植物病理學(xué)報(bào) ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 研究論文 收稿日期：2018- 01-23 基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資金資助( BAIC07-2017)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-IVFCAAS)；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 通訊作者：李寶聚，研究員，主要從事蔬菜病害綜合防治研究；E -mail：Libaojucaas.cn 第一作者：閆文雪，女，碩士研究生，主要從事蔬菜病害鑒定；E -mail：13021057676163.com。 doi:10.13926,/j.cnki.apps.000141 大白菜枯萎病病原鐮刀菌種類的初步研究 閆文雪，石延霞，李盼亮，柴阿麗，謝學(xué)文，李寶聚(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081) 摘要: 2014-2016年，由于栽培管理及重茬等原因，大白菜枯萎病在我國大面積發(fā)生，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了明確引起大白菜枯萎病的病原菌，本課題組從山東、內(nèi)蒙古、河北、甘肅等大白菜主產(chǎn)區(qū)采集了具有典型枯萎病癥狀的病樣，并對(duì)樣品中的病原菌進(jìn)行了分離和鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明：分離物分別具有尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum)、茄病鐮刀菌 (F. solani) 和木賊鐮刀菌 (F. equiseti)3個(gè)種的形態(tài)學(xué)特征?？潞帐戏▌t驗(yàn)證結(jié)果表明：3種病原菌均能夠使大白菜發(fā)病，且發(fā)病癥狀與田間癥狀一致。此外，基于病原菌的rDNA-ITS和mt SSU序列的測(cè)序比對(duì)，3種病原菌與尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和木賊鐮刀菌的同源性分別達(dá)99%100%，這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相一致。尖孢鐮刀菌引起白菜枯萎病為國內(nèi)首次報(bào)道，而茄病鐮刀菌和木賊鐮刀菌引起白菜枯萎病為國內(nèi)外首次報(bào)道。 關(guān)鍵詞: 大白菜；鐮刀菌枯萎??；尖孢鐮刀菌；茄病鐮刀菌；木賊鐮刀菌 Preliminary study on Fusarium species causing Chinese cabbage wilt YAN Wen-xue, SHI Yan-xia, LI Pan-liang, CHAI A-li, XIE Xue-wen, LI Bao-ju(Institute of Vegetables an d Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China) Abstract: Due to improper cultivation management and continuous cropping, Fusarium wilt in cabbage has widely occurred in Chinese cabbage-producing regions -leading to serious economic losses in China during 2014-2016. To determine the pathogen of Chinese cabbage wilt, the plant samples exhibiting wilt symptom were collected from several provinces such as Shandong, Inner Mongolia, Hebei, and Gansu, etc. Then, the suspected pathogens were isolated and identified as Fusarium oxysporum, F. solani, and F. equiseti based on morphological characteristics. To satisfy Kochs postulates, the pure fungal cultures were to inoculate in Chinese cabbage and the wilt symptoms were consistent with that in the field. Furthermore, the molecular evidences from the sequence aliments of rDNA-ITS and mtSSU with identity up to 99%100% totally met the results of morphological characterization above. To our knowledge, this is the first report of Chinese cabbage wilt disease caused by F. oxysporum in China, and the new report of the disease by F. solani, and F. equiseti in the world. Keywords: Chinese cabbage；Fusarium wilt；F. oxysporum；F. solani；F. equiseti 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2018-05-08 16:02:07網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:/kns.cnki.net/kcms/detail/11.2184.Q.20180508.1601.002.html閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 2 中圖分類號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)： 中國是大白菜（Brassica rapa var. pekinensis）生產(chǎn)和消費(fèi)大國，大白菜已成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢扇鄙俚氖卟?。白菜類作物是中國栽培蔬菜中歷史最長、分布最廣、種植面積最大的蔬菜作物之一，在全國各地均有種植。由于大白菜具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素等，不但有排毒潤腸的作用，而且還可增加機(jī)體的抵抗力，用于癌癥、壞血病等各種疾病的預(yù)防；同時(shí)價(jià)格低廉，所以廣受消費(fèi)者的青睞1-2。近幾年，由于栽培管理不善、重茬、使用未腐熟蓄糞等原因，使得大白菜病害種類逐年增加，尤其是大白菜枯萎病已成為制約大白菜生產(chǎn)的主要因素之一。該病害在全國各地均有發(fā)生，特別是在嚴(yán)重地塊發(fā)病率高達(dá)80%以上，導(dǎo)致大部分植株枯萎死亡，嚴(yán)重影響白菜產(chǎn)量和質(zhì)量，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 大白菜枯萎病是由多種鐮刀菌侵染引起的土傳病害。鐮刀菌屬的真菌種類較多，廣泛分布于自然界中。目前世界上已報(bào)道的鐮刀菌有500多種3，國內(nèi)已報(bào)道可危害蔬菜的鐮刀菌有60多種（https:/nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/），包括尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）、同生鐮刀菌（F. commune）、三線鐮刀菌（F. tricinctum）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）等。同時(shí)，該類病原菌寄主范圍較廣泛，國內(nèi)外已報(bào)道被侵染的寄主植物高達(dá)上百種，包括西瓜、大豆、大蒜、番茄等4。有些鐮刀菌還可以產(chǎn)生真菌毒素，嚴(yán)重危害人畜健康5。2014-2016年，本研究對(duì)采自我國主要白菜生產(chǎn)區(qū)的白菜枯萎病病樣進(jìn)行病原菌分離，通過形態(tài)學(xué)鑒定及致病性測(cè)定，結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)白菜枯萎病病原菌進(jìn)行鑒定，以確定白菜枯萎病的病原菌種類。 1 材料與方法 1.1 病樣采集及癥狀觀察 2014-2016年，在我國山東濰坊沂源縣、內(nèi)蒙古烏蘭察布商都縣、河北張家口尚義縣、甘肅蘭州榆中縣、北京昌平區(qū)等白菜種植區(qū)對(duì)白菜枯萎病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查。采集具有典型發(fā)病癥狀的白菜病樣，觀察并記錄病害癥狀，包括發(fā)病部位、病斑顏色、大小以及危害程度等。 1.2 病原菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 采用常規(guī)組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離。待PSA（Potato sucrose agar）6培養(yǎng)基上長出分離物后，進(jìn)行單孢分離和純化培養(yǎng)，并置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ^察并記錄在PSA培養(yǎng)基上的菌落特征，顯微鏡觀察在CLA（Carnation leaf-piece agar）7培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，并對(duì)分生孢子、分生孢子梗長寬等進(jìn)行測(cè)量。1.3 致病性測(cè)定 對(duì)所有分離物進(jìn)行致病性測(cè)定。采用傷根蘸根法，將大白菜（品種：北京新三號(hào)；栽培方式：盆栽；苗齡：兩葉一心）的根部在1×108mL-1的孢子懸浮液中浸泡30 min，并不斷晃動(dòng)，以在無菌水中浸泡30 min的作為空白對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)20棵苗。接種后，每天觀察植株的長閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 3 勢(shì)和發(fā)病情況，及時(shí)記錄并采集圖像。10 d后調(diào)查植株的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算公式如下： 0級(jí)：無病癥； 1級(jí)：真葉或子葉上出現(xiàn)輕微萎蔫，但生長正常； 2級(jí)：真葉或子葉上出現(xiàn)明顯的壞死斑，根部出現(xiàn)病變，生長受到一定影響； 3級(jí)：根部壞死引起局部性萎蔫，或生長僵化； 4級(jí)：整株萎蔫，倒伏枯死，根部嚴(yán)重病變； 發(fā)病率（%）=(發(fā)病株數(shù))/(總株數(shù))×100。 病情指數(shù)=(各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(總株數(shù)×最高級(jí)數(shù)代表值) ×100 1.4 分子生物學(xué)鑒定 利用CTAB法提取病原菌基因組DNA，采用通用引物ITS和特異性引物mt SSU進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照White等8-9方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將純化的PCR產(chǎn)物送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 2 結(jié)果與分析 2.1 危害及癥狀 通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大白菜枯萎病主要危害根莖部，最后導(dǎo)致整株萎蔫、死亡。發(fā)病初期地上部主要表現(xiàn)為整個(gè)葉緣呈現(xiàn)黃化（圖1-A），中午時(shí)分植株整株萎蔫，早晚時(shí)分恢復(fù)正常。隨著病情的發(fā)展，葉片開始脫落，不能包心，整株長勢(shì)不佳、矮?。▓D1-B），地下部表現(xiàn)為莖部維管束成褐色或黑褐色，中空，根部干枯、褐變。 Fig.1 Symptoms of Chinese cabbage wilt in the field A: Yellowing from the leaf margin; B: Wilt and died symptoms of the diseased plants. 2.2分離物培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征 從具有白菜枯萎病典型癥狀的病樣中分離得到46株分離物，對(duì)這些分離物進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定，A B A 閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 4 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將這些分離物分為3類。 A類：在PSA培養(yǎng)基上27 °C培養(yǎng)5 d后，直徑為4.8 cm；氣生菌絲較多，初期菌落白色，后變成紅色，后期產(chǎn)生紫紅色色素（圖2-A、D）。大型分生孢子鐮刀形，月牙型，稍彎或彎曲，兩端逐漸變尖，28個(gè)隔膜，多數(shù)3個(gè)隔膜，大小為（19.840.3） m × （2.35.9） m（圖3-A）。小型分生孢子數(shù)量較多，卵圓形或腎形，大小為（5.611.5） m × （2.73.9） m（圖3-B）。厚垣孢子較易產(chǎn)生，球形，單生、對(duì)生或串生，直徑6.810.7 m（圖3-C）。 B類：在PSA培養(yǎng)基上27 °C培養(yǎng)5 d后，直徑為4.3 cm，菌落呈白色，薄絨狀，不產(chǎn)生色素（圖2-B、E）。大型分生孢子馬特型，兩端較頓，頂部稍尖，壁較厚，28個(gè)隔膜，多數(shù)3個(gè)隔膜，大小為（25.741.6） m × （4.46.8） m（圖3-D）。小型分生孢子數(shù)量較多，圓形、卵圓形、腎形等，壁較厚，01個(gè)隔膜，大小為（9.216.2） m × （2.75.8） m（圖3-E），假頭狀著生于長的單瓶梗（圖3-F）上。氣生菌絲上產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為長筒形單瓶梗，不分枝或稀少分枝。厚垣孢子多，圓形，壁光滑，單生或?qū)ι?，直?.39.7 m。 C類：在PSA培養(yǎng)基上27 °C培養(yǎng)5 d，直徑為5.2 cm，菌落初為白色，棉絮狀，后變?yōu)樯詈稚?，同時(shí)產(chǎn)生暗褐色色素（圖 2-C、F）。大型分生孢子由分生孢子座產(chǎn)生（圖3-H），鐮刀形，彎曲度大，腹背分明，頂細(xì)胞延長成錐形，基細(xì)胞有足跟，多數(shù)37個(gè)隔膜，大小為（18.573.5） µm × （2.66.5） µm（圖3-G）。小型分生孢子無。厚垣孢子球形，成鏈狀或單生于菌絲中，直徑6.38.9 µm（圖3-I）。 依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離物A初步鑒定為尖孢鐮刀菌（F . oxysporum），B為茄病鐮刀菌（F . solani），C為木賊鐮刀菌（F . equiseti）。 閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 5 Fig 2 Colonial morphology of Fusarium spp. on PSA A and D: The upper and lower surface of F. oxysporum colony; B and E: The upper and lower surface of F. solani colony; C and F: The upper and lower surface of F. equiseti colony, respectively. A B C D E F 閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 6 Fig 3 Morphological characteristics of Fusarium spp. A-C: Marcoconidia, microconidia, and chlamydospores of F. oxysporum, respectively; D-F: Marcoconidia, microconidia, and false-head of F. solani, respectively; G-I: Marcoconidia, sporodochium and chlamydospores of F. equiseti, respectiveliy. Bar=20 m. 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um B C D E F G H I A 閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 7 2.3 致病性測(cè)定結(jié)果 致病性測(cè)定結(jié)果顯示，3種分離物對(duì)大白菜均有不同的致病力，病情指數(shù)從4080不等。其中分離物A接種的大白菜植株發(fā)病最為嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)95%，病情指數(shù)為78。主要癥狀：接種10 d后，大多數(shù)植株枯死，植株長勢(shì)弱小，根部及莖部維管束變褐（圖4-A、E、G）；分離物C接種的發(fā)病情況次之，發(fā)病率達(dá)75%，病情指數(shù)為48，接種10 d后，大多數(shù)植株萎蔫，局部葉片變黃，植株矮小，部分根部及莖部維管束變黃（圖4-B、E、F）；分離物C接種的發(fā)病情況與B類似，發(fā)病率為70%，病情指數(shù)為40（圖4-C、E）。依據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病的植株進(jìn)行再分離，得到的分離物與所接菌株形態(tài)相同，證明所接菌株為白菜枯萎病的病原菌。 2.4分子鑒定結(jié)果 采用ITS1/ITS4和NMS1a/NMS2b引物對(duì)代表菌株BC14092810、BC1405140302和BC14110501-2進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到520 bp、523 bp、503 bp和685 bp、605 bp、748 bp的擴(kuò)增條帶，測(cè)序后將這些序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)分別為MF667963、MF687 456、MF687457和MF667968、MF687456、MF667972。將測(cè)序結(jié)果與NCBI中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果A B D E F G A B C Fig 4 Symptoms of Chinese cabbage seedlings at 10 d post inoculation Upper panel: Seedlings inoculated with isolate A (A), B (B), and C (C), respectively; Lower panel: Control seedlings treated with water (D); Root rot of the inoculated plants (E and F); No emergence of seedling after inoculation (G). 閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 8 發(fā)現(xiàn)，3種病原菌分別與尖孢鐮刀菌（登錄號(hào)為KU984712和DQ831906）、茄病鐮刀菌（登錄號(hào)為KP132236和KX981061）、木賊鐮刀菌（登錄號(hào)為KX197955和JQ690085）的菌株同源性達(dá)98%100%，并聚在同一分支上（Fig 5）。 Fig 5 Phylogenetic tree constructed using the Neighbour-joining method of MEGA 6.0 program based on the ITS sequences of the tested isolates (MF687456.1, MF687457.1, MF667963.1) and 24 isolates retrieved form GenBank Bootstrap support values resulting from 1000 replicates and Verticillium dahlide served as the out group. 3 討論 鐮刀菌研究已有180多年的歷史，是真菌中的一個(gè)重要類群。鐮刀菌形態(tài)比較復(fù)雜，包括無性時(shí)期的小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞及有性時(shí)期的子囊孢子等。由于有性階段不閆文雪，等: 大白菜枯萎病病原菌鑒定 9 易觀察，因此，在鐮刀菌的鑒定中主要根據(jù)無性階段的形態(tài)特征作為鑒定依據(jù)。Booth等10根據(jù)大（?。┬头稚咦?、厚垣孢子等特征對(duì)不同鐮刀菌進(jìn)行鑒定；Leslie等7、Zhang等11通過培養(yǎng)物特征及形態(tài)學(xué)特征對(duì)不同鐮刀菌進(jìn)行鑒定。雖然傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)可以對(duì)鐮刀菌屬進(jìn)行鑒定，但是由于該菌具的培養(yǎng)特征易受環(huán)境等其它因素而發(fā)生變化，所以僅憑傳統(tǒng)方法對(duì)真菌進(jìn)行分類鑒定常出現(xiàn)分歧和誤差，不能準(zhǔn)確區(qū)分不同鐮刀菌屬的種類。目前，利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定不同鐮刀菌的方法被廣泛使用，為鐮刀菌鑒定提供了更加科學(xué)的依據(jù)。國內(nèi)外相關(guān)研究表明rDNA ITS、EF1-、mt SSU、IGS等基因位點(diǎn)常被用于鐮刀菌的鑒定中12-13，不僅可以定義物種在種水平上的概念，而且可以鑒定近緣物種間的親緣關(guān)系。本研究基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，引起白菜枯萎病的3種病原菌分別與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）聚在同一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化支上，分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與前人研究一致14-17。 蔬菜根部鐮刀菌病害可由單一病原菌侵染，也可由多種病原菌復(fù)合侵染，相關(guān)研究已在其它作物上有所報(bào)道18-20。目前，國內(nèi)外已報(bào)道危害大白菜的病害大約有20種，根部病害有5種，分別為枯萎病、猝倒病、菌核病、立枯病和黃萎病。但是，國內(nèi)外對(duì)白菜枯萎病的研究較少，由尖孢鐮刀菌引起的大白菜枯萎病曾在加拿大、意大利、新西蘭等地有過報(bào)道，但在中國并沒有相關(guān)報(bào)道。而茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌引起的大白菜枯萎病在國內(nèi)外都沒有相關(guān)報(bào)道。本研究通過形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，明確了引起大白菜枯萎病的病原菌種類。其中，茄病鐮刀菌（F . solani）、木賊鐮刀菌（F . equiseti）引起白菜枯萎病為國內(nèi)外首次報(bào)道，尖孢鐮刀菌（F . oxysporum）引起白菜枯萎病為國內(nèi)首次報(bào)道，這一結(jié)果對(duì)我國白菜枯萎病的發(fā)生規(guī)律、抗病育種和綜合防治具有重要參考價(jià)值。 參考文獻(xiàn) 1 Zhang D S, Jin T M, Xu J B, et al. 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