的親緣關(guān)系最近(圖4)，Blast 的結(jié)果顯示，其相似度達(dá)78%，進(jìn)一步說明百合 LiAGL6基因?yàn)锳GL6 的同源基因。24 百合LiAGL6 基因亞細(xì)胞定位利用基因槍將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體 pCAM-BIA1300-GFP-LiAGL6 轟擊到經(jīng)過24 h 預(yù)培養(yǎng)的洋蔥表皮細(xì)胞中，24 h 暗培養(yǎng)后放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，空載對照 pCAMBIA1300-GFP的綠色熒光分布在整個洋蔥表皮細(xì)胞中，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及質(zhì)體中，而重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP-LiAGL6 的綠色熒光則主要分布在細(xì)胞核中(圖5)，說明百合 LiAGL6 主要在核內(nèi)發(fā)揮作用，具備轉(zhuǎn)錄因子的基本特征。25 百合LiAGL6 基因的表達(dá)分析為了確定LiAGL6 基因在百合地上部位不同組織及不同輪數(shù)花瓣中的表達(dá)差異，分別對重瓣百合的花、莖、葉及1 7 輪花瓣中的LiAGL6 基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析，結(jié)果表明，在不同的地上組織部位中，LiAGL6 基因主要在花中表達(dá)，在莖和葉中幾乎檢測不到表達(dá)，差異達(dá)顯著水平( P 005)(圖6-A);在第1 輪及3 7 輪花瓣中能檢測到LiAGL6 基因的表達(dá)，第2 輪花瓣中幾乎檢測不到表達(dá)，其中，在第7 輪花瓣中的表達(dá)量顯著高于1 6 輪花瓣中的表達(dá)量( P 005)，其次依次為第6 輪和第3 輪花瓣，第1，4，5 三輪花瓣中的表達(dá)量基本一致，差異不顯著(圖6-B)。92 華 北 農(nóng) 學(xué) 報(bào) 33 卷圖5 LiAGL6在洋蔥表皮中的亞細(xì)胞定位Fig5 Subcellular localization of LiAGL6 in onion epidermal cellsA LiAGL6 在花、莖、葉的表達(dá);B LiAGL6 在不同花瓣中的表達(dá);不同小寫字母表示差異顯著( P 005);相同小寫字母表示差異不顯著。AThe expression of LiAGL6 in flower，stem and leaf; B The expression ofLiAGL6 in different petals;The different small-letter means significant differ-ence (P 005); The same small-letter means no significant difference圖6 重瓣百合不同組織及不同花瓣中LiAGL6基因的表達(dá)分析Fig6 LiAGL6 expression in different plantorgans and different petals in double lily3 討論與結(jié)論MADS-box基因家族成員眾多，在擬南芥基因組中，即有107個成員，該家族基因參與了植物多方面的生長發(fā)育過程，特別是在生殖生長階段發(fā)揮了重要的調(diào)控作用25 26。早在20 世紀(jì)90 年代，Coen等1即提出了調(diào)控花發(fā)育的 ABC 模型來解釋植物花發(fā)育的分子機(jī)理，之后隨著擬南芥中D類和E 類基因的發(fā)現(xiàn)，ABC 模型逐漸完善為 ABCDE 模型2。本研究以雌雄蕊均發(fā)生瓣化的重瓣百合比羅尼卡為試驗(yàn)材料，從中克隆了1 個 E 類基因 AGL6，將其命名為 LiAGL6。同源比對結(jié)果顯示，LiAGL6 與其他物種的 AGL6 具有很高的同源性，除了具有典型的MADS-box結(jié)構(gòu)域、K-domain區(qū)外，在靠近C 端部分還具有 2 個特有的 AGL6-motif 和 AGL6- motif的結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的結(jié)果表明，LiAGL6歸屬于AP1/AGL9 亞家族AGL6 分枝的單子葉植物群，亞細(xì)胞定位的結(jié)果也顯示該基因編碼的蛋白主要在核內(nèi)發(fā)揮作用，符合轉(zhuǎn)錄因子的基本特征，這說明本試驗(yàn)克隆得到的LiAGL6 基因應(yīng)該為AGL6 的同源基因。常規(guī)單瓣百合的花器官具有6 枚花被片、6 枚雄蕊和1 枚雌蕊，而重瓣百合比羅尼卡缺乏正常的雌雄蕊，僅在第7 輪花瓣上偶見殘存的花藥。對重瓣百合地上組織部位進(jìn)行LiAGL6 基因的表達(dá)檢測，結(jié)果表明，LiAGL6 基因在花中的表達(dá)量最高，在莖和葉中幾乎檢測不到表達(dá)，該結(jié)果與 AGL6 基因主要在單子葉植物花中表達(dá)的模式一致27，LiAGL6基因可能與其他植物中的 AGL6 基因功能類似，在花器官的形成和發(fā)育過程中發(fā)揮了重要功能。但前人研究表明，在核心真雙子葉植物中 AGL6 基因不僅在花器官中有表達(dá)，在營養(yǎng)器官中也有表達(dá)，如葡萄中的 VvAGL6a 基因主要在其卷須中表達(dá)，VvMADS3 基因則在花和卷須中都有表達(dá)，說明AGL6基因在百合不同組織部位中的表達(dá)模式與核心真雙子葉植物存在差異27。在重瓣百合1 7 輪花瓣中LiAGL6 基因在第7 輪中的表達(dá)量最高，其次依次為第6 輪和第3 輪花瓣，但在第2 輪花瓣中幾乎檢測不到表達(dá)。盡管在絕大多數(shù)植物中 AGL6 基因主要表達(dá)部位為花，但不同植物花器官中的表達(dá)模式仍存在某些不同，如在矮牽牛中 AGL6 基因在4 輪花器官中均有表達(dá)28，在單子葉植物水稻中 AGL6類基因OsMADS6 在雄蕊中不表達(dá)，但另一個 AGL6類基因 OsMADS17 則在雄蕊中有表達(dá)20。在觀賞植物春蘭中也含有 CgAGL6-1 和 CgAGL6-3 2 個2 期 隋娟娟等: 重瓣百合LiAGL6 基因的克隆與表達(dá)分析 93AGL6 基因，其存在部分功能冗余，CgAGL6-1 在正常花的萼片、側(cè)瓣、唇瓣及蕊柱中有表達(dá)，但 CgAGL6-3在側(cè)瓣中幾乎不表達(dá)29。由此推測，可能在比羅尼卡原種單瓣百合的雄蕊中 LiAGL6 基因也不表達(dá)或表達(dá)量極低，在百合雄蕊群發(fā)生瓣化形成3 6 輪花瓣的過程中 LiAGL6 基因發(fā)揮了調(diào)控功能，而在第7輪花瓣中LiAGL6 基因表達(dá)量突然增加，推測第7 輪花瓣有可能是雌蕊發(fā)生瓣化而來，LiAGL6 基因通過增加表達(dá)量發(fā)揮了調(diào)控功能。重瓣百合中的第2 輪花瓣中幾乎檢測不到LiAGL6 基因的表達(dá)，推測LiA-GL6 在百合中可能也屬于一個功能冗余基因，極有可能存在另外的 AGL6 同源基因在第2 輪花瓣的形成過程中發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究以重瓣百合比羅尼卡為試驗(yàn)材料，從中分離得到 1 個 E 類花發(fā)育相關(guān)基因，命名為 LiA-GL6。試驗(yàn)結(jié)果表明，該基因含有744 bp 的核苷酸，編碼247 個氨基酸，具有典型的 MADS-box 結(jié)構(gòu)域、K-box區(qū)及2 個AGL6 基序，屬于AP1/AGL9 亞家族AGL6 分枝的單子葉植物類群;亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，LiAGL6 蛋白主要在核內(nèi)發(fā)揮作用; 熒光定量PCR技術(shù)分析表明，LiAGL6 基因主要在花中表達(dá)，其中，在第7 輪花瓣中的表達(dá)量最高，推測 LiAGL6可能在重瓣百合雌雄蕊瓣化過程中發(fā)揮了一定的推動作用。參考文獻(xiàn):1 Coen E S，Meyerowitz E M The war of the whorls:geneticinteractions controlling flower developmentJ Nature，1991，353(6339):31 372 Theissen G Development of floral organ identity: storiesfrom the MADS houseJ Current Opinion in Plant Biol-ogy，2001，4(1):75 853 Dreni L，Zhang D Flower development: the evolutionaryhistory and functions of the AGL6 subfamily MADS-boxgenesJ Journal of Experimental Botany，2016，67(6):1625 16384 Jin Y，Wang Y，Zhang D，et al Floral organ MADS-boxgenes in Cercidiphyllum japonicum( Cercidiphyllaceae):Implications for systematic evolution and bracts definitionJ PloS One，2017，12 (5):e01783825 敬 帆，羅登攀，馬 婧，等 蠟梅CpAGL6 基因啟動子的克隆及功能初步分析J 園藝學(xué)報(bào)，2015，42(6): 1139 11496 Cheng Z，Ge W，Li L，et al Analysis of MADS-Boxgene family reveals conservation in floral organ ABCDEmodel of moso bamboo ( Phyllostachys edulis)J Fron-tiers in Plant Science，2017，8: 6567 Yu X，Chen G，Guo X，et al Silencing SlAGL6，a to-mato AGAMOUS-LIKE6 lineage gene，generates fusedsepal and green petalJ Plant Cell Reports，2017，36(6):1 118 Shulga O A，Shchennikova A V，Beletsky A V，etal Transcriptome-wide characterization of theMADS-Box family in Pinesap Monotropa hypopitys re-veals flowering conservation in Non-photosyntheticMyco-heterotrophsJ Journal of Plant Growth Reg-ulation，2017(11):1 169 Chen F，Zhang X ，Liu X ，et al Evolutionary analysisof MIKCc-Type MADS-Box genes in gymnosperms andangiospermsJ Frontiers in Plant Science，2017，8: 89510 Carlsbecker A，Sundstrm J F，Englund M，et al Mo-lecular control of normal and acrocona mutant seed conedevelopment in norway spruce ( Picea abies) and the e-volution of conifer ovule-bearing organsJ The NewPhytologist，2013，200(1): 261 27511 Katahata S I，F(xiàn)utamura N，Igasaki T，et al Functionalanalysis of SOC1-like and AGL6-like MADS-box genes ofthe gymnosperm Cryptomeria japonicaJ Tree Genet-ics Genomes，2014，10 (2): 317 32712 Alter P，Bircheneder S，Zhou L Z，et al Floweringtime-regulated genes in maize include the transcriptionfactor ZmMADS1J Plant physiology，2016，172(1) :389 40413 Duan Y，Xing Z，Diao Z，et al Characterization of os-mads6-5，a null allele，reveals that OsMADS6 is a criticalregulator for early flower development in rice ( Oryza sa-tiva L) J Plant Molecular Biology，2012，80(4/5):429 44214 Li H，Liang W，Jia R，et al The AGL6-like gene Os-MADS6 regulates floral organ and meristem identities inriceJ Cell Research，2010，20(3):299 31315 Zhao T，Holmer R，Bruijn S，et al Phylogenomic synte-ny network analysis of MADS-Box transcription factorgenes reveals Lineage-specific transpositions，ancienttandem duplications，and deep positional conservationJ The Plant cell，2017 ，29 (6) :127816 Tsuchimoto S，Mayama T，Van Der Krol A，et al Thewhorl-specific action of a petunia class B floral homeoticgeneJ Genes to Cells，2000，5(2):89 9917 王珍華，胡立霞，鐘 丹，等 AGAMOUS like 6 亞家族基因研究進(jìn)展J 西北植物學(xué)報(bào)，2012，32( 7):1480 148718 Koo S C，Bracko O，Park M S，et al Control of lateralorgan development and flowering time by the