<p>核 農(nóng) 學(xué) 報 2018， 32( 3) : 0600 0608Journal of Nuclear Agricultural Sciences收稿日期 : 2017-08-13 接受日期 : 2017-12-03基金項目 : 國家自然科學(xué)基金資助項目 ( 31160404)作者簡介 : 張政委 ， 男 ， 主要從事設(shè)施園藝研究 。E-mail: 1511180058 qq com*通訊作者 : 崔金霞 ， 女 ， 副教授 ， 主要從事蔬菜抗逆機理與品質(zhì)調(diào)控研究 。E-mail: jinxiacui77163 com文章編號 : 1000-8551( 2018) 03-0600-09Ca2 +參與外源NO增強低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化能力張政委 索琳格 吳 佩 劉慧英 崔金霞*( 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系 /特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點實驗室 /新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室 ， 新疆 石河子 832000)摘 要 : 為探究 Ca2 +在一氧化氮 ( NO) 增強黃瓜抗氧化能力和耐冷性中的作用 ， 本研究以津研四號黃瓜幼苗為試驗材料 ， 通過葉面噴施 NO 供體亞硝基鐵氰化鈉 ( SNP) ， 游離 Ca2 +螯合劑乙二醇 雙 ( 2 氨基乙基 ) 四乙酸 ( EGTA) ， 質(zhì)膜 Ca2 +通道阻斷劑三氯化鑭 ( LaCl3) ， 鈣調(diào)素 ( CaM) 活性抑制劑三氟啦嗪( TFP) 和鈣調(diào)素激酶 ( CaM-PK) 阻斷劑 N ( 6 氨基己基 ) 5 氯 1 萘磺胺 ( W 7) ， 研究低溫( 10 /6) 脅迫下黃瓜幼苗葉片相對電導(dǎo)率 、丙二醛 ( MDA) 含量 、抗氧化酶活性及其相關(guān)基因表達(dá)量 、H2O2含量和 O·2含量的變化 。結(jié)果表明 ， 與 CK 相比 ， 水 + SNP 處理在低溫 24 h 和 48 h 提高了黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶 ( SOD) 、過氧化物酶 ( POD) 、過氧化氫酶 ( CAT) 和抗壞血酸過氧化物酶 ( APX)活性及其相關(guān)基因表達(dá) ， 降低了電導(dǎo)率以及 MDA 和 H2O2含量 ， 而 EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP +SNP 和 W 7 + SNP 處理抑制了 SNP 作用效果 ， 表明 Ca2 +參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化過程的調(diào)節(jié) 。此外 ， 在低溫 0、3 和 6 h， H2O2組織染色顯示水 + SNP 處理的黃瓜幼苗葉片 H2O2積累量顯著高于其他處理 ; 在低溫 6 h， 水 + SNP 處理黃瓜幼苗葉片 O·2積累量顯著高于其他處理 ， 表明活性氧( OS) 可能也作為一種信號分子 ， 位于 Ca2 +的下游參與 NO 增強黃瓜幼苗的抗氧化能力 。本研究為闡明 Ca2 +和 NO 信號系統(tǒng)在提高植物耐冷性中的作用機理提供了理論依據(jù) 。關(guān)鍵詞 : 黃瓜 ; 低溫脅迫 ; 一氧化氮 ; 鈣 ; 抗氧化酶DOI: 10. 11869/j issn100-8551. 2018. 03. 0600溫度是影響農(nóng)作物地理分布和產(chǎn)量的一個重要環(huán)境因子 。起源于熱帶和亞熱帶的植物如黃瓜 、辣椒和玉米等對溫度反應(yīng)尤為敏感 ， 在受到低溫脅迫時表現(xiàn)出冷害癥狀 ， 如膜系統(tǒng)損傷 、光合機構(gòu)破壞 、酶活下降 、代謝紊亂和生長受阻等 1 3。黃瓜 ( Cucumis sativus L )是喜溫蔬菜 ， 在生產(chǎn)和消費上占有重要地位 。設(shè)施冬春季栽培的黃瓜常遇低溫弱光和頻繁冷害 ， 同時自身耐冷性差 ， 嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì) 1 2。因此 ， 提高黃瓜抵御低溫能力 ， 緩解設(shè)施栽培中低溫傷害 ， 闡明其抗低溫生理及分子機制對生產(chǎn)實踐和基礎(chǔ)理論研究具有重要意義 。一氧化氮 ( NO) 既是一種信號分子 ， 又是一種活性物質(zhì) ， 參與植物生理和代謝過程 ， 如萌發(fā) 4、線粒體 5、葉綠體功能 6和氣孔關(guān)閉 7。此外 ， NO 還介導(dǎo)植物對低溫 、高溫 、干旱 、重金屬 、鹽害和 UV-B 輻射等逆境引起的非生物脅迫反應(yīng) ， 適宜濃度的 NO 能夠增強植物對逆境的抗性 8 11。Ca2 +是植物響應(yīng)環(huán)境刺激誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的第二信使 ， 細(xì)胞質(zhì)自由 Ca2 +在空間和時間上的濃度變化將細(xì)胞表面接收的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi) ， 并由一系列 Ca2 +“敏感元件 ”分析和譯解 ， 調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和抗逆等生理反應(yīng) 12。在應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面 ， NO 和 Ca2 +之間既相互獨立又存在交互作用 13 14。研究表明 ， NO 位于 Ca2 +的下游 ， 參與Ca2 +誘導(dǎo)抗氧化酶活性 ， 防止強光引起高羊茅草氧化0063 期 Ca2 +參與外源 NO 增強低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化能力損傷 ， 但 Ca2 +的抑制劑并不影響 NO 的抗氧化作用 15; 熱脅迫中外源 Ca2 +可以激活 NO 進(jìn)而調(diào)動抗氧化酶系統(tǒng)增強小麥耐熱性 16; 外源 NO 可以通過提高胞質(zhì) Ca2 +濃度進(jìn)而增強抗氧化酶活性 ， 提高紫花苜蓿種子抗干旱能力 17和黃瓜的耐鹽性 18; 水分脅迫下外源 NO 對玉米葉片細(xì)胞質(zhì) Ca2 +增加有促進(jìn)作用 ， 并提高了鈣調(diào)素 ( CaM) 含量和 CaM1 基因表達(dá) 19。研究表明 ， 外源 NO 能夠提高低溫脅迫下黃瓜幼苗的光合活性和抗氧化酶活性 ， 進(jìn)而增強植株抵抗低溫的能力 1， 但 Ca2 +是否參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)尚不明確 。因此 ， 本試驗以津研四號黃瓜為試驗材料 ， 利用 NO 供體亞硝基鐵氰化鈉( sodium nitroprusside， SNP) 、游離 Ca2 +螯合劑乙二醇 雙 ( 2 氨基乙基 ) 四乙酸 ( EGTA) 、質(zhì)膜 Ca2 +通道阻斷劑三氯化鑭 ( LaCl3) 、CaM 活性抑制劑三氟啦嗪( trifluoperazine， TFP) 和 鈣 凋 素 激 酶 ( calmodulinkinase， CaM-PK) 阻斷劑 N ( 6 氨基己基 ) 5 氯1 萘磺胺 ( W 7) ， 研究低溫脅迫下 Ca2 +和 NO 對黃瓜幼苗葉片相對電導(dǎo)率 、丙二醛 ( malondialdehyde，MDA) 含量 、抗氧化酶活性及其基因相關(guān)表達(dá)的影響 ，并對黃瓜葉片活性氧中的 H2O2和 O·2進(jìn)行組織化學(xué)染色 ， 以期探明 Ca2 +在 NO 誘導(dǎo)耐冷性中的作用機制 。1 材料與方法1. 1 試驗材料試驗于 2016 年 8 月 2017 年 5 月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗站 、特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用和新疆特種植物藥資源省部共建重點實驗室進(jìn)行 。供試黃瓜為津研四號 ， 購自山東祥云種業(yè)有限公司 。外源 NO 供體 SNP、游離 Ca2 +螯合劑 EGTA、質(zhì)膜Ca2 +通道阻斷劑 LaCl3、CaM 活性抑制劑 TFP 和 CaM-PK 阻斷劑 W 7 均購自美國 Sigma 公司 ; 草炭購自德國 Flora Gard 公司 。1. 2 試驗設(shè)計篩選飽滿一致的黃瓜種子 ， 55 浸種 20 min 后 ，室溫浸泡 6 h， 置于 XZ 300c 型智能人工氣候箱 ( 寧波江南儀器廠 ) 內(nèi) 28黑暗催芽 24 h， 選擇芽長一致的種子播種于 72 孔穴盤 ， 混合基質(zhì)為草炭 、蛭石 ( v v=2 1) ， 每孔 1 粒 ， 覆混合基質(zhì)厚度約 0. 5 1. 0 cm，兩片子葉完全展開時移入裝有混合基質(zhì)的花盆 ( 直徑× 高 =120 mm ×110 mm) ， 每盆一株 ， 250 mL Hoagland營養(yǎng)液 ( 1 倍 ) 每 4 d 澆灌一次 ， 待兩片真葉展平 ， 移入percival E 36L 植物培養(yǎng)箱 ( Percival 公司 ， 美國 ) ， 環(huán)境條件為晝 28 /14 h， 夜 23 /10 h， 光照強度 300mol·m2·s1， 相對濕度 75%， 培養(yǎng)箱內(nèi)適應(yīng) 1 d 后 ，如表 1 所示 ， 分別在 10: 00 和 18: 00 進(jìn)行以下 6 個試驗處理 ( 黃瓜幼苗葉片正反面均勻噴施以下藥物 ) 。藥物噴施 24 h( 即次日 10: 00) 后進(jìn)行低溫處理 ，溫度調(diào)節(jié)為 10 /6， 其他同常溫 ， 此時定義為低溫 0h， 分別在低溫 24 h 和 48 h 對黃瓜幼苗第 2 片真葉進(jìn)行相對電導(dǎo)率 、MDA、抗氧化酶及其相關(guān)基因相對表達(dá)量測定 ， 每處理設(shè) 5 次重復(fù) ， 取平均值 。在低溫 0、3、6、24 和 48 h 進(jìn)行 H2O2和 O·2組織化學(xué)染色 ， 葉圓片每處理為 4 片 。表 1 不同藥劑處理時間Table 1 Treatment time of different chemicals時間Time處理 TreatmentCK 水 + SNP EGTA + SNP LaCl3+ SNP TFP + SNP W 7 + SNP10: 00 雙蒸水 雙蒸水 5 mmol·L1EGTA 50 mol·L1LaCl3100 mol·L1TFP 100 mol·L1W 718: 00 雙蒸水 200 mol·L1SNP 200 mol·L1SNP 200 mol·L1SNP 200 mol·L1SNP 200 mol·L1SNP1. 3 測定項目與方法1. 3. 1 抗氧化酶 、相對電導(dǎo)率和 MDA 含量的測定超氧化物歧化酶 ( superoxide dismutase， SOD) 活性采用氮藍(lán)四唑 ( NBT) 法 20測定 ; 過氧化物酶 ( peroxidase，POD) 和過氧化氫酶 ( catalase， CAT) 活性采用愈創(chuàng)木酚法 21測 定 ; 抗壞血酸過氧化物酶 ( ascorbateperoxidase， APX) 活性參照 Nakano 等 22的方法測定 ;相對電導(dǎo)率和 MDA 含量參照肖春燕等 1的方法測定 。吸光值利用日立 U 3 900 分光光度計 ( HITACHI公司 ， 日本 ) 進(jìn)行測定 。1. 3. 2 抗氧化酶基因相對表達(dá) Trizol 法提取黃瓜葉片總 NA， Nanodrop 2000( Thermo Fisher Scientific公司 ， 美國 ) 檢測核酸含量 ( 核酸全部控制在略高于1 000 g·mL1， A260/A280=2 ±0. 2， OD260/OD230=2. 3±0. 2) ， 瓊脂糖凝膠電泳驗證 NA 完整性 。利用DNA試劑盒 ( Thermo Fisher Scientific 公司 ， 美國 ) 除106核 農(nóng) 學(xué) 報 32 卷去 NA 中可能殘有基因組 DNA， everTra Ace T-qPC Kit 試劑盒 ( TOYOBO 公司 ， 日本 ) 反轉(zhuǎn)錄 NA，在 Bio-ad( 美國 ) 熒光定量 PC 儀進(jìn)行 T-qPC 反應(yīng) 。反應(yīng)條件 : 94預(yù)變性 5 min; 94變性 45 s， 50退火 45 s， 72延伸 1 min， 40 個循環(huán) 。以黃瓜的 actin( XM 011659465. 1) 基因作為內(nèi)參校正并定量分析SOD( NM 001280768. 1) 、POD( NM 001280612. 1) 、CAT( NM 001308916. 1) 和 APX( XM 004144793. 2)基因的表達(dá)水平 。5 個基因的 T-qPC 擴(kuò)增引物序列如表 2 所示 。表 2 實時定量 PC 分析的基因和引物Table 2 Primers of gene and real-time quantitative PC引物名稱Primer name正向引物序列 ( 5&#39; 3&#39;)Forward primer sequence( 5&#39; 3&#39;)反向引物序列 ( 5&#39; 3&#39;)everse primer sequence( 5&#39; 3&#39;)Actin CCACGAAACTACTTACAACTCCATC GGGCTGTGATTTCCTTGCTC超氧化物歧化酶 SOD CCACATTTCAACCCTGCT ACAACAGCCCTTCCGATA過氧化物酶 POD GAGTTGTAATAATGGCGGCT CCTTGGATGTTGGAGAGACT過氧化氫酶 CAT CTGGAAGAGGAGGCTATTAGAA GGCACCAACGACATAGAGA抗壞血酸過氧化物酶 APX GAATCAAACGCCCTCCCT ATGCCAAGCCAAACGAAG注 : 不同小寫字母表示不同處理間差異顯著 ( P 0. 05) 。下同 。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0. 05 level among different treatment The same as following圖 1 Ca2 +參與外源 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片相對電導(dǎo)率和 MDA 含量的影響Fig1 Ca2 +was involved in the effects of NO on the relative conductance and MDA content ofcucumber seedling leaves under low temperature stress1. 3. 3 超氧陰離子 ( O·2) 和過氧化氫 ( H2O2) 組織化學(xué)染色 雙蒸水沖洗各處理黃瓜幼苗第 2 片真葉 ， 打孔器 ( 直徑 1 cm) 打孔 ， 葉圓片分別放入含有 10 mL0. 1% NBT ( 25 mmol·L1HEPES， pH 值 7. 8) 和 1mg·mL1DAB·4HCl 反應(yīng)液 28染色 8 h， 移除染液 ，葉圓片放入含有 95%乙醇中 ， 沸水浴 5 8 min 進(jìn)行脫色 ， 觀察到葉片綠色至完全褪去 ， 去除各管液體 ， 加入新的 95% 乙醇保存并拍照 。氮藍(lán)四唑 ( nitro-bluetetrazolium， NBT) 染色中 ， 藍(lán)色表示 O·2積累程度 23;二氨基聯(lián)苯胺 ( diaminobenzidine， DAB) 染色中 ， 棕褐色表示 H2O2積累程度 24。1. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 Microsoft Excel 2013 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析 ，采用方差分析 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析 ， 并對顯著性差異 ( P 0. 05) 進(jìn)行多重比較 ， Origin 7. 5 進(jìn)行圖形繪制 。2 結(jié)果與分析2. 1 Ca2 +參與外源 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片相對電導(dǎo)率和 MDA 的影響由圖 1 可知 ， 與低溫 24 h 相比 ， 低溫 48 h 下 ， CK 的相對電導(dǎo)率和 MDA 含量均有所增加 。低溫 24 h 和 482063 期 Ca2 +參與外源 NO 增強低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化能力h， 與 CK 相比 ， 水 +SNP 處理的黃瓜幼苗葉片相對電導(dǎo)率和 MDA 含量顯著降低 ， 相對電導(dǎo)率分別降低了15. 9%和 21. 2%， MDA 分別下降了 16. 4%和 11. 4%; 與水 + SNP 處理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP +SNP 和 W 7 +SNP 處理相對電導(dǎo)率和 MDA 含量顯著上升 ， 相對電導(dǎo)率分別提高了 16. 8% 和 15. 3%、19. 8%和 15. 2%、16. 6% 和 29% 以及 17. 5% 和 18. 7%， MDA含量分別提高了 45% 和 18. 7%、31. 6% 和 24. 3%、24. 1%和 14. 9%以及 18. 9%和 44. 9%， 表明 ， Ca2 +參與了 NO 減少低溫脅迫下電解質(zhì)外滲 。2. 2 Ca2 +參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片SOD、POD、CAT 和 APX 活性的影響由圖 2 可知 ， 低溫 24 h 和 48 h， 與 CK 相比 ， 水 +SNP 處理的黃瓜幼苗葉片的 SOD、POD、CAT 和 APX活性顯著升高 ， 分別為 7. 9% 和 15. 5%、67. 3% 和9. 6%、35. 5% 和 70. 9% 以及 37. 4% 和 65. 8%; EGTA+ SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 處理的SOD、POD、CAT 和 APX 活性均低于水 + SNP 處理 。結(jié)果表明 ， Ca2 +參與了 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響 。圖 2 Ca2 +參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片 SOD、POD、CAT 和 APX 活性的影響Fig2 Ca2 +was involved in the effects of NO on the activity of SOD， POD， CAT and APX ofcucumber seedling leaves under low temperature stress2. 3 Ca2 +參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶基因 SOD、POD、CAT 和 APX 表達(dá)的影響由圖 3 可知 ， 低溫 24 h 和 48 h， 與 CK 相比 ， 水 +SNP 處理顯著提高了黃瓜幼苗葉片抗氧化酶 SOD、POD、CAT 和 APX 基因相對表達(dá)量 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 處理顯著降低了 SNP 作用效果 ， 表明 ， Ca2 +參與了 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶 SOD、POD、CAT 和 APX 相關(guān)基因表達(dá)的影響2. 4 Ca2 +參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片活性氧組織染色的影響DAB 染色 : 褐色斑塊的顏色和大小代表 H2O2的積累程度 。從低溫 0 48 h， CK 褐色斑塊面積逐漸擴(kuò)大 ， 表明低溫促進(jìn)了 H2O2的積累 。低溫 0、3 和 6 h，306核 農(nóng) 學(xué) 報 32 卷圖 3 Ca2 +參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶基因 SOD、POD、CAT 和 APX 表達(dá)的影響Fig3 Ca2 +was involved in the effects of NO on the expression of antioxidant enzyme relative geneSOD， POD， CAT and APX of cucumber seedling leaves under low temperature stress與 CK 相比 ， 水 + SNP 處理的黃瓜幼苗葉片褐色斑塊面積擴(kuò)大且顏色加深 ; 與水 + SNP 處理相比 ， EGTA +SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 處理的組斑塊變小變少且染色變淺 。低溫 24 h 和 48 h， 水 +SNP 處理相對于其他處理 ， 褐色斑塊面積減少 ， 顏色變淺 ( 圖 4-A) 。NBT 染色 : 藍(lán)色斑點的顏色和大小表示 O·2的積累程度 。低溫 0 h 和 3 h， 各處理幾乎均無藍(lán)色斑點 ;低溫 6 h， 與 CK 相比 ， 水 + SNP 處理藍(lán)色斑點增多且面積擴(kuò)大 ， 與水 + SNP 處理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 處理的藍(lán)色斑點減少 ;低溫 24 h 和 48 h， 各處理均有少量藍(lán)色斑點 ， 且差異不明顯 ( 圖 4-B) 。結(jié)果表明 ， OS 可能作為信號分子介導(dǎo)了 Ca2 +參與 NO 通過誘導(dǎo)抗氧化酶活性增強黃瓜幼苗耐低溫能力 。3 討論MDA 是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一 ， 通常由氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生 ， 因此 ， MDA 是 OS 引起細(xì)胞膜損傷的表征 25。低溫可造成植物體內(nèi) OS 過度積累 ， 細(xì)胞膜脂過氧化程度和細(xì)胞膜透性增大 ， 細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)大量外滲 26。適宜濃度的 NO 可以通過提高植物抗氧化系統(tǒng)活性清除過多 OS， 以減少膜質(zhì)過氧化和溶質(zhì)大量外滲 ， 增強植物耐冷性 27 28。本研究中 ，低溫 24 h 和 48 h， CK 相對電導(dǎo)率和 MDA 含量均有所增加 ， 表明隨著低溫時間延長黃瓜葉片膜脂過氧化程度加劇 、細(xì)胞質(zhì)膜透性增大 。低溫 24 h 和 48 h， 與 CK相比 ， 水 + SNP 處理顯著降低了相對電導(dǎo)率和 MDA 含量 ， 表明低溫脅迫下外源 NO 處理能夠啟動植物體內(nèi)OS 清除系統(tǒng) ， 減輕細(xì)胞膜傷害 ， 緩解膜透性增大和離子外漏 ， 而 EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和4063 期 Ca2 +參與外源 NO 增強低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片抗氧化能力注 : A: DAB 染色 ; B: NBT 染色 。Note: A: DAB staining B: NBT staining圖 4 Ca2 +參與 NO 對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片活性氧的影響Fig4 Ca2 +was involved in the effects of NO on the tissues staining of the OS of cucumberseedlings leaves under low temperature stressW 7 + SNP 處理抑制了 SNP 作用效果 ， 表明 NO 緩解低溫脅迫對黃瓜幼苗葉片細(xì)胞膜傷害的過程需要Ca2 +的參與 。Ca2 +是植物細(xì)胞重要的第二信使之一 ， 其濃度增加能夠提高植物組織非生物脅迫抗性 29。當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境刺激時 ， 處于質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上 Ca2 +通道開放 ， 胞外或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中 Ca2 +釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中或從胞內(nèi)儲鈣體流向胞液 Ca2 +流量增大 ， 細(xì)胞質(zhì)中 Ca2 +濃度升高 ， 過多的 Ca2 +可與定位于細(xì)胞核 、細(xì)胞膜 、細(xì)胞質(zhì)中的 CaM 形成 Ca2 +·CaM 復(fù)合體 ， Ca2 +·CaM 復(fù)合體會提高 CaM 與許多靶酶的親和力 ， 以此啟動下游信號網(wǎng)絡(luò) ， 誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá) ， 該過程將外界信息表達(dá)為植物生理過程 ， 增強植物抗逆性 30 31。NO 參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育 4 6以及非生物脅迫耐受性 8 11。研究表明 ， NO 在應(yīng)對生物和非生物脅迫響應(yīng)中參與 Ca2 +cyt的升高 ， 且靶向 Ca2 +通道 ， 從 Ca2 +儲存庫中移動 Ca2 +， 同時改變基因表達(dá) 32。 Ca2 +cyt濃度升高不僅引起特定信號的特異性生理反應(yīng) ， 還能通過調(diào)節(jié)類一氧化氮合酶 ( nitric oxide synthase， NOS) 活性誘導(dǎo) NO 產(chǎn)生 ， 從而提升和 ( 或 ) 維持 NO 的水平 33。González 等 34觀察到 Ca2 +cyt升高具有 NO 特異性 ，與 NO 供體 SNP 分解產(chǎn)物無關(guān) 。唐靜等 35研究表明 ，Ca2 +參與 SNP 促進(jìn)鹽脅迫下玉米種子萌發(fā) 。本研究中 ， 與 CK 相比 ， 水 + SNP 處理在低溫 24 h 和 48 h 促進(jìn)了黃瓜幼苗葉片 SOD、POD、CAT 和 APX 活性的提高及其相關(guān)基因的表達(dá) ， 清除了過多的 OS， 緩解了膜脂過氧化和離子外滲 ， 而 EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 處理顯著降低了 SNP 的作用效果 ， 表明低溫下 NO 增強的抗氧化酶活性需要胞內(nèi)及胞外 Ca2 +參與 ， 如果 Ca2 +信號系統(tǒng)中的任何一步被阻斷 ， 如螯合 Ca2 +， 降低胞內(nèi)游離 Ca2 +， 或者抑制CaM 活性 ， 使 NO 信號通路中斷 ， 不能完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和啟動下游反應(yīng) ; 亦或者 Ca2 +系統(tǒng)抑制劑阻礙 Ca2 +濃度的升高 ， 使依賴于類 NOS 生成的 NO 含量減少 ， 不能維持 NO 正常水平 ， 降低 NO 作用效果 。植物受到低溫脅迫后 ， 會造成 OS 的積累 ， 如O·2、H2O2、羥自由基 ( OH·) 及單線態(tài)氧 (1O2) 等 36。OS 可攻擊蛋白質(zhì) 、核酸和脂類等生物大分子引起細(xì)胞氧化損傷 ， 也可做為信號分子對植物生理進(jìn)行調(diào)節(jié) ，提高其抗逆性 37 39。本研究中 ， 低溫 0 48 h， CK 組DAB 染色的黃瓜幼苗葉片的褐色斑塊面積逐漸擴(kuò)大且顏色加深 ， NBT 染色葉片藍(lán)色斑點有所增加 ， 說明低溫誘導(dǎo)了 H2O2和 O·2產(chǎn)生 。在 DAB 染色中 ， 低溫0、3 和 6 h， 與 CK 相比 ， 水 + SNP 處理黃瓜幼苗葉片褐色斑塊面積擴(kuò)大且顏色加深 ， 與水 + SNP 相比 ， EGTA+ SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 處理黃瓜幼苗葉片斑塊變小變少且染色變淺 。在 NBT 染色中 ， 低溫 0 h 和 3 h， 各處理黃瓜幼苗葉片藍(lán)色斑點極少且無顯著性差異 。低溫 6 h， 與 CK 相比 ， 水 + SNP處理黃瓜幼苗葉片藍(lán)色斑點增多面積擴(kuò)大 。與水 +SNP 處理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP和 W 7 + SNP 處理黃瓜幼苗葉片藍(lán)色斑點減少 。低溫 0 6 h， 外源 NO 誘導(dǎo)產(chǎn)生的 OS 可能主要作為信號分子 ， 且 Ca2 +位于 OS 上游 ， EGTA、LaCl3、TFP 和W 7 處理阻斷 Ca2 +信號 ， 外源 NO 誘導(dǎo)的 OS 生成量減少 ， 使 NO-Ca2 +-OS 信號級聯(lián)中斷 ， 從而影響信號的進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo) ; O·2只在 H2O2含量最高的低溫 6 h506核 農(nóng) 學(xué) 報 32 卷有明顯斑點 ， 這可能是由于 OS 的各種物質(zhì)形式 ( 除H2O2外 ) 均極不穩(wěn)定 ， 且壽命極短 。低溫 24 h 和 48h， 與 CK 相比 ， 水 + SNP 處理黃瓜幼苗葉片 DAB 染色的褐色斑塊數(shù)目減少面積減小 ， 顏色變淺 ， 與水 + SNP處理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W7 + SNP 處理黃瓜幼苗葉片褐色斑塊數(shù)目增多面積增大 ， 這和低溫 24 h 和 48 h 相對電導(dǎo)率 、MDA 含量 、抗氧化酶活性以及其相關(guān)基因趨勢一致 ， 表明在低溫24 h 和 48 h， NO 可以通過 Ca2 +和 OS 信號系統(tǒng)誘導(dǎo)抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá) ， 并提高抗氧化酶活性 ， 清除過多的 OS， 維持細(xì)胞正常生理活動 。低溫 24 h 和 48h， 各處理均出現(xiàn)少量藍(lán)色斑點 ， 但差異不明顯 ， 這可能是由于性質(zhì)極不穩(wěn)定的 O·2轉(zhuǎn)化成較為穩(wěn)定的 H2O2。4 結(jié)論NO 能夠提高黃瓜誘導(dǎo)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá) ， 提高抗氧化酶活性 ， 進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)降低電導(dǎo)率和 MDA 含量 。Ca2 +參與 NO 的調(diào)節(jié)過程 。OS 可能作為信號分子參與調(diào)節(jié)且位于 Ca2 +的下游 。參考文獻(xiàn) : 1 肖春燕 ， 邢瀟晨 ， 劉會芳 ， 徐巍 ， 崔金霞 低溫下 NO 對黃瓜光合熒光及抗氧化特性的影響 J 核農(nóng)學(xué)報 ， 2014， 28( 6) :1083 1091 2 Juliette P， Emmanuel B 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