辣椒疫霉菌RT-PCR檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用_程穎超.pdf
<p>園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 997 1006. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0862； http： /www. ahs. ac. cn 997 收稿日期 ： 2018 01 19； 修回日期 ： 2018 03 06 基金項目 ： 國家重點研發(fā)計劃項目（ 2016YFD0201010） ；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（ 201303112） ；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室項目 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： Libaojucaas.cn， xiexuewencaas.cn） 辣椒疫霉菌 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用 程穎超，康華軍，石延霞，柴阿麗，張紅杰，謝學(xué)文*，李寶聚*（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要： 根據(jù)辣椒疫霉菌（ Phytophthora capsici Leonian）與致病疫霉菌（ Phytophthora infestans）及其他 8 種常見土傳病害病原菌 Actin 基因序列差異， 設(shè)計并篩選出辣椒疫霉菌的特異性引物 YM2F/YM2R，建立辣椒疫霉菌的實時熒光定量 PCR 檢測體系，并利用該體系定量檢測人工模擬帶菌樣品及田間發(fā)病土壤樣品中的辣椒疫霉菌。試驗結(jié)果表明，利用該引物建立的實時熒光定量 PCR 檢測體系線性關(guān)系良好，靈敏度為 1 × 10-1pg · L-1，是普通 PCR 的 100 倍。該體系無需病原菌的分離培養(yǎng)即可對土壤中的辣椒疫霉菌進(jìn)行快速、特異且定量檢測。對田間土壤樣品的檢測結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)病害發(fā)生、流行程度與病原菌密度成正比，從而為該病的流行監(jiān)測和早期防控提供科學(xué)依據(jù)。 關(guān)鍵詞： 辣椒疫霉菌；南瓜；熒光定量 PCR；檢測技術(shù)； Actin 中圖分類號： S 642.1； S 436.418 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 05-0997-10 Development and Application of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Detection of Phytophthora capsici CHENG Yingchao， KANG Huajun， SHI Yanxia， CHAI Ali， ZHANG Hongjie， XIE Xuewen*， and LI Baoju*（ Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China） Abstract： According to the different bases of Actin gene sequences between Phytophthora capsici Leonian， P. infestans and other eight common soil pathogenic pathogens， we designed and screened out a specific primer pair YM2F/YM2R to establish a real-time fluorescent quantitative PCR detection assay of P. c a p s i c i， and using this assay to monitor P. capsici in soil samples prepared by artificial simulation and collecting form attacked yields. The results showed that the assay had a good liner relationship and a high sensitivity of 1 × 10-1pg · L-1DNA， which is 100 times more than normal PCR. P. c a p s i c i could be detected rapidly， specifically and quantitatively in infected soil without isolation or cultivation by the RT-PCR assay. The detection result of soil samples collected form attacked field indicated that the incidence and epidemiology of disease were proportional to the density of pathogenic bacteria within a certain range， which can provide scientific basis for the epidemic and early prevention of the disease. Keywords： Phytophthora capsici； pumpkin； real-time fluorescent quantitative PCR； detection assay；Actin Cheng Yingchao， Kang Huajun， Shi Yanxia， Chai Ali， Zhang Hongjie， Xie Xuewen， Li Baoju. Development and application of real-time fluorescent quantitative pcr for detection of Phytophthora capsici Leonian. 998 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 997 1006. 辣椒疫霉菌（ Phytophthora capsici Leonian）是重要土傳病害辣椒根腐型疫病以及南瓜疫病的致病病原菌。辣椒根腐型疫病是一種毀滅性土傳真菌病害，可造成葉片枯萎、果實腐爛、莖稈出現(xiàn)壞死斑以及整株萎蔫死亡等多種癥狀（易圖永和謝丙炎， 2002） 。蔬菜設(shè)施栽培中，其環(huán)境條件較適宜病原菌生長和積累，使其從苗期至果期均能發(fā)病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報道，其每年給全世界僅蔬菜產(chǎn)業(yè)造成的損失就高達(dá) 10 億美元（ Lamour et al.， 2012） 。此外，近些年南瓜疫病也成為主要病害。在中國，籽用南瓜的主產(chǎn)區(qū)黑龍江省，由辣椒疫霉菌引起的南瓜疫病輕者減產(chǎn) 20% 30%，重者減產(chǎn)50%以上甚至絕產(chǎn)（劉志剛， 2011）。 2010 年， 黑龍江省 東寧縣籽用南瓜疫病爆發(fā)，導(dǎo)致大面積絕產(chǎn)（朱正霞， 2011） 。 傳統(tǒng)檢測植物病害的方法為直接對發(fā)病癥狀進(jìn)行觀察，分離純化病原物，再進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。但是辣椒疫霉菌引起的病害極易與腐霉菌（ Pythium） 、鐮刀菌（ Fusarium spp.）引起的病害相混淆（趙偉 等， 2012） ，且病原物的分離純化鑒定過程長達(dá) 2 3 周，給防治工作帶來不便（羅加鳳 等，2012） 。近年來分子檢測技術(shù)已被成功應(yīng)用于檢測病原菌，其中以 PCR 為基礎(chǔ)的實時熒光定量 PCR技術(shù)在快速準(zhǔn)確鑒定且量化病原菌中的應(yīng)用越來越廣泛。 目前實時熒光定量 PCR 檢測技術(shù)已成功用于大豆疫霉菌（ Bienapfl et al.， 2011） 、冬生疫霉菌（杜洪忠 等， 2013） 、雪松疫霉菌（紀(jì)睿 等，2014）和丁香疫霉菌（劉劼 等， 2016）的快速檢測和鑒定，但對于辣椒疫霉菌的報道較少。 本研究中根據(jù)辣椒疫霉菌的肌動蛋白基因序列（ Actin）及土壤中其他常見病原菌的 Actin 序列差異， 設(shè)計辣椒疫霉菌的特異性引物并建立其實時熒光定量 PCR 檢測體系， 實現(xiàn)對該病原菌的特異、靈敏、快速且定量的鑒定。 1 材料與方法 1.1 供試菌株培養(yǎng)與 DNA 提取 供試菌株：疫霉屬的 2 株病原卵菌，其他種屬 6 株真菌， 2 株病原細(xì)菌，共 10 株，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所菜病綜防組分離、鑒定和保存（表 1） 。 表 1 供試菌株信息 Table 1 Isolates used in the test 序號 No. 菌株編號 Isolate code 病原菌名稱 Pathogen name 引起病害 Disease 1 LJ12010805 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 疫病 Phytophthora blight 2 FQ09092001 致病疫霉菌 Phytophthora infestans 晚疫病 Late blight 3 HG15060516 尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 根腐病 Root rot 4 HG13060501 茄病鐮刀菌 Fusarium solani 根腐病 Root rot 5 31636 短密木霉菌 Trichoderma brevicompactum 生防菌 Biocontrol bacteria 6 31642 擬康寧木霉菌 Trichoderma koningiopsis 生防菌 Biocontrol bacteria 7 Itr-2 綠色木霉菌 Trichoderma viride 生防菌 Biocontrol bacteria 8 JGFQ15080702 茄鏈格孢 Alternaria solani 早疫病 Early blight 9 FQ1204120102 胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 軟腐病 Soft rot 10 FQ1112080401 勞爾氏菌屬茄科青枯菌 Ralstonia solanacearum 青枯病 Bacterial wilt 供試疫霉菌采用燕麥培養(yǎng)基進(jìn)行活化， 3 d 后挑取適當(dāng)大小的菌塊于液體燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他供試真菌菌株于 PDA 培養(yǎng)基活化 3 d 后，挑取適當(dāng)大小的菌塊于 PD 培養(yǎng)基培養(yǎng)。 28 培養(yǎng) 5 d 至有菌絲球出現(xiàn)， 4 層紗布過濾去除菌液收集菌絲體后于真空冷凍干燥機(jī)凍干，采用改良 CTAB 法提取 DNA（ Ausubel et al.， 1994） 。 供試細(xì)菌菌株采用 NA 平板活化后挑取單菌落于 NB 培養(yǎng)基中， 28 程穎超，康華軍，石延霞，柴阿麗，張紅杰，謝學(xué)文，李寶聚 . 辣椒疫霉菌 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 997 1006. 999 培養(yǎng) 24 h，采用離心柱型細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒（北京天根公司）提取 DNA。提取的 DNA保存于 20 備用。 1.2 引物設(shè)計 從 GenBank 中下載 8 種供試菌株（細(xì)菌除外）的肌動蛋白（ Actin）基因部分序列，登錄號分別為 JQ429142.1、 KM522995.1、 KY798318.1、 KM231204.1、 JN133583.1、 DQ381954.1、 DQ111970.1和 JQ671723.1。應(yīng)用 MEGA 軟件對辣椒疫霉菌的 Actin 序列與其他供試菌株 Actin 序列進(jìn)行比對，利用 Primer 5.0 軟件對其差異位點設(shè)計特異性 RT-PCR 引物。通過 Blast program（ http： /blast.ncbi. nlm.nih. gov/Blast.cgi）比對所設(shè)計的引物序列與其它生物種屬之間的同源性。引物由北京博邁德基因公司合成后對特異性進(jìn)行篩選與評價。 1.3 普通 PCR 檢測引物特異性 以辣椒疫霉菌以及其他 9 種對照菌株基因組 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增?？傮w系為 20 L，其中 2× Taq PCR Master Mix 10 L，上、下游引物各 0.5 L， DNA 模板 1 L， ddH2O 補(bǔ)足至 20 L。反應(yīng)程序： 94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 30 s，共 35 個循環(huán)； 72 補(bǔ)充延伸 10 min。 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。 1.4 熒光定量 PCR 檢測引物特異性 以辣椒疫霉菌以及其他 9 種對照菌株基因組 DNA 為模板進(jìn)行實時熒光定量 PCR 擴(kuò)增?？傮w系為 20 L，其 中 2 × SuperReal PreMix Plus 10 L，上、下游引物各 0.2 L， DNA 模板 1 L， 50 × ROX Reference Dye 0.4 L， ddH2O 補(bǔ)足至 20 L。反應(yīng)程序： 95 預(yù)變性 10 min， 95 變性 15 s， 60 退火 32 s，共 40 個循環(huán)。在升溫時收集熒光信號，檢測引物特異性。 1.5 普通 PCR 與實時熒光定量 PCR 分別檢測引物靈敏度 測得質(zhì)粒 DNA的初始濃度為 1.0 × 104 pg · µL-1， 按 10倍梯度稀釋 10個濃度后分別進(jìn)行普通 PCR擴(kuò)增和實時熒光定量 PCR 擴(kuò)增以檢測引物靈敏度。 1.6 實時熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用離心柱型瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根公司）將對辣椒疫霉菌特異性擴(kuò)增的 245 bp 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物連接到載體 pMD18-T Vector 上后轉(zhuǎn)入到 50 L Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒 DNA 并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后送北京博邁德公司進(jìn)行測序。陽性克隆質(zhì)粒 DNA 濃度以10 倍梯度稀釋，以不同稀釋倍數(shù)的 DNA 為模板，構(gòu)建實時熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個反應(yīng) 3 次重復(fù)。反應(yīng)體系及條件同上。以模板 DNA 濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)循環(huán)數(shù)（ Ct）值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 1.7 人工模擬帶菌樣品檢測 供試作物哈金龍南瓜，其種子購自山東壽光豐農(nóng)種業(yè)有限公司。 將供試?yán)苯芬呙咕ň幪枮?LJ12010805）于燕麥培養(yǎng)基平板活化 5 d，挑取適當(dāng)大小的菌塊于液體燕麥培養(yǎng)基中 28 培養(yǎng) 7 d 至有菌絲球出現(xiàn)，用豆?jié){機(jī)打碎菌絲后拌土接種于未滅菌的基質(zhì)土中。南瓜長至一片真葉后將其定植于菌土中，對照采用不接菌的普通基質(zhì)，溫室中常規(guī)管理。 分別于定植后 0、 1、 3、 5、 7、 15 和 30 d 從南瓜根際土壤進(jìn)行取樣，采用離心柱型土壤基因組Cheng Yingchao， Kang Huajun， Shi Yanxia， Chai Ali， Zhang Hongjie， Xie Xuewen， Li Baoju. Development and application of real-time fluorescent quantitative pcr for detection of Phytophthora capsici Leonian. 1000 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 997 1006. DNA 提取試劑盒（北京天根公司）提取土壤中總 DNA，并進(jìn)行實時熒光定量 PCR 檢測。 根據(jù)下列公式（ Cottyn et al.， 2011）計算基因拷貝數(shù) N = C × AN/（ n × mw） 。其中 C 表示 DNA濃度， AN 表示阿伏伽德羅常數(shù)（ 6.023 × 1023molecules · mol-1） ， n 表示基因組包含的堿基數(shù)（ × 106bp） ， mw 表示單個堿基的平均分子質(zhì)量（ 660 g · mol-1） 。 1.8 不同發(fā)病程度田塊中病原菌的定量檢測 采用 5 點取樣法，分別于 2015 和 2016 年 5 月中旬在黑龍江省牡丹江市林口縣不同發(fā)病程度的3 個田塊中（分別編號為 T1、 T2、 T3）采集土樣， 5 個點采集的土樣混為 1 份，共 3 份即 3 次重復(fù)，帶回實驗室后每份采用對角線法（李繼平 等， 2013）稱取 0.5 g 土壤（余土置于 20 保存?zhèn)溆茫├秒x心柱型土壤基因組 DNA 提取試劑盒（北京天根公司）提取土壤中總 DNA，并進(jìn)行實時熒光定量 PCR 檢測以定量土樣中的病原菌，計算拷貝數(shù)。另外，分別于 2015 和 2016 年的 8 月中旬（南瓜疫病高發(fā)期） 調(diào)查田間標(biāo)記采樣點周圍 20 株南瓜的發(fā)病情況， 計算病情指數(shù)并分析前期檢測的菌量與其病害發(fā)生和流行的關(guān)系。 病害調(diào)查采用南瓜疫病分級標(biāo)準(zhǔn)： 0 級：無?。?1 級：莖上出現(xiàn)些微水漬狀的病斑； 2 級：莖上病斑擴(kuò)展，但不超過株高 1/4，不萎蔫； 3 級：病部超過整株 1/4，向下延伸至根部不超過株高 3/4，莖基部輕微萎蔫； 4 級：病部超過整株或蔓延至全株，包括根和葉柄，莖基部嚴(yán)重縊縮，葉片枯萎，已死亡。 病情指數(shù) = （各級病株數(shù) × 相應(yīng)級別） /（調(diào)查總株數(shù) × 最大級數(shù)） × 100。 2 結(jié)果與分析 2.1 設(shè)計引物驗證 運用改良的 CTAB 法提取辣椒疫霉菌（編號為 LJ12010805） DNA，并設(shè)計 11 對引物對其 DNA進(jìn)行 PCR 檢測， 結(jié)果表明： 僅引物 YM2F/2R（ YM2F： 5-ATTCCTCCTGATAGATAG-3， YM2R： 5-CCCT CATCACAGAATGC-3）擴(kuò)增條帶單一，陰性對照無擴(kuò)增條帶（圖 1） 。引物序列在 GenBank 比對與其他生物種屬之間無同源性。 圖 1 引物設(shè)計及篩選結(jié)果 Fig. 1 Primer designed and screened results M： BM5000 DNA marker； 1： YM2F/2R； 2： YM3F/3R； 3： YM4F/4R； 4： YM5F/5R； 5： YM6F/6R； 6： YM7F/7R； 7： YM8F/8R； 8： YM9F/ 9R； 9： YM10F/10R； 10： YM11F/11R； 11： YM12F/12R； N： ddH2O. 程穎超，康華軍，石延霞，柴阿麗，張紅杰，謝學(xué)文，李寶聚 . 辣椒疫霉菌 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 997 1006. 1001 2.2 普通 PCR 檢測引物特異性 采用引物 YM2F/2R 對 10 種供試菌株（表 1） DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示，僅辣椒疫霉菌在 245 bp 處有擴(kuò)增，其他對照菌株與陰性對照均無擴(kuò)增現(xiàn)象，說明引物 YM2F/2R 特異性良好（圖 2） 。 圖 2 普通 PCR 檢測引物特異性結(jié)果 M： BM5000 DNA marker； 1：辣椒疫霉菌； 2：致病疫霉菌； 3：尖孢鐮刀菌； 4：茄病鐮刀菌； 5：短密木霉菌； 6：擬康寧木霉菌； 7：綠色木霉菌； 8：茄鏈格孢； 9：胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種； 10：勞爾氏菌屬茄科青枯菌； N：陰性對照 ddH2O。 Fig. 2 Primer-specific detection by normal PCR M： BM5000 DNA marker； 1： Phytophthora capsici； 2： Phytophthora infestans； 3： Fusarium oxysporum； 4： Fusarium solani； 5： Trichoderma brevicompactum； 6： Trichoderma koningiopsis； 7： Trichoderma viride； 8： Alternaria solani； 9： Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum； 10： Ralstonia solanacearum； N： Negative control ddH2O. 2.3 熒光定量 PCR 檢測引物特異性 熒光定量 PCR 檢測結(jié)果表明，引物 YM2F/2R 對辣椒疫霉菌（編號為 LJ12010805）模板 DNA擴(kuò)增良好（圖 3） ，溶解曲線只有單一峰，無非特異性擴(kuò)增及引物二聚體現(xiàn)象（圖 4） 。 圖 3 RT-PCR 檢測引物特異性 擴(kuò)增曲線 Fig. 3 Primer-specific detection by RT-PCR Amplification curve 圖 4 RT-PCR 檢測引物特異性 溶解曲線 Fig. 4 Primer-specific detection by RT-PCR Melt curve 2.4 普通 PCR 與實時熒光定量 PCR 分別檢測引物靈敏度 將質(zhì)粒 DNA 稀釋為 1.0 × 104 1.0 × 10-5 pg · L-1的濃度梯度分別進(jìn)行普通 PCR 及實時熒光定量 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明引物 YM2F/2R 及所建立的 PCR 體系對 1.0 × 104 10 pg · L-1濃度的 DNA有擴(kuò)增（圖 5） ，故該引物的普通 PCR 靈敏度為 10 pg · L-1；而引物 YM2F/2R 及所建立的實時熒光定量 PCR 檢測體系對 1.0 × 104 1.0 × 10-1 pg · L-1濃度的 DNA 均有擴(kuò)增（圖 6） ，故其靈敏度為 1.0 × 10-1pg · L-1。即實時熒光定量 PCR 比常規(guī) PCR 靈敏度高 100 倍。 Cheng Yingchao， Kang Huajun， Shi Yanxia， Chai Ali， Zhang Hongjie， Xie Xuewen， Li Baoju. Development and application of real-time fluorescent quantitative pcr for detection of Phytophthora capsici Leonian. 1002 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 997 1006. 圖 5 普通 PCR 檢測引物靈敏度 Fig. 5 Sensitivity of normal PCR using the YM2F/2R primer pair 圖 6 熒光定量 PCR 檢測引物靈敏度 Fig. 6 Sensitivity of RT- PCR using the YM2F/2R primer pair 2.5 辣椒疫霉菌熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將重組質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行 10 倍濃度梯度（ 1.6 × 104 1.6 × 10-4 pg · L-1）稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品，以不同稀釋倍數(shù)的質(zhì)粒 DNA 為模板，構(gòu)建實時熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。以質(zhì)粒 DNA 濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)（ Ct）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 7） 。該體系線性關(guān)系良好（ Y = 41.026 3.7026X） ，R2> 0.97。 圖 7 辣椒疫霉菌熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig. 7 Real-time fluorescence quantitative standard curve of Phytophthora capsici 程穎超，康華軍，石延霞，柴阿麗，張紅杰，謝學(xué)文，李寶聚 . 辣椒疫霉菌 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 997 1006. 1003 2.6 人工模擬帶菌樣品檢測 用所建立的實時熒光定量 PCR 檢測體系分別擴(kuò)增不同時間（定植后 0、 1、 3、 5、 7、 15 和 30 d）取樣后菌土與對照土中提取的 DNA，同時采用辣椒疫霉菌 DNA 作陽性對照，不加辣椒疫霉菌 DNA的為陰性對照。熒光定量 PCR 檢測結(jié)果表明，陽性對照與接種后的菌土 DNA 有擴(kuò)增曲線（圖 8） ，且溶解曲線在 85 左右有單一的峰值（圖 9） 。對照土樣 DNA 與陰性對照無擴(kuò)增。隨著時間的變化，基質(zhì)土中辣椒疫霉菌 DNA 拷貝數(shù)總體呈上升趨勢，且在定植后 15 d 時最大，為 9.79 × 107 copys · g-1（圖 10） 。即表明該檢測體系可用于土壤中辣椒疫霉菌的定量檢測，不受土壤中其他 DNA的干擾，可滿足快速診斷疫病的要求。 圖 8 RT-PCR 檢測定植后 30 d 菌土中的辣椒疫霉菌 擴(kuò)增曲線 Fig. 8 The detection of P. capsici in the soil form 0 to 30 d after colonization by RT-PCR Amplification curve 圖 9 RT-PCR 檢測定植后 30 d 菌土中的辣椒疫 霉菌 溶解曲線 Fig. 9 The detection of P. capsici in the soil from 0 to 30 d after colonization by RT-PCR Melt curve 圖 10 土壤中辣椒疫霉菌的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果 Fig. 10 The result of dynamic monitoring of Phytophthora capsici in soil 2.7 不同發(fā)病程度田塊中病原菌的定量檢測結(jié)果 利用建立的實時熒光定量 PCR 檢測體系分別定量檢測 3 個田塊（ T1、 T2、 T3）中的辣椒疫霉菌，并于病害高發(fā)期調(diào)查疫病發(fā)生情況（表 2） 。結(jié)果表明該體系可以用于田間土壤中辣椒疫霉菌的定量檢測，在一定范圍內(nèi)，田間發(fā)病程度與病原菌密度成正比，即土壤中菌量越高越有利于病害的發(fā)生與流行。 Cheng Yingchao， Kang Huajun， Shi Yanxia， Chai Ali， Zhang Hongjie， Xie Xuewen， Li Baoju. Development and application of real-time fluorescent quantitative pcr for detection of Phytophthora capsici Leonian. 1004 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 997 1006. 表 2 不同田塊中辣椒疫霉菌定量檢測及發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果 Table 2 The result of quantitative detection of Phytophthora capsici and disease investigation in different fields 地塊 Block 2015 2016 菌量 /（ copies · g-1） Number of bacteria 發(fā)病率 /% Incidence rate 病情指數(shù) DI 菌量 /（ copies · g-1）Number of bacteria 發(fā)病率 /% Incidence rate 病情指數(shù) DI T1 5.88 × 1013C 22.00 C 12.75 C 7.88 × 1014C 23.00 C 13.75 C T2 7.60 × 1015B 40.00 B 35.00 B 2.74 × 1015B 39.00 B 30.00 B T3 8.81 × 1 017A 79.00 A 72.00 A 3.85 × 1018A 81.00 A 74.00 A 注：同列不同字母表示經(jīng) Duncans 法檢驗在 0.01 水平差異顯著。 Note： Different letters in the same column indicate significant difference at 0.01 level by Duncans test. 3 討論 辣椒疫霉菌是一種重要的土傳病害病原菌，其寄主范圍較廣，可引起辣椒、番茄、黃瓜和南瓜等多種重要蔬菜作物的疫病。該病原菌侵入植株后迅速蔓延，短時間內(nèi)即可暴發(fā)成災(zāi)，且其癥狀與傳統(tǒng)鐮刀菌引起的病害癥狀相似，在生產(chǎn)防治上難度較大（李寶聚 等， 2008） ，易給蔬菜生產(chǎn)造成毀滅性的災(zāi)害，故建立靈敏、特異、快速的辣椒疫霉菌檢測方法尤為重要。 1999 年，首次被應(yīng)用于植物病理學(xué)研究的實時熒光定量 PCR 技術(shù)（ Böhm et al.， 1999）是基于普通 PCR，將核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實時檢測等多項技術(shù)融合在一起的一項創(chuàng)造性技術(shù)，與常規(guī) PCR 相比，其操作更簡便快速，敏感性更強(qiáng)，重復(fù)性且特異性更好。 本研究基于辣椒疫霉菌與常見土傳病害病原菌及生防菌的肌動蛋白（ Actin）序列差異設(shè)計的引物 YM2F/YM2R 特異性強(qiáng)，在 10 株供試菌株中，僅對辣椒疫霉菌擴(kuò)增出 245 bp 的條帶，可將其與致病疫霉菌、尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌等直接區(qū)分。利用該引物建立的 RT-PCR 檢測體系，可以實現(xiàn)直接對土壤中辣椒疫霉菌的快速定量檢測及實時監(jiān)測其動態(tài)變化，對辣椒疫霉菌 DNA 檢測下限為 0.1 pg · L-1，相對普通 PCR 而言，提高了 100 倍，此靈敏度表現(xiàn)與其在檢測其他病原菌時相似，如已建立的苜蓿萎蔫病菌（ C. m. subsp. insidiosus） 、丁香疫霉菌（ Phytophthora hibernalis） 、托拉斯假單胞桿菌 （ Pseudomonas tolaasii Paine） 的熒光定量 PCR 檢測方法均較普通 PCR 提高了 100 倍 （漆艷香 等， 2003；徐巖巖 等， 2013；劉劼 等， 2016） 。而趙偉等（ 2015）利用 PcYpt1-LAMP 檢測辣椒疫霉菌 DNA 的濃度僅為 100 pg · L-1，因此，就檢測下限而言，本研究所建立的 RT-PCR 檢測體系更靈敏，可為辣椒疫霉菌所致病害的早期預(yù)警提供更加可靠的技術(shù)支持。 此外，傳統(tǒng)的土壤中病原菌定量的方法為采用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，而后通過觀察形態(tài)特征并計數(shù)以確定菌量，此方法工作量大，且容易產(chǎn)生誤差，以致于延誤了病害的田間防治工作，導(dǎo)致病害嚴(yán)重發(fā)生且大面積流行。近年來 RT-PCR 在植物病害流行學(xué)中的潛伏侵染病原菌的定量分析（ Winton et al.， 2003；閆佳會 等， 2011） 、寄主抗病性鑒定（ Carmen et al.， 2007；馬占鴻， 2010）以及病害流行動態(tài)監(jiān)測（ Schena et al.， 2004）等方面得到了廣泛應(yīng)用。本研究中利用建立的辣椒疫霉菌 RT-PCR 檢測體系監(jiān)測不同發(fā)病程度田塊中病原菌菌量，與之前的報道（ Liu et al.， 2004；秦帥，2016）一致，表明在一定范圍內(nèi)田間病害發(fā)生和流行程度與病原菌密度成正比，解決了流行學(xué)定量研究中的難題，從而為病害早期防治及管理決策提供科學(xué)依據(jù)。 References Ausubel F M， Brent R， Kingston R E， Moore D D， Seidman J G， Smith J A， Struhl K. 1994. Current protocols in molecular biology. New York：John Wiley & Sons Inc. 程穎超，康華軍，石延霞，柴阿麗，張紅杰，謝學(xué)文，李寶聚 . 辣椒疫霉菌 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 997 1006. 1005 Bienapfl J C， Malvick D K， Percich J A. 2011. Specific molecular detection of Phytophthora sojae using conventional and real-time PCR. Fungal Biology， 115 (8)： 733 740. Böhm J， Hahn A， Schubert R， Bahnweg G， Adler N， Nechwatal J， Oehlmann R， Obwald W. 1999. Real-time quantitative PCR： DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology， 147 (7 8)： 409 416. Carmen G， Oscarmartínez D I， Federico P， Fuencisla M D C. 2007. Assessment of real-time PCR as a method for determining the presence of Verticillium dahliae in different Solanaceae cultivars. European Journal of Plant Pathology， 118 (3)： 199 209. 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