分 子植物育種， 2017 年，第 15 卷，第 7 期，第 2891- 2895 頁Molecular Plant Breeding, 2017, Vol.15, No.7, 2891- 2895研究報告Research Report轉(zhuǎn)基因菊花中間試驗的安全性評價高耀輝 高亦珂*卜祥龍 范敏 張啟翔 程堂仁 王佳北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 , 國家花卉工程技術(shù)研究中心 , 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室 , 北京 , 100083* 通訊作者 , gaoykbjfu.edu.cn摘 要 轉(zhuǎn)基因菊花在生產(chǎn)應(yīng)用中具有良好的前景，而未知的環(huán)境安全性嚴重制約其發(fā)展 。對轉(zhuǎn) Vgb 基因菊花開展連續(xù)兩年的中間試驗，在栽培管理條件一致 、安全防護措施嚴格的前提下，轉(zhuǎn)基因菊花 T0代， T1代外源標(biāo)記基因 PMI 和目的 Vgb 經(jīng) PCR 技術(shù)檢測均穩(wěn)定存在，周邊雜草及非轉(zhuǎn)基因菊花尚無基因漂移現(xiàn)象發(fā)生，越冬越夏能力相對對照不顯著 。本實驗說明試驗地內(nèi)轉(zhuǎn)基因菊花外源基因在兩年內(nèi)仍穩(wěn)定存在于基因組中，而且尚未發(fā)生基因漂移的可能，其微弱的生長競爭力轉(zhuǎn)變?yōu)殡s草的可能性極低 。關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因菊花 , 中間試驗 , 穩(wěn)定性 , 安全性Safety Assessment of Transgenic Chrysanthemum in Field TrialGao Yaohui Gao Yike*Bu Xianglong Fan Min Zhang Qixiang Cheng Tangren Wang JiaBeijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation and Molecular Breeding, National Engineering Research Center for Floriculture,College of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing, 100083* Corresponding author, gaoykbjfu.edu.cnDOI: 10.13271/j.mpb.015.002891Abstract Transgenic Chrysanthemum with unknown environment security seriously restricts its good prospect inapplication. The Vgb gene transgenic Chrysanthemum were carried out for two years of field trial. On the premiseof consistent cultivation conditions and strict security measures, exogenous gene PMI and Vgb detected by PCRwere stably integrated in the genome of T0and T1generations. And the transgenic Chrysanthemum had no genedrifting phenomenon in the weeds and wild Chrysanthemum. No significant difference was found in the ability ofadapting to the summer and winter. This experiment suggested that exogenous gene of transgenic Chrysanthemumremained stable in the genome by two years of field trial, and the possibility of horizontal transfer was very low. Itwas very unlikely that the growth and competitiveness would become weeds currently.Keywords Transgenic Chrysanthemum, Field trial, Stability, Safety基金項目：本研究由林業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全性監(jiān)測項目 (JC- 2016- 01)和國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (2013AA102706)共同資助引用格式： Gao Y.H., Gao Y.K., Bu X.L., Fan M., Zhang Q.X., Cheng T.R., and Wang J., 2017, Safety assessment of transgenicChrysanthemum in field trial, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 15(7): 2891-2895 (高耀輝 , 高亦珂 ,卜祥龍 , 范敏 , 張啟翔 , 程堂仁 , 王佳 , 2017, 轉(zhuǎn)基因菊花中間試驗的安全性評價 , 分子植物育種 , 15(7): 2891-2895)轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)安全性問題隨著轉(zhuǎn)基因植物研究的飛速發(fā)展日益受到重視，而安全性評價是轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)和推廣的前提，全面了解轉(zhuǎn)基因作物安全性評價對于指導(dǎo)當(dāng)前的轉(zhuǎn)基因研究具有重要意義 (陳潔君等 , 2007)。作為重要的觀賞植物，轉(zhuǎn)基因菊花在轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)應(yīng)用中具有較好的前景，但是外源基因的穩(wěn)定性，對生態(tài)環(huán)境的影響，特別是基因漂移及轉(zhuǎn)變?yōu)殡s草的可能性是轉(zhuǎn)基因菊花生產(chǎn)應(yīng)用的一個嚴峻的挑戰(zhàn)，嚴重制約其應(yīng)用 。不同于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物考慮食品安全性 (李健 , 2005; 薛大偉等 , 2005; 郭建英 , 2007; 阮妙鴻 , 2007)，轉(zhuǎn)基因菊花從實驗室研制到商業(yè)化的推廣耗時長，而且作為地被植物一旦進行環(huán)境釋放對環(huán)境的影響將是重大的，更是長期的 。在田間雜草中，轉(zhuǎn)基因菊花可能與菊科蒿屬植物發(fā)生遺傳物質(zhì)交換，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槌夒s草，而外源基因在新的遺傳背景下也存在產(chǎn)生新的有毒代謝產(chǎn)物的可能性 (成麗娜等 , 2013)，因此環(huán)境安全性評價至關(guān)重要 。中間試驗是轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用安全性關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，分 子植物育種Molecular Plant Breeding圖 1 菊花葉片 DNA 及 RNA 質(zhì)量檢測注 : M: DL15000 marker; A: DNA 質(zhì)量檢測 ; B: RNA 質(zhì)量檢測Figure 1 The quality detection of DNA and RNA of Chrysanthe-mum leafNote: M: DL15000 marker; A: The quality detection of DNA; B:The quality detection of RNA圖 2 T0代轉(zhuǎn)基因菊花標(biāo)記基因 PMI PCR 檢測注 : M: DL2000 marker; A: 2015 年 PCR 結(jié)果 ; B: 2016 年 PCR結(jié)果 ; CK: 質(zhì)粒陽性對照 ; 1: 非轉(zhuǎn)基因株系 ; 2: ddH2O 陰性對照 ; 320: 轉(zhuǎn)基因株系Figure 2 The PCR analysis of marker gene PMI in T0transgenicChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of 2015; B: ThePCR analysis of 2016; CK: Plasmid used for positive control; 1:Nontransgeniclines; 2:ddH2Onegativecontrol;320:Transgenicplants圖 3 T0代轉(zhuǎn)基因菊花目的基因 Vgb PCR 檢測注 : M: DL2000 marker; A: 2015 年 PCR 結(jié)果 ; B: 2016 年 PCR結(jié)果 ; CK: 質(zhì)粒陽性對照 ; 1: 非轉(zhuǎn)基因株系 ; 2: ddH2O 陰性對照 ; 320: 轉(zhuǎn)基因株系Figure 3 The PCR analysis of target gene Vgb in T0transgenicChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of 2015; B: ThePCR analysis of 2016; CK: Plasmid used for positive control; 1:Nontransgeniclines;2:ddH2Onegativecontrol;320: Transgenicplants也是大田釋放前必不可少的環(huán)節(jié)，在小范圍環(huán)境中轉(zhuǎn)基因菊花的生長勢及外源基因的穩(wěn)定性直接能夠反映優(yōu)良性狀的保持，排除對周圍植物潛在危害及自身轉(zhuǎn)變?yōu)槿肭蛛s草的可能 。我們在北京對轉(zhuǎn) Vgb 基因菊花開展連續(xù)兩年的中間實驗 。目的基因透明顫菌血紅蛋白基因 (Vitre-oscilla hemoglobin gene, Vgb)來源于透明顫菌，能夠提高植株的耐水濕性 (Wakabayashi et al., 1986)，并非抗蟲性的基因，對非靶標(biāo)生物不會有直接的毒害影響 。植物表達載體篩選標(biāo)記為磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因 (phosphomannose isomerase, PMI)替代抗生素標(biāo)記(王葉等 , 2012)，具有生物安全性 。本研究通過檢測轉(zhuǎn)基因菊花外源基因的穩(wěn)定性 、分析越冬越夏能力評價轉(zhuǎn)基因菊花尚未發(fā)生基因漂流現(xiàn)象，這為后期建立一套完整的轉(zhuǎn)基因菊花安全性評價體系提供理論指導(dǎo)，對轉(zhuǎn)基因菊花的應(yīng)用具有重要的意義 。1 結(jié)果與分析1.1 T0代轉(zhuǎn)基因菊花標(biāo)記基因與目的基因的穩(wěn)定性分析提取的菊花葉片 DNA 和 RNA 質(zhì)量良好 (圖 1)，可用于后續(xù)實驗 。PCR 檢測顯示，連續(xù)兩年內(nèi)轉(zhuǎn)基因菊花每個樣品均有 PMI 基因和 Vgb 基因的擴增片斷，產(chǎn)物長度分別為 1 100 bp、460 bp (圖 2; 圖 3)，說明標(biāo)記基因 PMI 和目的基因 Vgb 仍穩(wěn)定存在于各轉(zhuǎn)基因菊花基因組中 。RT-PCR 檢測顯示，連續(xù)兩年內(nèi)目的基因 Vgb 在轉(zhuǎn)基因株系中均穩(wěn)定表達，表達量有所不同 (圖 4)。1.2 T1代轉(zhuǎn)基因菊花標(biāo)記基因與目的基因的穩(wěn)定性分析對獲得的 T1代轉(zhuǎn)基因植株隨機選取 20 株進行PMI 標(biāo)記基因和 Vgb 目的基因 PCR 檢測，結(jié)果顯示有 7 株同時檢測到標(biāo)記基因與目的基因 (圖 5)，表明外源基因可以穩(wěn)定遺傳 。1.3 目的基因漂移的可能性分析提取轉(zhuǎn)基因菊花中間試驗田中及周邊雜草和非2892圖 4 T0代轉(zhuǎn)基因菊花目的基因 Vgb RT-PCR 檢測注 : M: DL2000 marker; CK: 質(zhì)粒陽性對照 ; 1: 非轉(zhuǎn)基因株系 ;2: ddH2O 陰性對照 ; 320: 轉(zhuǎn)基因株系Figure 4 The RT-PCR analysis of target gene Vgb in T0transgenicChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; CK: Plasmid used for positive control;1: Non transgenic lines; 2: ddH2O negative control; 320: Trans-genic plants圖 5 T1代轉(zhuǎn)基因菊花標(biāo)記基因 PMI 和目的基因 Vgb PCR 檢測注 : M: DL2000 marker; A: PMI 基因 PCR 結(jié)果 ; B: Vgb 基因PCR 結(jié)果Figure 5 The PCR analysis of marker gene PMI and target geneVgb in T1transgenic ChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of PMI; B: ThePCR analysis of Vgb圖 6 雜草及非轉(zhuǎn)基因菊花目的基因 Vgb PCR 檢測注 : M: DL2000 marker; A: 2015 年 PCR 結(jié)果 ; B: 2016 年 PCR結(jié)果 ; CK: 質(zhì)粒陽性對照 ; 1: 蒲公英 ; 2: 敗醬草 ; 3: 馬齒莧 ; 4:車前草 ; 5: 獨行菜 ; 6: 打碗花 ; 7: 狗尾草 ; 8: 莧菜 ; 9: 薺菜 ; 10:苦苣 ; 1120: 非轉(zhuǎn)基因菊花Figure 6 The PCR analysis of target gene Vgb in weeds and wildChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of 2015; B: ThePCR analysis of 2016; CK: Plasmid used for positive control; 1:Herba taraxaci; 2: Ixeris denticulate; 3: Portulaca oleracea; 4:Plantago asiatica; 5: Lepidium apetalum; 6: Calystegia hederacea;7: Setaria viridis; 8: Amaranthus mangostanus; 9: Capsella bur-sapastoris;10:Cichorium endivia;1120:NontransgenicChrysan-themum轉(zhuǎn)基因菊花葉片 DNA，分析外源基因漂移的可能性 。雜草包括菊科植物蒲公英 、敗醬草，非菊科植物馬齒莧 、車前草 、獨行菜 、打碗花 、狗尾草 、莧菜 、薺菜 、苦苣 。PCR 檢測顯示，在雜草及非轉(zhuǎn)基因菊花中均未檢測到目的基因 Vgb (圖 6)，表明試驗田 2 年內(nèi)目的基因穩(wěn)定，未發(fā)生向周邊雜草 、同源植物漂移的現(xiàn)象，同時也說明為了防止目的基因擴散而采取的隔離網(wǎng)措施是有效的 。1.4 越冬越夏能力分析轉(zhuǎn) Vgb 基因菊花種植 200 株，移栽后因不適應(yīng)室外的環(huán)境條件，死亡 26 株，成活率為 87%。非轉(zhuǎn)基因菊花 100 株，移栽后死亡 8 株，成活率為 92%。于2015 年 9 月雨季過后統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因菊花存活率為100%，生長勢較強，主干粗壯，部分根部葉片變?yōu)樽霞t色，而非轉(zhuǎn)基因菊花存活率也為 100%，但是長勢較弱，說明轉(zhuǎn) Vgb 基因菊花具有一定的耐澇性 。越冬前對試驗田 50 株覆蓋草簾防寒，其余均根部培土 。2016 年 1 月最低氣溫達到 - 22.8，為近年來最低 。5 月統(tǒng)計菊花成活率，覆蓋草簾存活 32 株，存活率為64%，而覆土防寒的存活率僅為 4.6%，非轉(zhuǎn)基因菊花存活率為 3%，死亡數(shù)量巨大，耐寒性差異不明顯 。由于地被菊 粉地毯 為匍匐生長菊花，根部也較淺，耐寒能力低，陸地栽培需要嚴格防寒越冬 。2 討論轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放帶來效益的同時也存在潛在的生態(tài)風(fēng)險和可能帶來的環(huán)境問題 (廖慧敏 , 2010)。生態(tài)安全性評價主要包括外源基因穩(wěn)定性 、基因漂移 、非靶生物的影響及生長競爭能力或雜草化可能性評價等方面 (侯英杰 , 2008)。當(dāng)一個轉(zhuǎn)基因植物品種進入商品化之前必須經(jīng)過中間試驗 、環(huán)境釋放試驗 、生產(chǎn)性試驗 、申請安全證書等 4 個環(huán)節(jié)，但是在各個階段都要進行轉(zhuǎn)基因植物的遺傳穩(wěn)定性研究 (李甘薯退綠矮化病毒的 RT-PCR 檢測技術(shù)構(gòu)建Application of RT-PCR Detection Method for Sweet Potato Chlorotic Stunt Virus2893分 子植物育種Molecular Plant Breeding健 , 2005)。外源基因可通過花粉傳遞給環(huán)境中其他物種，可能造成生物多樣性資源的遺傳污染 。經(jīng)過連續(xù)兩年的中間試驗，試驗地內(nèi)轉(zhuǎn)基因菊花外源基因仍穩(wěn)定存在于基因組中，并通過自交穩(wěn)定遺傳給后代，且未發(fā)生基因漂移現(xiàn)象，其微弱的生長競爭力不具備成為雜草的可能，表明經(jīng)無抗生素篩選的轉(zhuǎn) Vgb 基因菊花尚未對環(huán)境產(chǎn)生危害 。在栽培條件一致的前提下，采取嚴格的安全防護措施，轉(zhuǎn)基因菊花外源基因穩(wěn)定性說明通過扦插無性繁殖方式能保持外源基因在基因組中的穩(wěn)定性 。Vgb 基因并非抗除草劑 、抗蟲 、抗病基因，因此轉(zhuǎn)基因菊花微弱的競爭優(yōu)勢演變?yōu)殡s草的可能性極低 。后續(xù)仍需鑒定 T1代轉(zhuǎn)基因菊花外源基因的分離比，調(diào)查農(nóng)藝性狀，檢測微生物群落穩(wěn)定性，建立健全科學(xué)合理的轉(zhuǎn)基因菊花環(huán)境安全性評價體系 。3 材料與方法3.1 試驗材料轉(zhuǎn) Vgb 基因 粉地毯 菊花由課題組前期實驗獲得，通過扦插擴繁 。轉(zhuǎn)基因菊花中間試驗田位于北京市昌平區(qū)小湯山實驗基地 (39觷56'N; 116觷20'E)。于2015 年 4 月在試驗田中種植轉(zhuǎn) Vgb 基因菊花 200株，非轉(zhuǎn)基因菊花 100 株，種植后常規(guī)管理 。3.2 DNA 及 RNA 的提取于 2015 年 、2016 年 7 月隨機選擇同樣的 40 株轉(zhuǎn)基因菊花自頂端以下第三片功能完全葉片，利用SDS 法粗提 DNA。利用華岳洋 RNA 提取試劑盒提取 RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和 Eppendorf 生物分光光度計分析 DNA 和 RNA 的純度和產(chǎn)量 。3.3 T0代轉(zhuǎn)基因菊花標(biāo)記基因與目的基因的穩(wěn)定性檢測以轉(zhuǎn)基因菊花葉片 DNA 為模板，野生型作對照，連續(xù)兩年檢測外源基因整合穩(wěn)定性 。以轉(zhuǎn)基因菊花葉片總 RNA 為模板，參照天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA第一鏈 。利用 Vgb 基因特異性引物 (王葉等 , 2012)進行 RT-PCR，檢測目的基因表達穩(wěn)定性 。標(biāo)記基因PMI 特異性引物 (王葉等 , 2012) 序列為： PMI-F： 5'- ACTCATTAACTCAGTGCAAAACTATGCCTGGG- 3'，PMI-R： 5'- CGGCCGTGGCCTTTGACAGTCAC- 3'；目的基因 Vgb 特異性引物序列為 Vgb-F： 5'- CCTCGAGCTCATGTTAGACCAGCAAAC- 3'； Vgb-R： 5'- CCTCGAGTTATTCAACCGCTTGAGC- 3'(引物均由北京睿博興科有限公司合成 )。反應(yīng)體系均為： 1LcDNA模板， 12.5L2×PCRMIX(500mol/LdNTP,20mmol/LTris-HCl, 100 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2, 0.1 UTaq Polymerase/L)， 1 L 10 mmol/L 上游引物， 1 L10 mmol/L 下游引物， ddH2O 定容到 25 L。PCR 反應(yīng)步驟為： 945 min， 9430 s， 5930 s (Vgb 基因退火溫度為 52)， 7260 s， 35 個循環(huán)， 7210 min，4保溫 。PCR 擴增產(chǎn)物用 0.8% (W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測 。3.4 T1代轉(zhuǎn)基因菊花標(biāo)記基因與目的基因的穩(wěn)定性檢測粉地毯 菊花花期 9 月下旬，為蟲媒花，在 9 月現(xiàn)蕾前設(shè)置防蟲網(wǎng)，防止昆蟲攜帶花粉擴散 。11 月底經(jīng)人工自花授粉結(jié)實后收集種子并播種，共獲得62 株 T1代植株 。隨機取 20 株為樣本，以葉片基因組DNA 為模板，利用 PMI、Vgb 基因特異性引物進行 PCR 擴增 。3.5 目的基因漂移情況檢測分別于 2015 年和 2016 年 7 月選擇轉(zhuǎn)基因菊花中間試驗田中 10 種雜草及非轉(zhuǎn)基因菊花 10 株的基因組 DNA 為模板，利用 Vgb 基因特異性引物進行PCR 擴增 。3.6 越冬越夏能力分析栽植于試驗田后統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因菊花及非轉(zhuǎn)基因菊花移栽成活率 、越夏越冬存活率 。作者貢獻高亦珂是項目的構(gòu)思者及負責(zé)人，指導(dǎo)試驗設(shè)計，數(shù)據(jù)分析，論文寫作與修改；高耀輝是本試驗研究的執(zhí)行人，參與試驗設(shè)計，試驗分析，完成數(shù)據(jù)分析及論文初稿的寫作；卜祥龍和范敏是試驗研究執(zhí)行人，參與試驗苗的種植與養(yǎng)護，論文初稿的修訂和校對等工作，張啟翔是該項目的主要負責(zé)人，監(jiān)督試驗田的安全防護措施，程堂仁和王佳是該項目實驗基地管理人，負責(zé)實驗田的養(yǎng)護 。全體作者都閱讀并同意最終的文本 。致謝本研究由林業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全性監(jiān)測項目(JC- 2016- 01)和國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (2013AA-102706)共同資助 。2894轉(zhuǎn) 基因菊花中間試驗的安全性評價Safety Assessment of Transgenic Chrysanthemum in Field Trial參考文獻Chen J.J., Wang J., Wan Y.S., and Jin W. 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