園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 530 540. Acta Horticulturae Sinica 530 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0343； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2017 09 01； 修回日期 ： 2018 03 05 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31260484） ；云南省科技人才和平臺(tái)計(jì)劃項(xiàng)目（ 2017HB083） ；云南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃科技領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（ 2016HA005） ；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“ 863”項(xiàng)目（ 2011AA100208） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： ynfh2007163.com， wjh0505gmail.com） 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 張藝萍1,2，瞿素萍2，楊秀梅2，馬璐琳2，許 鳳2，王繼華2,*，何月秋1,*（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650205；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國(guó)家觀賞園藝工程研究中心，云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省花卉工程技術(shù)研究中心，昆明 650205） 摘 要： 以百合抗病無性系和感病無性系為試驗(yàn)材料，開展了百合抗尖孢鐮刀菌枯萎病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以期明確抗病無性系參與抗病反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。利用蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)，對(duì)被百合尖孢鐮刀菌誘導(dǎo) 0、 24、 48 和 72 h 的抗病無性系和感病無性系進(jìn)行差異蛋白分析。經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定了 25 個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中 10 個(gè)鑒定為未知功能的蛋白，其余 15 個(gè)依據(jù)其相關(guān)功能分為 4 類，即防御反應(yīng)相關(guān)蛋白、光合作用相關(guān)蛋白、糖類及能量代謝相關(guān)蛋白和熱激蛋白。其中參與防御反應(yīng)的病程相關(guān)蛋白（推定的抗病蛋白 RPS2、推定的抗晚疫病同族蛋白 R1C-3、過氧化物酶 Q、抗壞血酸過氧化物酶和 NBS-LRR 類似蛋白）可能是百合抗病無性系介入抗病防御反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。 關(guān)鍵詞： 百合；總蛋白提取；雙向電泳；尖孢鐮刀菌百合專化型；差異蛋白質(zhì)組 中圖分類號(hào)： S 682.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 03-0530-11 Proteomics Analysis of Lily Blight Disease-resistant Clones ZHANG Yiping1,2， QU Suping2， YANG Xiumei2， MA Lulin2， XU Feng2， WANG Jihua2,*， and HE Yueqiu1,*（1College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming 650205， China；2 Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences， National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture， Yunnan Flower Breeding Key Laboratory， Yunnan Flower Engineering Center， Kunming 650205， China） Abstract： To elucidate the key proteins related to disease-resistance of lily induced by Fusarium oxysporum f. sp. lilii， protein two-dimensional gel electrophoresis technology was used to analyze profiles of the disease-resistant and susceptible clones after inoculation of Fusarium oxysporum f. sp. lilii for 0，24， 48 and 72 h. Tweenty-five differentially expressed proteins were successfully identified， including 10 differentially expressed proteins identified as unknown function proteins. The rest of the 15 differentially expressed proteins can be categorized into 4 classes according to the function， namely the defense reaction， photosynthesis， carbohydrate and energy metabolism， and heat shock-related proteins. The disease related proteins participated in the defense reaction including presumption of disease-resistant protein RPS2， putative late blight resistant protein homolog R1C-3， peroxidase Q， ascorbate peroxidase and NBS-LRR-like protein， which may play key roles in the resistance against lily blight. Keywords： lily； protein extraction； two-dimensional electrophoresis； Fusarium oxysporum f. sp. lilii；differential proteomics 張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許 鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 530 540. 531 尖孢鐮刀菌百合?；停?Fusarium oxysporum f. sp. lilii）是引起百合枯萎病的土傳真菌，很難有效防治（ van Heusden et al.， 2002； Lim et al.， 2005），選育和利用抗病品種成為主要的防治措施。采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)來挖掘百合的抗病相關(guān)蛋白，可為百合抗病細(xì)胞工程育種提供理論依據(jù)。 當(dāng)植物受到病原菌侵害時(shí)，植物將改變體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)來完成信號(hào)的感應(yīng)和傳遞，引起植物相應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制。所以病害的發(fā)生和抗病性的形成與蛋白質(zhì)的數(shù)量和功能的改變密切相關(guān)。病原菌是誘發(fā)寄主植物發(fā)病的主要生物脅迫因子。以往關(guān)于模式植物抗病分子機(jī)制研究表明，植物受病原菌脅迫時(shí)，體內(nèi)先天免疫受體（即抗病蛋白）會(huì)識(shí)別病原菌效應(yīng)因子，引發(fā)寄主抗病反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌脅迫信號(hào)的響應(yīng)、傳遞以及生物學(xué)防御（ Volk et al.， 2008； Bednarek & Osbourn， 2009； Soh et al.， 2012） 。理永霞（ 2011）利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)研究了楊樹與潰瘍病菌的互作機(jī)制，鑒定出606 個(gè)差異蛋白，其中 18 個(gè)是植物與病原菌互作相關(guān)蛋白， 10 個(gè)是過氧化蛋白， 31 個(gè)是苯丙氨酸合成代謝相關(guān)蛋白。高?。?2014）利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)研究了棉花響應(yīng)黃萎病菌的分子機(jī)制，共得到 188 個(gè)差異蛋白，其中參與細(xì)胞過程、代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)的蛋白數(shù)量最多，這些蛋白共同參與了棉花對(duì)黃萎病菌入侵的響應(yīng)。王曉清（ 2014）利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)研究了擬南芥抗病突變體 cpr30 的抗病機(jī)制，鑒定出了 33 個(gè)差異蛋白點(diǎn)，這些差異表達(dá)蛋白包括防御相關(guān)蛋白、氧化還原相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白等。 目前，關(guān)于百合枯萎病的研究主要集中于防治方法、 病原菌鑒定、 種質(zhì)資源抗性評(píng)價(jià)等方面 （張麗麗， 2013；魏志剛， 2014；羅建讓和謝松林， 2015） 。有關(guān)百合抗病機(jī)制的研究報(bào)道較少（饒建，2013） 。前期通過百合尖孢鐮刀菌毒素加壓篩選獲得了百合抗病性無性系（ Zhang et al.， 2014） ，為揭示其抗性機(jī)制，開展了百合抗病無性系和感病無性系的差異蛋白質(zhì)組研究，通過對(duì)抗性相關(guān)蛋白的差異表達(dá)分析，可從分子水平直接了解百合抗病無性系所啟動(dòng)的抗性機(jī)制。 1 材料與方法 1.1 植物材料和取樣方法 供試菌種百合枯萎病菌和東方百合品種卡薩布蘭卡抗病無性系和感病無性系均來自本實(shí)驗(yàn)室， 2014 年反復(fù)篩選并經(jīng)過抗性鑒定獲得。卡薩布蘭卡抗病無性系為中抗，病情指數(shù)為 28。本試驗(yàn)在 2015 2016 年在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 取抗病無性系和感病無性系生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的組培生根苗，以 1 × 106個(gè) · mL-1（含 0.01%吐溫 20，體積比）百合尖孢鐮刀菌孢子懸浮液浸泡組培苗根部（根部切去一部分以便創(chuàng)造傷口） ， 25 下光照 12 h/黑暗 12 h 交替培養(yǎng)。分別于接種前和接種后 24、 48 和 72 h 隨機(jī)選取 9 株組培苗的葉片，液氮固定后于 80 冰箱保存?zhèn)溆?，?3 株作為 1 個(gè)重復(fù)，共 3 次重復(fù)。 1.2 百合葉片總蛋白提取 采用三氯乙酸（ TCA）丙酮法提取蛋白質(zhì)（ Blacks & Wei， 1999）。準(zhǔn)確稱取東方百合品種卡薩布蘭卡抗病無性系和感病無性系、接種百合枯萎病菌后 24 和 48 h 的百合葉片各 2 g，于液氮中迅速研磨成粉末。取 20 mL 10%三氯乙酸丙酮溶液（含 1%苯甲基磺酰氟和 1 mg · mL-1二硫蘇糖醇） ， 將研缽內(nèi)粉狀物清洗至 50 mL 離心管中， 迅速置于 20 冰箱中保存過夜； 而后 20 000 r · min-1離心 20 min； 棄上清液； 量取 20 mL 80%的預(yù)冷丙酮溶液 （含 1%苯甲基磺酰氟和 1 mg · mL-1二硫蘇糖醇）加入離心管中，振蕩后于 20 冰箱中放置 2 h，使蛋白質(zhì)沉降； 4 ， 20 000 r · min-1Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 532 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 離心 15 min，棄上清液；重懸沉淀于等體積 80%的預(yù)冷丙酮溶液各洗滌 2 次； 4 ， 15 000 r · min-1離心 15 min；沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥后，置于 80 超低溫冰箱中保存。 1.3 蛋白質(zhì)樣品溶解與定量 將 450 µL 裂解液（ 7 mol · L-1尿素， 2 mol · L-1硫脲， 40 mg · mL-1 CHAPS， 65 mmol · L-1DTT和 0.2% Bio-Lyte）加入到 30 mg 蛋白干粉中，裂解 1 h； 4 ， 12 000 r · min-1離心 15 min，上清液中加入 1 600 2 000 µL 無水丙酮（含 1 mg · mL-1二硫蘇糖醇） ，邊加邊搖勻， 20 冰箱中放置2 h， 4 ， 15 000 r · min-1離心 30 min，棄上清液；加入 1 mL 4 預(yù)冷的超純水（含 1 mg · mL-1二硫蘇糖醇） ， 4 ， 15 000 r · min-1離心 25 min，棄上清液；加入 7 mol · L-1水化液（含 0.2%載體兩性電解質(zhì)和 0.1 mg · mL-1二硫蘇糖醇） 150 200 µL。蛋白質(zhì)的定量參考 Bradford 的方法進(jìn)行測(cè)定（ Gurusamy & Christof， 2006） 。 1.4 雙向電泳 第一向等點(diǎn)聚焦選用 11 cm 非線性 pH 4 7 的 IPG 膠條（ Bio-Rad 公司） 。蛋白樣品溶液中加入水化緩沖液（ 2 mol · L-1的硫脲， 7 mol · L-1的尿素， 40 mg · mL-1的 CHAPS， 10 mg · mL-1的 DTT，0.4%的 Bio-Lyte 和 0.001%溴酚藍(lán)）至終體積 300 µL，蛋白樣品上樣量為 600 µg； 20 下按 Bio-Rad 公司提供的等電聚焦程序設(shè)定后聚焦。聚焦完畢，將 IPG 膠條放入平衡液（ 6 mol · L-1尿素， 20 mg · mL-1SDS， 0.375 mol · L-1 pH 8.8 Tris-HCl， 20%甘油， 10 mg · mL-1DTT）中并置于搖床上， 30 40 r · min-1，搖動(dòng) 15 min，隨后再放入平衡液（ 6 mol · L-1 的尿素， 20 mg · mL-1的 SDS， 0.375 mol · L-1pH 8.8 Tris-HCl， 20%甘油， 5%碘乙酰胺）中并置于搖床上， 30 40 r · min-1，搖動(dòng) 15 min，平衡結(jié)束后進(jìn)行第二向凝膠電泳。將平衡好的 IPG 膠條推進(jìn) 12.5%的聚丙烯酰胺凝膠上，使用Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac（ 11 cm IPG 膠條）的電泳系統(tǒng)進(jìn)行電泳， 11 的循環(huán)水冷卻；開始時(shí)電壓設(shè)置為每板 100 V（ Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac） ，當(dāng)溴酚藍(lán)完全進(jìn)入凝膠后加大電壓為每板 400 V（ Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac） ，待溴酚藍(lán)跑至聚丙烯酰胺凝膠底部的距離為 0.5 cm 時(shí)，終止電泳（李勤， 2011） 。 1.5 染色及圖像采集分析 凝膠先用固定液（ 40%乙醇和 10%乙酸）固定 1 3 h，用超純水清洗 2 次，再用染色液（ 100 mg · mL-1硫酸銨， 10%磷酸， 0.12 mg · mL-1G-250， 20%甲醇）染色 1 d，而后用超純水漂洗后再用脫色液（ 50 mg · mL-1硫酸銨， 10%甲醇）脫色，直到背景干凈，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰為止。采用伯樂蛋白質(zhì)掃描儀（ Bio-Rad GS900）掃描凝膠圖像（分辨率為 300 dpi） ，用 Bio-Rad 的 PD Quest 8.0 軟件進(jìn)行凝膠電泳圖譜的斑點(diǎn)檢測(cè)。 1.6 差異蛋白點(diǎn)酶解處理及質(zhì)譜分析 將差異表達(dá)蛋白點(diǎn)從凝膠上切下來，通過膠內(nèi)原位酶解方法，抽提酶解肽段，再經(jīng)過 Zip Tip脫鹽、酶解液真空濃縮等完成酶解處理（張彩霞 等， 2015）。濃縮后的酶液用 ABI 4800 MALDI TOF/TOF 串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ Applied Biosystems， Foster City， CA）進(jìn)行肽指紋圖譜（ PMF）鑒定。質(zhì)譜操作采用正離子反射模式，質(zhì)譜分析使用標(biāo)準(zhǔn)肽混合物 904.458， Gradykinin； 1296.685，Angiotensin； 1570.677 Glul-Fibrinopeptide； 2093.08， ACTH（ 1-17）； 2465.199， ACTH（ 18-39）；3657.929， ACTH（ 7-38）（ ABI4700 Calibration Mixture）作為外標(biāo)校正，每個(gè)樣品質(zhì)譜信號(hào)累張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許 鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 530 540. 533 計(jì)掃描 600 800 次，掃描范圍為 800 4 000 D 得到鑒定蛋白的肽指紋圖譜。從一級(jí)質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜中選擇信噪比（ S/N）大于 50 的 7 個(gè)得分最高的前體離子做 MS/MS 分析，質(zhì)譜信號(hào)累計(jì)掃描 900 1 200 次，得到其序列信息，對(duì)一級(jí)質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。 1.7 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 酶解樣品經(jīng)過質(zhì)譜檢測(cè)后得到 PMF 圖譜數(shù)據(jù)， 從 GPS Explorer 軟件 （ V3.6， Applied Biosystems）得到 MS 和 MS/MS 的數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)。搜庫(kù)的參數(shù)設(shè)置如下：種類 all species，切割酶 Trypsin，允許最大未酶切位點(diǎn)（ Missed cleavage）數(shù)為 1，部分修飾為 cysteine carboamido methylated 和 methionine oxidized，無固定修飾。 MS 的誤差 150 200 mg · mL-1， MS/MS 的誤差為0.2 0.3 D， 去除已知污染物 keratin。 得分 （ MS 和 MS/MS 聯(lián)合） 超過 65 被認(rèn)為超過閾值 （ P 0.05） ，為可信的鑒定結(jié)果。 1.8 鑒定蛋白質(zhì)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá) 從鑒定出的蛋白質(zhì)中選取與抗病性緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，并以百合感病無性系為對(duì)照，計(jì)算其在百合抗病無性系中 24、 48 和 72 h 的表達(dá)倍數(shù)。 2 結(jié)果與分析 2.1 百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌后的癥狀表現(xiàn) 百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌 7 d 后，抗病無性系僅見輕微的癥狀，小鱗莖基部稍發(fā)褐， 而感病無性系則發(fā)生明顯的枯萎病癥狀，葉片萎蔫，小鱗莖基部褐化， 并見白色菌絲 （圖 1） 。 圖 1 百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌后的癥狀 Fig. 1 Symptom induced by Fusarium oxysporum f. sp. lilii in disease-resistant and susceptible clones 2.2 百合抗病無性系和感病無性系的雙向電泳圖譜分析 對(duì)抗病無性系和感病無性系及其接種尖孢鐮刀菌后 24、 48 和 72 h 的葉片總蛋白進(jìn)行分析，經(jīng)雙向電泳分離后獲得清晰的蛋白質(zhì)表達(dá)譜（圖 2）。 Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 534 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 圖 2 百合抗病無性系和感病無性系接菌不同時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)雙向電泳圖 Fig. 2 Separation 2-D profiles of lily disease-resistant and susceptible clones for different time inoculated by Fusarium oxysporum f. sp. lilii 張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許 鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 530 540. 535 4 組凝膠圖譜經(jīng) PD Quest 2-D Analysis Software 8.0 軟件分析，每張圖譜上均有 800 個(gè)以上可重復(fù)清晰蛋白點(diǎn)被檢測(cè)到， 蛋白點(diǎn)主要分布在 pH 4 7， 分子量為 10 000 150 000 D 的區(qū)域內(nèi)。 通過 PD Quest 軟件計(jì)算蛋白點(diǎn)相對(duì)豐度的變化，可初步獲得差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)。 4 組圖譜差異分析結(jié)果顯示，有 25 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)生變化（相對(duì)體積增加或者降低 1.5 倍）。 2.3 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜分析及功能鑒定 對(duì)檢驗(yàn)出的 25 個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜（ MALDI-TOF/TOF MS）分析，根據(jù)各蛋白點(diǎn)鑒定所得PMF 圖譜數(shù)據(jù)，去除雜峰后，進(jìn)入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配檢索。在鑒定的差異蛋白中共包括 4 個(gè)下調(diào)蛋白和 21 個(gè)上調(diào)蛋白（圖 3，表 1）。 圖 3 百合抗病無性系和感病無性系接種尖孢鐮刀菌后 0、 24、 48 和 72 h 差異蛋白點(diǎn)表達(dá)圖譜放大圖 Fig. 3 Enlarged views of differential protein spots of lily disease-resistant and susceptible clones for 0， 24， 48 and 72 h inoculated by Fusarium oxysporum f. sp. lilii Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 536 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 表 1 通過質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定出來的差異蛋白點(diǎn) Table 1 Identification of differential proteins of lily disease-resistant clone and susceptible clone with MALDI-TOF/TOF and database searching 斑點(diǎn)編號(hào) Spot No. 蛋白名稱 Protein name 登錄號(hào) Accession No. 蛋白分子量 /等電點(diǎn)Protein MW/pI 物種 Species 蛋白得分 Protein score 可能的功能 Possible function S1 二磷酸核酮糖羧化 /加氧酶 Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase gi|134035003 15 036.4/4.35 花生 Arachis hypogaea 204 光合作用 Phytosynthesis S2 未知 Unknown gi|217072704 29 191.6/4.7 蒺藜狀苜蓿 Medicago truncatula 57 未知蛋白 Unknown protein S3 未知蛋白 Uncharacterized protein LOC100286153 gi|226531522 84 417.3/5.85 玉米 Zea mays 157 未知蛋白 Unknown protein S4 琥珀酸脫氫酶 Succinate dehydrogenase gi|255579273 68 462.8/6.18 蓖麻 Ricinus communis 49 三羧酸循環(huán)代謝 TCA metabolic A1 代謝轉(zhuǎn)運(yùn)超級(jí)家族 Drug/Metabolite transporter superfamily gi|303277003 37 909.1/10.07 微胞藻 Micromonas pusilla CCMP1545 51 能量代謝 Energy metabolismA2 假設(shè)蛋白 Hypothetical protein VITISV_001216 gi|147804938 97 671.3/6.12 葡萄 Vitis vinifera 43 未知蛋白 Unknown protein A3 假設(shè)蛋白 Hypothetical protein OsI_04745 gi|125528674 102 532.4/6.35 秈稻 Oryza sativa Indica Group 64 未知蛋白 Unknown protein A4 預(yù)測(cè)蛋白 Predicted protein gi|224094841 50 820.5/6.4 毛果楊 Populus trichocarpa 51 未知蛋白 Unknown protein A5 放氧增強(qiáng)蛋白 1 Oxygen-evolvingenhancer protein 1， chloroplasticgi|11133881 34 847.8/6.26 田野貝母 Fritillaria agrestis 247 光合作用 Photosynthesis A6 抗病蛋白 RPS2 Disease resistant protein RPS2 gi|255581680 128 309.3/5.84 蓖麻 Ricinus communis 54 防御反應(yīng) Defense response A7 熱激蛋白 Heat shock protein gi|255545176 80 723.1/ 4.99 蓖麻 Ricinus communis 164 保護(hù)反應(yīng) Protect response A8 預(yù)測(cè)蛋白 Predicted protein gi|326490934 48 201.4/5.39 青稞 Hordeum vulgare subsp. vulgare 61 未知蛋白 Unknown protein A9 二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶大 亞基結(jié)合蛋白 Rubisco large subunit-binding protein subunit beta， chloroplastic gi|2506277 62 945.3/5.85 豌豆 Pisum sativum 226 光合作用 Phytosynthesis A10 假設(shè)蛋白 Hypothetical protein gi|50726121 15 823.1/11.7 粳稻 Oryza sativa Japonica Group 58 未知蛋白 Unknown protein B1 假設(shè)蛋白 Hypothetical protein OsJ_11623 gi|222625312 65 595.5/9.68 粳稻 Oryza sativa Japonica Group 60 未知蛋白 Unknown protein B2 推定抗晚疫病蛋白同族 R1C-3 Putative late blight resistant protein homolog R1C-3 gi|75261520 149 682.2/5.84 馬鈴薯野生種 Solanum demissum 43 防御反應(yīng) Defense response B3 熱激蛋白 Heat shock protein 90 gi|260505494 90 303.7/4.92 牽?；?Ipomoea nil 121 保護(hù)反應(yīng) Protect response B4 Os07g0136500 gi|297606704 13 014.7/10.88 粳稻 Oryza sativa Japonica Group 51 未知蛋白 Unknown protein B5 過氧化物酶 Peroxiredoxin Q gi|215254425 23 574.1/9.37 海篷子 Salicornia herbacea 66 防御反應(yīng) Defense response B6 熱激蛋白 Heat shock protein 70 gi|189380223 75 068.5/5.54 茶樹 Camellia sinensis 193 保護(hù)反應(yīng) Protect response C1 假設(shè)蛋白 Hypothetical protein CHLNCDRAFT_20689 gi|307109747 14 424.3/7.04 小球藻 Chlorella variabilis 60 未知蛋白 Unknown protein C2 推定的烏頭酸水合酶 Putative aconitate hydratase，cytoplasmic gi|75225211 98 020.6/5.67 粳稻 Oryza sativa Japonica Group 54 糖類代謝 Carbohydrate metabolism C3 抗壞血酸過氧化物酶 Ascorbate peroxidase gi|223931154 27 282.7/5.21 五唇蘭 × 蝴蝶蘭的雜交種 Doritis pulcherrima × Phalaenopsis hybrid 160 防御反應(yīng) Defense response C4 推定的乙烯反應(yīng)蛋白 Putative ethylene-responsive protein gi|21536534 18 726.4/5.59 擬南芥 Arabidopsis thaliana 45 防御反應(yīng) Defense response C5 NBS-LRR 類似蛋白 NBS-LRR-like protein gi|332002196 19 088.0/8.65 山荊子 Malus baccata 50 防御反應(yīng) Defense response 張藝萍，瞿素萍，楊秀梅，馬璐琳，許 鳳，王繼華，何月秋 . 百合抗病無性系抗枯萎病的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 530 540. 537 將所鑒定的蛋白點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及相關(guān)的文獻(xiàn)查閱，共獲得 25 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的功能信息。其中 10 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定為未知功能蛋白（ S2、 S3、 A2、 A3、 A4、 A8、 A10、 B1、 B4、 C1），其余15 個(gè)依據(jù)其相關(guān)功能分為 4 類。防御反應(yīng)相關(guān)蛋白共包括 6 個(gè)，即推定的抗病蛋白 RPS2（ A6）、推定的晚疫病同族蛋白 R1C-3（ B2）、過氧化物酶 Q（ B5）、抗壞血酸過氧化物酶（ C3）、推定的乙烯反應(yīng)蛋白（ C4）和 NBS-LRR 類似蛋白（ C5），呈明顯上調(diào)表達(dá)。光合作用相關(guān)蛋白（ S1、 A5、A9）除了二磷酸核酮糖羧化加氧酶（ S1）下調(diào)表達(dá)外，其他 2 個(gè)蛋白均呈明顯上調(diào)表達(dá)。鑒定獲得3 個(gè)糖類及能量代謝相關(guān)蛋白（ S4、 A1、 C2），均呈上調(diào)表達(dá)。此外，還鑒定得到 3 個(gè)熱激蛋白（ A7、B3、 B6），均呈下調(diào)表達(dá)。 2.4 百合受尖孢鐮刀菌侵染后的蛋白質(zhì)差異表達(dá) 對(duì)差異蛋白 A6、 B5 和 C5 的分析發(fā)現(xiàn)，三者在百合抗病無性系中的表達(dá)量均比在感病無性系中高，呈上調(diào)表達(dá)， A6 在抗病無性系中的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加； B5 在抗病無性系中的表達(dá)量呈先上升后降低的趨勢(shì)； C5 在抗病無性系中的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低（圖 4，表 2）。 圖 4 差異蛋白 A6、 B5、 C5 在百合抗病無性系和感病無性系中不同時(shí)間的表達(dá) Fig. 4 The A6， B5 and C5 expression of differential time points in lily disease-resistant and susceptible clones 表 2 相對(duì)于感病無性系 A6、 B5 和 C5 在百合抗病無性系中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá) Table 2 The A6， B5 and C5 expression of differential time points in lily disease-resistant clones 蛋白點(diǎn) Protein 24 h 48 h 72 h A6 + 2.6 + 2.0 + 1.8 B5 + 2.5 + 3.7 + 1.6 C5 + 2.7 + 2.5 + 2.4 注： + 表示增量。 Note： + Indicates increment. Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 538 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 530 540. 3 討論 3.1 光合作用和能量代謝相關(guān)蛋白參與百合的防衛(wèi)反應(yīng) 病原菌的侵入對(duì)寄主植物最明顯的影響就是干擾其光合作用（ Christelle et al.， 2017）。 Rubisco是卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一。有學(xué)者經(jīng)過分析外源 JA 誘導(dǎo)下馬鈴薯葉片蛋白質(zhì)組的變化，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè) Rubisco 蛋白表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)（楊艷麗， 2010）。還有學(xué)者證明了 Rubisco 可因活性氧的產(chǎn)生而受到抑制，從而表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)（ Chen et al.， 2013）。本研究中通過分析百合抗病無性系和感病無性系的差異蛋白質(zhì)，鑒定獲得了 3 個(gè)與光合作用相關(guān)的蛋白。其中兩個(gè)為 Rubisco（ S1、 A9）的蛋白質(zhì)， S1 的表達(dá)量表現(xiàn)為下調(diào)，而 A9 的表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)，這可能與百合抗病無性系植株細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)。 本研究鑒定獲得 4 個(gè)糖類代謝及能量代謝相關(guān)的蛋白，有 2 個(gè)蛋白（ S4、 A10）參與三羧酸循環(huán)， 1 個(gè)蛋白（ A1）參與代謝轉(zhuǎn)運(yùn)， 1 個(gè)蛋白（ C2）參與碳水化合物的代謝，均呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)。這就表明百合抗病無性系植株可能是通過調(diào)控能量代謝途徑，從而為完成抗病反應(yīng)提供物質(zhì)能量。 3.2 防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)蛋白是抗病的關(guān)鍵因素 病程相關(guān)（ pathogenesis-related， PR）蛋白是寄主植物中普遍存在的一類具有廣譜抗病性的可溶性蛋白（ Gloria et al.， 2013），病程相關(guān)蛋白主要有 1,3葡聚糖酶（ PR-2）、幾丁質(zhì)酶（ PR-3）、過氧化物酶類（ PR-9）、過敏反應(yīng)相關(guān)的 PR 蛋白（ PR-10）（ Loon et al.， 2006； I