2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4灰 霉病是一種常見的真菌性病害 ， 是葡萄 、番茄 、草莓 、黃瓜等經(jīng)濟(jì)作物種植過程以及在采摘保鮮過程中常見且為害巨大的病害1-4，也 是花卉栽培中常見病害5。 該病尤其是在設(shè)施條件下種植的蔬菜 、花卉中常見發(fā)生 ，防治不及時(shí)極易造成較大損失 ?；颐共〉牟≡鷮儆谡婢?囊菌綱核盤菌科葡萄孢屬 。 目前葡萄孢屬約有 30 個(gè) 種6，其中大部分種可導(dǎo) 致植物病害 。萬壽菊是常見的草本花卉 ，由于其抗性好 、病蟲害少 、栽培簡單 、耐粗放管理 ，已成為花境 、花壇 、道路裝飾的主要植物材料 。除了觀賞價(jià)值 ，萬壽菊花朵還是含保健成分 葉黃素含量最豐富的植 物組織 ，是目前天然葉黃素提取的主要原料 。 近幾年 ，伴隨國內(nèi)人民生活水平的普遍提高 ， 天然葉黃素需求逐年增加 ，間接帶動(dòng)了萬壽菊種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 。在北京延慶 ， 大面積種植的色素萬壽菊不僅為葉黃素提取提供了原料 ， 同時(shí)打造的花海景觀也帶動(dòng)了觀光旅游 、餐飲等產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展 ，有效帶動(dòng)了當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富 。萬壽菊通過種子繁殖 ， 商業(yè)化的萬壽菊種子主北 京萬壽菊灰霉病病原菌分離鑒定陳 東亮1， 李 明遠(yuǎn)1， 程 曦1， 李 雪梅1， 王 玲玲1，2， 黃 叢林1（1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心 /北京市功能花卉工程技術(shù)研究中心 /農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，北 京 100097； 2. 西 藏農(nóng)牧學(xué)院 ，西藏 林芝 860000）摘 要 ： 對(duì)北京四海色素萬壽菊制種溫室發(fā)生的疑似灰霉病調(diào)查發(fā)現(xiàn) ，萬壽菊植株發(fā)生葉片水漬狀枯斑 、萎蔫等 ，嚴(yán)重的甚至整株枯萎死亡 ，造成了重大損失 。 為明確其病原 ，對(duì)病原菌進(jìn)行了分離 、培養(yǎng)和快速致病性測(cè)定 ，并對(duì)分離的菌株進(jìn)行 DNA提取和基因序 列分析 。 結(jié)合生物學(xué)特征和基于基因序列的分子進(jìn)化樹分析 ，鑒定該病原菌為灰葡萄孢 （Botrytis cinerea）。關(guān)鍵詞 ： 萬壽菊 ； 灰霉病 ； 灰葡萄孢 ； 鑒定中圖分類號(hào) ：S435.672； S432.44 文 獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ：A 文 章編號(hào) ：1672-6820（2018）04-0011-06收 稿日期 ：2017-10-24； 修 回日期 ：2018-01-15基 金項(xiàng)目 ：北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新基金 （JNKST201610、KJCX20170108）；北京市科技計(jì)劃課題 （Z161100001116091）；北京市功能花卉工程技術(shù)研究中心創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目作者簡介 ：陳東亮 ，博士 ，助理研究員 ，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué) 。 E-mail：dlchen1984126.com*通 訊作者 ：黃叢林 ，博士 ，研究員 ，研究方向?yàn)榛ɑ苄缕贩N培育與栽培技術(shù)研究 。 E-mail：conglinh126.com。Pathogen isolation and identification of grey mold on marigold in BeijingChen Dongliang1, Li Mingyuan1, Cheng Xi1, Li Xuemei1, Wang Lingling1,2, Huang Conglin1（1. Beijing Agricultural Technology Research Centre, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science / BeijingFunction Flowers Engineering Technology Research Center/ Beijing Key Laboratory of Agricultural Gene Resource andBiological Technology, Beijing 100097, China; 2. Tibet College of Agricultural and Animal Husbandry, Linzhi Tibet860000, China）Abstract: Suspected grey mold disease was investigated in Sihaisesu greenhouse of marigold seed production bases inBeijing, where symptoms of hygrophanous spot and wilts on marigold and even dead plant with heavy loss were found. Thepathogen was isolated and cultured， DNA extraction of the isolated strains were conducted, and the sequences of g3pdh、hsp60 and rbp2 were analyzed. Based on biological characteristics and molecular evolutionary tree of particular genes, thepathogen was identified as Botrytis cinerea.Key words: marigold; grey mold; Botrytis cinerea; identification11· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4拉 丁名 菌株號(hào)GenBank 登 陸號(hào)rbp2 hsp60 g3pdhB. aclada PRI006 AJ745665 AJ716051 AJ704993B. allii MUCL403 AJ745666 AJ716055 AJ704996B. byssoidea MUCL94 AJ745670 AJ716059 AJ704998B. calthae CBS175.63 AJ745671 AJ716060 AJ704999B. caroliniana CB15 JF811590 JF811587 JF811584B. convoluta 9801 AJ745679 AJ716068 AJ705007B. cinerea SAS56 AJ745677 AJ716067 AJ705006B. croci MUCL436 AJ745681 AJ716070 AJ705009B. deweyae CBS134649 HG799518 HG799519 HG799521B. elliptica BE9714 AJ745684 AJ716073 AJ705012B. fabae CBS109.57 AJ745685 AJ716074 AJ705013B. fabiopsis BroadbeanBC-2 EU514473 EU514482 EU519211B. ficariarum CBS176.63 AJ745687 AJ716076 AJ705015B. galanthina MUCL435 AJ745689 AJ716079 AJ705018B. gladiolorum 9701 AJ745691 AJ716080 AJ705019B. globosa MUCL444 AJ745693 AJ716083 AJ705022B. hyacinthi 0001 AJ745695 AJ716084 AJ705023B. narcissicola MUCL18857 AJ745698 AJ716086 AJ705025B. paeoniae MUCL16084 AJ745700 AJ716089 AJ705028B. pelargonii CBS497.50 AJ745662 AJ716046 AJ704990B. polyblastis MUCL21492 AJ745703 AJ716092 AJ705031B. porri MUCL3234 AJ745704 AJ716093 AJ705032B. pseudocinerea 10091 NJ692428 JN692400 JN692414B. ranunculi CBS178.63 AJ745706 AJ716095 AJ705034B. sphaerosperma MUCL21481 AJ745708 AJ716096 AJ705035B. squamosa PRI026 AJ745707 AJ716100 AJ705039B. tulipae BT9830 AJ745713 AJ716102 AJ705041B. sinoallii OnionBC-23 EU514479 EU514488 EU519217B. sinoviticola GBC-3-3c JN692424 JN692396 JN692410表 1 進(jìn)化樹構(gòu)建用到的葡萄孢屬 （Botrytis sp.）菌 株及序列要通過雜交的方式獲得 。為 了獲得高產(chǎn) 、質(zhì)量穩(wěn)定的種子 ，雜交親本需要在設(shè)施條件下栽培 ，以減小不良自然條件對(duì)種子產(chǎn)量和質(zhì)量的影響 。然而 ，設(shè)施條件下的小氣候環(huán)境也為病害的發(fā)生創(chuàng)造了條件 。 2017年 7 月 初 ，在北京延慶四海鎮(zhèn)萬壽菊制種溫室內(nèi) ，制種親本圃發(fā)生嚴(yán)重病害 ，植株普遍出現(xiàn)整枝 、整株的萎蔫 ，嚴(yán)重的枯萎死亡 ，造成了重大損失 。 為明確病原 ，對(duì)其病原菌進(jìn)行了分離 、培養(yǎng) ，并結(jié)合形態(tài)特征和分子檢測(cè)手段對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定 ， 為進(jìn)一步制定科學(xué)合理的防治措施奠定了基礎(chǔ) 。1 材 料與方法1.1 病原菌的分離與培養(yǎng)于北京延慶區(qū)四海鎮(zhèn)萬壽菊發(fā)病溫室內(nèi) ， 采 集萬壽菊發(fā)病植株枝條 ， 裝入干凈的保鮮袋中帶回實(shí)驗(yàn)室 ，于 4 冷藏箱中保存?zhèn)溆?。 將 其葉片去除 ，用自來水刷洗枝條表面 ，并將其剪成 35 cm 的 莖段 。依次用 70%乙 醇浸泡 3 min，1%次 氯酸鈉浸泡 3min 對(duì)莖段表面消毒 ，最 后無菌水沖洗干凈后 ，在超凈臺(tái)中剝?nèi)ブl外皮層 ， 內(nèi)部組織切成 0.20.3 cm12· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4小 塊 ，分別放置到 6 cm PDA 培養(yǎng)基平板中心 ，于 25進(jìn) 行恒溫培養(yǎng) 。 待菌絲生長至滿培養(yǎng)皿時(shí) ，轉(zhuǎn)入 L/D=12 h/12 h 光暗交替培養(yǎng)箱進(jìn)行孢子誘發(fā) 。 誘 發(fā)的孢子用無菌水沖洗下來 ， 取少量涂布于新的 PDA 培養(yǎng) 基中 ，在超凈臺(tái)無菌環(huán)境于顯微鏡下挑取單孢子 。單孢子于 PDA 培 養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)出菌絲及孢子后 ，在顯微鏡下觀察孢子梗 、孢子等形態(tài)特征 ，并拍照 。1.2 萬壽菊培養(yǎng)與快速致病性檢測(cè)將 萬壽菊種子撒播于草炭 蛭 石 （11）基 質(zhì)中 ，覆蓋透明塑料布保濕 ，置于植物培養(yǎng)箱中 ，25 下 于 L/D=16 h/8 h 光 暗交替培養(yǎng) ，待種子發(fā)芽后去掉塑料布 。 種子苗長至 35 片 真葉時(shí) ，移栽入 10 cm 穴 盤中 ，于溫室中進(jìn)行正常培養(yǎng) 。待植株生長至 15 cm 左 右高時(shí) ，采取羽狀復(fù)葉進(jìn)行分離物致病性的快速檢測(cè) 。離體葉片快速檢測(cè)的步驟 ：9 cm 培 養(yǎng)皿鋪 3 層 滅菌濾紙 ，噴灑無菌水至濾紙濕透 ；剪取新鮮萬壽菊葉片 ，除去頂部小葉至剛好能放入培養(yǎng)皿中 ；取少量帶有 （病菌 ）菌絲的培養(yǎng)基塊 ，放置于葉片葉柄基部 ，蓋上培養(yǎng)皿保濕 ，在25 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 以濕潤的無菌棉球 替換菌塊做陰性對(duì)照 ，每個(gè)處理設(shè)置 3 個(gè) 生物學(xué)重復(fù) 。1.3 DNA 提取與基因測(cè)序凍融法快速提取 單孢系菌絲 DNA：無 菌槍頭挑取少量新鮮菌絲 ，置于預(yù)裝有 100 L 無 菌水的 1.5mL 離 心管中 ， 渦旋振蕩使菌絲松散 ； 沸水浴 510min， 迅 速置于液氮中冷凍 35 min； 室 溫解凍 ，12 000 r/min 離 心 5 min，上 清液即 DNA 溶 液 ，可直接做 PCR 擴(kuò) 增的模板 ， 用于擴(kuò)增 g3pdh、hsp60 及rbp2 基因片段的引物序列7。 20 L 的 PCR 反 應(yīng)體系 ：Vazyme2×mix 10 L （南 京諾唯贊生物科技有限公司 ），上下游引物各 0.5 L（10 mol/L），模板 9L。PCR 產(chǎn) 物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) ，預(yù) 期條帶經(jīng)純化回收后連接于克隆載體 pGEM T-easy（Promega，USA），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5，陽 性克隆送生工生物 （上海 ）股份有限公司測(cè)序 。1.4 序列分析與進(jìn)化樹構(gòu)建測(cè) 序結(jié)果利用 DNA Star 5.01 軟件進(jìn)行拼接和初 步處理 。 3 個(gè) 基因序列按 g3pdh、hsp60、rbp2 的 順序依次拼接成一個(gè)聚合序列 ， 兩端及不同序列間加保護(hù)性堿基區(qū)分 。 Clusxtal 1.83 軟件進(jìn)行序列的比對(duì) 分析 ，采用 MEGA 4.0 軟件中的鄰接法 （Neighbor-Joining，NJ）法 構(gòu)建不同株系基于 3 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹 ，靴 帶值 （Bootstrap value）設(shè) 置為 1 000。 參 與進(jìn)化樹構(gòu)建的其他葡萄孢屬菌株的 G3DPH、HSP60 及RBP2 基因序列均下載自美 國國立生物技術(shù)信息中心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù) 據(jù)庫 ，各序列 GenBank 收 錄號(hào) 、菌株號(hào) 、拉丁名等信息見表 1。2 結(jié) 果與分析2.1 萬壽菊灰霉病病害特征北京延慶區(qū)萬壽菊雜交制種溫室發(fā)生的萬壽菊灰霉病在感染初期 ， 其癥狀主要表現(xiàn)為部分葉 片頂部黃化并出現(xiàn)水漬狀枯斑 （圖 1a）， 隨著病情的發(fā)展 ，整個(gè)葉片萎蔫 ，逐漸在莖稈上近葉柄基礎(chǔ)處可見黑色條斑 （圖 1b）， 進(jìn)一步發(fā)展為整個(gè)枝條的萎蔫（圖 1c），最終整個(gè)枝條甚至整株枯萎死亡 （圖 1d）。病害在多個(gè)制種溫室普遍發(fā)生， 初步統(tǒng)計(jì) ，8 月 下旬 ，伴有整枝或整株枯死的植株在 25%左 右 。 此時(shí)為雜交制種的關(guān)鍵期 ， 病害發(fā)生對(duì)種子產(chǎn)量和品質(zhì)造成了較大影響 。2.2 病原菌的分離與致病性檢測(cè)從帶病的萬壽菊枝條分離得到 3 個(gè) 分離物 。 其分離物進(jìn)一步通過挑單孢子 ，得到 6 個(gè) 單孢系 。獲得的單孢系采用離體葉片侵染的方法進(jìn)行檢測(cè) ， 在接種后的 34 d 內(nèi) 均可見明顯水漬狀枯死斑 ， 并由靠近葉柄的小葉逐漸發(fā)展至整個(gè)葉片 。 這種水漬狀枯死斑與田間發(fā)現(xiàn)的葉尖部枯死斑類似（ 圖 2），而對(duì)照未發(fā)現(xiàn)類似枯死斑 （圖 2CK），表明本研究分離獲得的即為田間病害的病原菌 。2.3 病原菌形態(tài)特征分 離自萬壽菊的病原菌接種于 6 cm PDA 平 板培養(yǎng)基 ，于生化培養(yǎng)箱中 25 恒 溫培養(yǎng) 2 d，白 色霧狀菌絲可覆蓋 1/2 平 板 ， 繼續(xù)培養(yǎng) 12 d 可 覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿 （圖 3a）。 菌絲移至光暗交替環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng) 57 d，長 出分生孢子 （圖 3b）。分生孢子為近無色 ， 呈倒卵型 ， 單孢 ， 大小為 （11.1619.73）m×（6.998.55） m。 孢 子梗為多枝簇生 ， 直立或稍彎曲 ，長為 34 mm（圖 3c）。 長滿菌絲的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng) ，會(huì)生長出黑色菌核 （圖 3d），菌核大小不一 。 基于以上特征 ，推測(cè)為葡萄孢屬灰葡萄孢 （B.cinerea）或13· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4a. 葉片水漬狀枯死 b. 莖 稈黑色條斑 c. 枝 條萎蔫 d. 整 株枯死圖 1 北京延慶地區(qū)萬壽菊灰霉病發(fā)病特征ac. 菌 絲侵染 CK. 陰 性對(duì)照?qǐng)D 2 分離自北京萬壽菊上的灰霉病分離物離體侵染實(shí)驗(yàn)其 近源種 B.pelargonii。 其據(jù)孢子形態(tài)上極難分辨 ，需進(jìn)行進(jìn)一步分子鑒定 。2.4 分 子鑒定選取最具代表性的單孢系 ， 利用文獻(xiàn)報(bào)道的通用引物 ，對(duì)其 g3pdh、hsp60、rbp2 等 3 個(gè) 基因片段進(jìn)行了克隆和測(cè)序 。 獲得的序列在 GenBank 進(jìn) 行了登錄 ， 登 錄 號(hào) 分 別 為 MF174048、MF174047 和 MF-174046?；?于 3 個(gè)基因片段聚合序列 ，構(gòu) 建了葡萄孢14· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4a. 菌 絲 b. 分 生孢子 c. 分 生孢子梗 d. 菌 核圖 3 分離自北京萬壽菊上的灰霉病分離物形態(tài)特征屬 29 個(gè)種與本研究分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹 。從 進(jìn)化樹中清晰看出 ， 本研究中分離的萬壽菊灰霉病病原菌與 B. cinerea 關(guān) 系最近 ，進(jìn)一步表明 ，本研究在延慶溫室萬壽菊上發(fā)現(xiàn)的灰霉病病原菌為灰葡萄孢 ，這與孢子形態(tài)觀察的結(jié)果一致 。3 結(jié) 論與討論灰霉病為植物常見病害 ，在萬壽菊大田栽培中也時(shí) 有發(fā)生 ，一般發(fā)病于夏末秋初天氣冷涼 ，多雨高濕時(shí)期 。 田間萬壽菊灰霉病主要表現(xiàn)為枝葉萎蔫 ，嚴(yán)重時(shí)整枝 、整株都會(huì)枯萎死亡 。在濕度較大時(shí) ，枯死枝條和花朵上可見灰色的孢子層 ，而孢子層也往往作為鑒別灰霉病重要表觀特征 。 本次發(fā)現(xiàn)的病害發(fā)生于延慶四海萬壽菊制種溫室內(nèi) ，病害特征與田間類似 ，但較田間發(fā)病期稍早 ，且未見明顯灰霉層特征 ，這可能與發(fā)病時(shí)期以及溫室內(nèi)的特殊小氣候環(huán)境有關(guān) 。在延慶四海鎮(zhèn)萬壽菊種植區(qū) ， 灰霉病暴發(fā)時(shí)多伴有萬壽菊黑斑病的發(fā)生 ， 由于病晚期枝條黑褐色枯死等癥狀與黑斑病后期癥狀類似 ， 容易忽視而誤診為黑斑病 ，導(dǎo)致防治方法不對(duì) ，防治效果不明顯 。研究表明 ，在其他農(nóng)作物中 ，灰霉病病原菌主要通過傷口或枯死組織8或殘留花瓣和柱頭等9侵 入植物 ，逐漸發(fā)展至全株 。 而萬壽菊黑斑病造成的枯死斑也為灰霉病侵入和發(fā)展創(chuàng)造了便利條件 。準(zhǔn)確鑒定病原菌是制定有效防治策略的前提條件 。引起植物灰霉病的病原菌種類較多 ，均屬核盤菌葡萄孢屬 。菌絲 、孢子等形態(tài)特征是鑒別真菌類型最主要的依據(jù) ，但有些相近菌種形態(tài)特征較為相似 ，難以僅依靠形態(tài)特征區(qū)分 。 使用分子檢測(cè)技術(shù)可以從基因?qū)用鏅z測(cè)菌種甚至菌系間的微小差異 ， 相對(duì)形態(tài)鑒定更為準(zhǔn)確 、快速 。為鑒定四海萬壽菊制種圃灰霉病病原 ，本團(tuán)隊(duì)對(duì)病原菌進(jìn)行了分離 ，并通過離體葉片進(jìn)行了侵染性檢測(cè)等 ， 最終確定了病原并基本確定其為核盤菌科葡萄孢屬 。 進(jìn)一步通過分子檢測(cè)方 法 ， 確診病原為葡萄孢屬的灰葡萄孢菌 （B.cineaea）。 灰葡萄孢是一種常見的植物致病病原菌 ，也是葡萄孢屬中已知的寄主范圍最廣的種 ， 可以侵染 200 種 以上植物10，造成病原菌清除困難 ，防 治效果不理想 。在 2012 年 評(píng)選的 10 大 病害真菌中 ，灰葡萄孢排于第 2 位11，可見其危害之大 。本 研究基于其形態(tài)和分子特征 ， 對(duì)普遍發(fā)生于萬壽菊制種溫室內(nèi)的灰霉病病原菌進(jìn)行了鑒定 ， 為針對(duì)性制定科學(xué)合15· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4B. byssoideaB. narcissicolaB. draytoniiB. polyblastisB. globosaB. sphaerosperma629967999999979999999981B. tulipaeB. crociB. hyacinthiB. galanthinaB. carolinianaB. fabiopsisbotrytis from tagetica5420759299995599997997839399Botrytis sinoalliiB. ranunculiB. ficariarumB. deweyaeB. ellipticaB. squamosaB. convolutaB. acladaB. alliiB. porriB. paeoniaeB. sinoviticolaB. calthaeB. pseudocinereaB. fabaeB. pelargoniiB. cinerea0.005圖 4 基于三基因整合序列的 Botrytis 屬真菌系統(tǒng)發(fā)育樹理預(yù)防措施奠定了基礎(chǔ) 。參 考文獻(xiàn)1 蒲 麗 ，康占海 ，蔣家珍 ，等 . 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