，（）： 收稿日期 ： 修訂日期 ：基金項目 ：國家自然科學(xué)基金 （，）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金 （）通信作者 ：陜西楊凌番茄褪綠病毒的分子檢測王志榮，李曉東，朱玉，黃澤軍，高建昌，國艷梅，杜永臣，王孝宣（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京；西安金鵬種苗有限公司，西安）摘要近年來在陜西番茄生產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了一種新病害 ，病株表現(xiàn)為葉片褪綠 ，葉脈顏色變深及葉片增厚 ，果實變小發(fā)白 ，嚴重影響番茄產(chǎn)量及經(jīng)濟效益 ，年發(fā)病極為嚴重 ，部分產(chǎn)區(qū)甚至絕收 。該病疑似由番茄褪綠病毒 （）引起 。利用特異引物對感病番茄樣品進行 檢測，結(jié)果從所采集的份病樣中均檢測到 預(yù)期大小的特異片段 。對 外殼蛋白 基因和類熱激蛋白 基因進行克隆與序列分析 ， 基因 個核苷酸序列與已報道的 基因有較高的一致性 ，與山東青島和山西晉中分離物同源性為 。 基因 個核苷酸序列與已報道的 基因有較高的同源性 ，與中國 、韓國 、日本 、美國 、希臘分離物同源性達到 以上 。研究表明 已傳播至陜西地區(qū) 。關(guān)鍵詞番茄 ；番茄褪綠病毒病 ；基因 ；基因中圖分類號 ： 文獻標(biāo)識碼 ： ： ， ， ， ， ， ， ， ， （ ， ， ，； ， ，） ， ， ， ， ， （） （） （） ， （ ） ， ， ； ；番茄褪綠病毒 （）屬于 長 線 形 病 毒 科毛 形 病 毒 屬?；?因 組 含 有 兩 條 正 義 單 鏈，是一種病毒 ，其中有 個核苷酸 ，有 個核苷酸 。是韌皮部病毒不能通過機械摩擦接種傳播。在自然條件下 ，只能依靠媒介昆蟲煙粉虱傳播，型煙粉虱 、型煙粉虱 、型煙粉虱 、溫室白粉虱 、銀葉粉虱和紋翅粉虱等介體均可傳播，該病毒是唯一能通過種分屬于兩個屬的粉虱傳播的病毒。寄主范圍廣泛 ，可以侵染茄科、菊科、藜科、莧科、番杏科、夾竹桃科及白花丹科等科種植物 。其中 ，茄科寄主數(shù)最多 ，如番茄 、辣椒 、馬鈴薯 、普通煙 、本生煙等多種煙草。番茄褪綠病毒病最早于年在美國佛羅里達州溫室栽培番茄上出現(xiàn) ，年在美國佛羅里達州該病原首次被鑒定為番茄褪綠病毒。該病毒現(xiàn)已蔓延至世界各地 ，可危害多種作物，在北美洲 、南美洲 、歐洲 、非洲和亞洲均有報道 。我國最早于年在臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)，年后在北京 、江蘇 、山東 、河北 、天津 、河南 、遼寧 、廣東等地區(qū)陸續(xù)有關(guān)于的報道。年在陜西楊凌番茄主產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)番茄疑似感染，感病面積較大 ，表現(xiàn)為番茄整株褪綠黃化 ，果實變小發(fā)白 ，嚴重影響番茄生長并造成很大經(jīng)濟損失 ，部分產(chǎn)區(qū)絕收 。本研究對采集的感病番茄樣品進行了分子檢測與鑒定 ，并對外殼蛋白基因和類熱 激 蛋 白基 因 進 行 克 隆 與 序 列 分析 ，以探討引起該病害的原因 ，并對其進行有效防控提供參考 。 材料與方法 試驗材料 樣品采集年月在陜西省楊凌番茄生產(chǎn)區(qū)的感病區(qū)采集份感病番茄材料葉片 ，編號為，同時采集該生產(chǎn)區(qū)非感病區(qū)健康番茄葉片作為對照 。 生化試劑和菌株 、載體提取試劑盒 、反轉(zhuǎn)錄 試 劑 盒 、 聚合酶 、凝膠回收試劑盒 、克 隆 載 體 、感受態(tài)細胞均由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供 。分子量標(biāo)準(zhǔn) 由天根生化科技有限公司提供 ，× 由北京依聯(lián)軒科技有限公司提供 。 試驗方法 番茄葉片總的提取及檢測使用提取試劑盒提取番茄葉片總。取番茄編號為和健康番茄樣品的葉片，依照試劑盒提取說明步驟提取總，最終將溶解于 中 。保存于用于后續(xù)試驗 。以番茄葉片總作 為 模 板 ，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成。反應(yīng)體系及具體試驗步驟如下 ： ， （） ， ；變性，迅速冰浴。再加× ， ， ，孵育，加 熱失 活與。利用技術(shù)對番茄褪綠病毒進行檢測 ，以為模板利用引物進行擴增 。反 應(yīng) 體 系 為 ： ，上 下 游 引 物 各， ，滅菌水，總體積為。反應(yīng)程序 ：預(yù)變性；變性，退火，延伸，個循環(huán) ；終延伸。產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測 。 特異引物設(shè)計根據(jù)網(wǎng)站上已公布的北京分離物基因組序列設(shè)計了對特異引物 （表）。是根據(jù) （登錄號 ：）序列設(shè)計的特異引物 ，、是根據(jù) （登錄號 ：）序列設(shè)計的特異引物 。能擴增基因的序列 ，、擴增序列進行拼接得到 的基因序列 。 的基因及基因擴增 、序列克隆及測序擴增體系，包括 ，× ，上下游引物各，滅菌水。反應(yīng)程序 ：預(yù)變性；變性，退火，延伸，個循環(huán) ；終延伸。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測 ，使用凝膠回收試劑盒回收目的譜帶 ，回收產(chǎn)物克隆到 載體上 。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，經(jīng)驗證每對引物均得到個陽性克隆后 ，再分別選取個陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司進行測序 。··卷第 期 王志榮等：陜西楊凌番茄褪綠病毒的分子檢測表 本試驗中用到的引物信息 引物名稱引物序列 （）引物中基因組中的位置 產(chǎn)物大小 序列分析將得到的基因序列和基因序列在網(wǎng)站中進行分析比對 ，根據(jù)比對結(jié)果 ，再選取上已發(fā)表的分離物的基因完整序列份和基因完整序列份 （表）。利用中的軟件對選定的序列進行同源性比對 ，利用軟件的 法進行多序列比對分析以及鄰接法 （，）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 ，系統(tǒng)進化樹中各分支置信度 （）進行 次重復(fù)分析 。 結(jié)果與分析 檢測結(jié)果利用特 異 標(biāo) 記進 行分析 ，份感病番茄材料均能檢測到與預(yù)期大小一致的特異片段 ，而健康番茄樣品中未檢測到目的片段 （圖），結(jié)果表明陜西楊凌出現(xiàn)的新病害為番茄褪綠病毒病 。圖 番茄樣品 檢測結(jié)果及 和 基因 擴增結(jié)果 基因序列分析利用基因的特異引物進行分析 ，從感病材料中擴增出片段 ，利用網(wǎng)站中功能對所得分離物的擴增序列進行比對 ，擴增產(chǎn)物包括完整基因（個核苷酸 ），與預(yù)期結(jié)果相符 ，初步證明陜西楊凌番茄新病害是由番茄褪綠病毒的危害所致 ?；虻膫€陽性克隆測序結(jié)果一致 。將 基因全長個核苷酸 （登錄號 ：）與在上收集的來自亞洲 、歐 洲 、北 美 洲 、南 美 洲 的個 國 家 的份基因序列進行同源性分析及進化樹構(gòu)建 。結(jié)果 表 明 基因序列與山東青島（）和山西晉中（）序列同源性達到，與國內(nèi)其他地區(qū)及日本 、韓國 、美國地區(qū)的同源性在以上 ，而··與希臘 、巴西 、以色列 、西班牙等地樣品基因序列同源性在。這些結(jié)果表明 ， 基因序列在不同地區(qū)存在一定差異 ， 基因與國內(nèi)其他地區(qū)及亞洲地區(qū)基因具有較高同源性 ，相比之下 ， 基因與歐洲地區(qū)分離物基因同源性較低 （表）。從構(gòu)建的基因序列進化樹可以看出 ， 基因與山東青島和山西晉中分離物 基因在一個小分支上 ，親緣關(guān)系一致 。中國的份材料的基因序列聚集在一個大的分支上 。不同地區(qū)的 基因序列存在一定差異 ，同一國家的 基因序列親緣關(guān)系較近 ，亞洲與歐洲 基因親緣關(guān)系相對較遠（圖）。表 用于序列比較和進化分析的 基因序列信息 病毒分離物 登錄號 地理來源 同源性 病毒分離物 登錄號 地理來源 同源性 （） 中國 （） 中國 （） 中國 （） 中國 （） 中國 （） 中國 （） 日本 （） 中國 （） 韓國 （） 希臘 （） 韓國 （） 希臘 （） 韓國 （） 希臘 （） 韓國 （） 希臘 （） 韓國 （） 韓國 （） 韓國 （） 韓國 （） 中國 （） 中國 （） 中國 （） 希臘 （） 中國 （） 希臘 （） 中國 （） 希臘 （） 中國 （） 希臘 （） 中國 （） 巴西 （） 中國 （） 以色列 （） 中國 （） 巴西 （） 中國 （） 西班牙 （） 中國 （） 韓國 （） 中國 （） 法國 （） 中國 （） 西班牙 （） 美國 （） 西班牙 （） 美國 （） 西班牙 （） 中國 （） 西班牙 （） 中國 基因序列分析擴 增 結(jié) 果 表 明 ，擴 增 出片段 ，擴增出 片段 ，與預(yù)期結(jié)果相符 。分別將這兩個擴增片段的個陽性克隆進行測序拼接得到個 片段 ，該片段包括完 整基 因 （ 個 核 苷 酸 ），使 用軟件對這個 片段進行比對 ，序列結(jié)果一致 ，重復(fù)性較好 。將陜西省楊凌分離物 基因全長 個核苷酸 （登錄號 ：）與在上收集的來自亞洲 、歐洲 、北美洲 、南美洲的個國家的份 基因序列進行同源 性 分 析 及 進 化 樹 構(gòu) 建 。結(jié) 果 表 明 ， 基因與中國大部分地區(qū) 、日本 、韓國大部分地區(qū) 、美國 、巴西分離物 基因同源性在以上 ，與西班牙的個地區(qū)分離物 基因同源性在以上 ，而與中國廣東分離物 基因同源性最低 ，為（表）。從構(gòu)建的基因序列進化樹可以看出 ，分離物基因與中國大部分地區(qū)基因在一個分支上 。不同地區(qū)的 基因序列存在一定差異 ，同一國家的 基因序列親緣關(guān)系較近 ，亞洲地區(qū)的 基因親緣關(guān)系較近 ，亞洲與歐洲 基因親緣關(guān)系相比較遠 （圖）。這個結(jié)果與的基因有相似之處 。··卷第 期 王志榮等：陜西楊凌番茄褪綠病毒的分子檢測圖 基于 基因核苷酸序列構(gòu)建的 與其他 個地區(qū)分離物 基因的系統(tǒng)進化樹 ··表 用于序列比較和進化分析的 類熱激蛋白 基因序列信息 病毒分離物 登錄號 地理來源 同源性 韓國 日本 韓國 韓國 韓國 韓國 韓國 中國 中國 中國 中國 中國 中國 中國 中國 中國 美國 中國 中國 中國 中國 美國 中國 中國 中國 中國 中國 中國 中國 巴西 中國 韓國 韓國 希臘 中國 韓國 西班牙 西班牙 西班牙 西班牙 西班牙 中國 討論本研究對西北地區(qū)陜西楊凌番茄疑似感病株進行分子檢測 ，確定該地區(qū)番茄已經(jīng)感染，而且有擴大的趨勢 。提醒西北地區(qū)番茄生產(chǎn)者注意該病毒病的危害 ，加強防控 ，減少經(jīng)濟損失 。本研究對陜西省楊凌分離物的外殼蛋白基因 （登 錄 號 ：）和 類 熱 激 蛋 白基因 （登錄號 ：）片段進行克 隆 與 序 列 分 析 ，基因序列與中國各地區(qū)分離物同源性較高 ，和山東青島 、山西晉中分離物基因同源性達到，相比之下 ，與歐洲其他國家同源性較低 ?；蚺c中國各地區(qū)及亞洲地區(qū)的韓國 、日本分離物同源性較高 ，而與歐洲國家分離物基因同源性較低 。由此可見 ，番茄褪綠病毒在不同地區(qū)其基因組保守區(qū)域有一定差異性 ，該差異是否影響其對作物的侵染作用尚不清楚 。近幾年 ，番茄褪綠病毒病傳播迅速 ，寄主范圍也進一步擴大 ，除目前報道的茄科植物外 ，在國外有研究表明野生蘿卜 、芝麻菜 （ ）、龍葵 、苦苣菜 、反枝莧 、藜等植物都是番茄褪綠病毒的寄主植物，但和番茄相比其傳播病毒的效率較低 ，目前受該病毒危害最嚴重的仍是番茄。番茄褪綠病毒的傳播介體主要是煙粉虱 ，而型煙粉虱是粉虱中傳毒效率較高的傳播載體。另外 ，番茄褪綠病毒還會和番茄黃化曲葉病毒一起復(fù)合侵染番茄 ，導(dǎo)致番茄嚴重減產(chǎn)甚至絕收 。在我國番茄褪綠病毒目前在 東 北 、華 北 、華 中 、華東和華南地區(qū)均有分布，現(xiàn)已蔓延至西北地區(qū) 。該病害在我國迅速傳播的原因可能是帶毒種苗的運輸以及帶毒煙粉虱的傳播 。番茄褪綠病毒病具有暴發(fā)性和流行性 ，較難防治 。針對番茄褪綠病毒對番茄的侵害 ，在保護地中育苗和定植后利用目以上的網(wǎng)紗進行物理隔離 ，并從播種 、定植至采收的全過程噴施殺蟲劑可防止各類煙粉虱對的傳播 ，從而達到控制的目的 。在栽培管理方面 ，適當(dāng)調(diào)整播種和定植期 ，高溫 、干燥的氣候條件對粉虱的發(fā)生 、繁殖及傳播有利 ，各種植基地根據(jù)具體情況可適當(dāng)提前或延遲定植時間 ，盡量避開粉虱的活動高峰期 ，選擇無蟲 、無毒健苗定植 ，嚴禁將帶蟲 、帶毒苗移入棚室。防治的最好手段是利用抗病番茄品種 ，而國內(nèi)外目前尚未有抗病品種育成的報道 ，因此培育抗番茄品種將是未來番茄育種的重點 。··卷第 期 王志榮等：陜西楊凌番茄褪綠病毒的分子檢測圖 基于 基因核苷酸序列構(gòu)建的 與其他 個地區(qū) 分離物的系統(tǒng)進化樹 參考文獻 ， ， ： ， ， ，（）： ， ， ， ··，（）：王富 ，李文麗 ，王輝 番茄褪綠病毒病與黃化曲葉病毒病的區(qū)別及防控 長江蔬菜 ，（）：劉永光 ，魏家鵬 ，喬寧 ，等 番茄褪綠病毒在山東暴發(fā)及其防治措施 中國蔬菜 ，（）： ， ， ， ，： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，：， ， ，： ， ， ，（）：王志榮 ，王孝宣 ，杜永臣 ，等番茄褪綠病毒病研究進展園藝學(xué)報 ，（）： ，ú ， ，：周濤 ，楊普云 ，趙汝娜 ，等警惕番茄褪綠病毒在中國的傳播和危害 植物保護 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：高利利 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