黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) （）： ：生長素酰胺水解酶基因在西瓜果實(shí)發(fā)育過 程 中的表達(dá)高嬙，田守 蔚，張潔，王艷 萍，孫宏 賀，張海 英，許勇（北京 農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ，北京；北京 市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心 農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蔬菜種質(zhì)改良北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，北京）摘 要 ：生長素在植物果實(shí)發(fā)育與成熟過程中發(fā)揮重要作用 ，但生長素調(diào)控西瓜果實(shí)發(fā)育與成熟的分子機(jī)制尚不 十分清楚 。以含糖量低的野生西瓜 與含糖量高的栽培西瓜 為試 驗(yàn)材料 ，測定并比較了栽培與野生西瓜果實(shí)發(fā)育不同時期果實(shí)整組織游離態(tài) 的含 量 。結(jié)果表明 ：果實(shí)游離態(tài) 的含 量隨西瓜果實(shí)發(fā)育而上升 ，在授粉后 達(dá)到 峰值 ，后期逐步下降 。含糖量高的栽培西瓜果實(shí)游離態(tài) 的含 量在果實(shí)發(fā)育的各個階段 ，均顯著高于含糖量低的野生西瓜 ，說明果實(shí)游離態(tài) 的積 累可能與果實(shí)成熟及含糖量積累相關(guān) 。已有研究表明生長素酰胺水解酶 （ ， ，）通過催化結(jié)合態(tài)生長素釋放游離態(tài) 生長素 ，是游離態(tài)生長素積累的限速酶 。在西瓜全基因組上對基 因家族進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，通 過檢測了西瓜各個組織的表達(dá)情況 ，發(fā)現(xiàn)西瓜果肉中只有 個 基因 表達(dá) ，并且栽培西瓜果肉中這 個基因的表達(dá)量均顯著高于野生西瓜 ，其中 ，在栽培西瓜果肉中的表達(dá)量最高 ，且 與果實(shí)游離態(tài) 的含 量變化趨勢正相關(guān) ，推測該基因?qū)υ耘辔鞴嫌坞x態(tài)的積累起關(guān)鍵作用，進(jìn)而調(diào)控了西瓜果實(shí)的發(fā)育與成熟的進(jìn)化 。關(guān) 鍵 詞 ：生長素 ；西瓜 ；游離 ；生長素酰胺水解酶收 稿 日期 ：基金 項(xiàng)目 ：北京學(xué)者資助項(xiàng)目 （）；國家 西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目 （）；北京西甜瓜創(chuàng)新團(tuán) 隊(duì)資助項(xiàng)目 （）。第一 作者簡介 ：高嬙 （），女 ，在讀 碩士 ，從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究 。：。通訊 作者 ：許勇 （），男 ，博士 ，研 究員 ，從事蔬菜育種研究 。：。肉質(zhì)果實(shí)的 發(fā)育與成熟是復(fù)雜而高度協(xié)調(diào)的過程 ，依賴于多個植物生長激素的協(xié)調(diào)作用，其中生長素在果 實(shí)發(fā)育的過程中起到了不可替代的作用 。生長素不僅對果實(shí)坐果起重要作用，還能通 過調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)增 ，決定果實(shí)最終大小。在一 些水果作物中 ，生長素含量的下降被認(rèn)為是果實(shí)啟動成熟的先決條件。外施 生長素可以干擾許多作物的果實(shí)成熟過程。植物 生長素的主要天然活性形式是吲哚乙酸 （ ，），通過植物自身的色氨酸 依賴途徑及色氨酸非依賴途徑合成。合成有 活性的游離態(tài)可以 通過酯鍵與糖結(jié)合 ，或通過酰胺鍵與氨基酸或肽結(jié)合 ，成為非活性的結(jié)合態(tài)，植物 體的生 長素以結(jié)合態(tài)形式存在。以結(jié) 合態(tài)形式存儲 、運(yùn)輸 ，其后在生長素 酰 胺 水 解 酶 （ ， ，）作 用 下 水解產(chǎn)生游離態(tài)，在不 同發(fā)育過程中提供具有生物活性的生長素。擬南 芥的蛋白 家族有個成員 ，其中的主 要底物是，參與 調(diào)控了擬南芥對干旱脅迫的響應(yīng)。、及基因 ，通 過調(diào)控游離態(tài)的含 量進(jìn)而參與調(diào)節(jié)了光照條件下下胚軸的延伸及側(cè)根的發(fā)生 、根毛的延伸。蕪菁受到根腫菌侵 染 ，肉質(zhì) 根 中 的含 量 增 加 可 能 與和的 表 達(dá) 量 變 化 相 關(guān)；和調(diào)控 了 蒺 藜 苜 蓿 根 部 受 真 菌 侵 染 時含量 的增加。桃家族 的基因在 桃果實(shí)成熟過程表達(dá)量上調(diào)了倍 ，可能通過催化生長素氨基酸結(jié)合態(tài)水解的形式參與了溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟階段的生長素的躍變過程 ，進(jìn)而調(diào)控桃果實(shí)發(fā)育過程。因此 ，蛋白 通過調(diào)控游離態(tài)的釋放調(diào)控了植 物的眾多發(fā)育過程 。果實(shí)發(fā)育與成熟過程與游離態(tài)的含 量息息相關(guān) 。西瓜作為非呼吸躍變型果實(shí)發(fā)育研究的理想模式作物 ，生長素對其果實(shí)發(fā)育與成熟過黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) 期程的 研究尚在起步階段 ，生長素在西瓜果實(shí)發(fā)育過程的含量變化尚未有研究報道 ，關(guān)于生長素酰胺水解酶對此過程的調(diào)控作用尚不清楚 。本研究首次報道了含糖量低的野生型西瓜與含糖量高的栽培型西瓜果實(shí)發(fā)育過程中的生長素含量變化差異 ；利用生物信息學(xué)分析方法 ，鑒定并分析西瓜全基因 組家 族 成 員 的 基 本 特 征 ：通 過檢測 了西瓜基因 在野生型及栽培型西瓜果實(shí)發(fā)育過程的表達(dá)差異 ，為基因 家族成員的功能解析奠定了基礎(chǔ) 。 材 料 與方法 材料以 野 生 型 種 質(zhì) “”（）與早熟栽培西瓜 自交系（ ）為供 試材料 。野生材料由課題組從美國引進(jìn)并保存 ，授粉后約種子成 熟 ，但果實(shí)可溶性糖含量極低 ，無甜味 ，瓤色白且硬 ；早熟栽培種西瓜由本課題組選育并保存 ，授粉后約成熟 ，成熟果實(shí)含糖量 高 ，中心瓤甜 ，可溶性固形物左右 ，瓤 色紅 ，肉質(zhì)脆酥 。早熟栽培西瓜果實(shí)發(fā)育過程有個關(guān)鍵期 ：未成熟 白 瓤 期 （授 粉 后，）；白 粉 瓤期 （）；紅 瓤 期 （ ）；過 熟期 （）。以此 作為取樣時間點(diǎn) 。 方法 果實(shí)整組織游離態(tài)含量 的測定游離態(tài)的含 量測定在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)院質(zhì)譜 （）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 。分別采集 “”、授粉 后、及的西瓜 果實(shí)各部位樣品 。采集的樣品在液氮中冷凍后 ，儲存在冰箱 。測 定時將樣品粉碎成細(xì)粉 ，取樣 品 置 于離 心 管 ，加 入提取 液 （異丙醇水鹽酸，）和內(nèi)標(biāo) （·）溶液 ，渦 旋振蕩，在、·條件 下振蕩，加入萃取 液 （氯仿溶液 ），渦旋振蕩，在、·條件 下振蕩，相同 溫度下 ·離心，兩相 形成 ，轉(zhuǎn)移下層液體，室溫下氮?dú)獯蹈?，用甲醇 溶液復(fù)溶 ， ·離心后 ，取上 清液裝入進(jìn)樣小瓶 ，上機(jī)待測 。所用液相色譜儀為 （ ， ，），使用 色譜柱 （×，!；， ，）進(jìn)行 色譜分離 ，采用以下溶劑梯度分離（相 ：水含乙酸 ；相 ：乙 腈含乙酸 ）：，； ，； ，；，；，；，；流速 為·，上樣 量為。使用高分辨質(zhì)譜儀 （ ，）進(jìn)行 質(zhì)譜分析 ，參數(shù)設(shè)置如下 ： ：，（）：，：， ：，：， ：， ：， ：，保留 時間和的質(zhì) 譜信息取決于標(biāo)準(zhǔn)品 。每個樣本重復(fù)次 。 可溶 性固形物含量的測定用手持式糖度 計(jì) （，）測定 西瓜果實(shí)中心果肉組織的可溶性固形物含量 。 西瓜家族 基因序列檢索利用擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫獲得基因 的編碼序列 ，通過檢索 葫 蘆 科 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫 （：）對西 瓜蛋白組序列進(jìn)行比對 ，選取閾值小于序列 ，根 據(jù)基因注釋去除非基因后 ，以 此序列集合在西瓜蛋白組序列內(nèi)再次做比對 檢索 （），在匹 配序列中篩除非序列 后列為西 瓜候 選 基 因序列 。 西瓜蛋白 家族進(jìn)化與結(jié)構(gòu)分析從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥蛋白 家族 序 列 （，；，；，；，；，；，；，），并從 檢索獲得的轉(zhuǎn)錄本序列翻譯出西瓜蛋白 家族序列 ，用 進(jìn)行 序列比對 （），使用 軟件 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 ，做次，其它 參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值 。 西瓜基因在 不同組織部位的表達(dá)分析提取 試劑盒購自華越洋生物公司 ；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為 ，由提供 ；熒 光定量試劑 盒購自公司 ；引物由北京天一輝遠(yuǎn) 生物科技有限公司合成 。用提取 試劑盒分別提取 ，分別取根 、頂端 生長點(diǎn) 、葉片組織 ，和授粉后、的果 肉組織總。使用 （）對各期 高 嬙等：生長素酰胺水解酶基因在西瓜果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)樣品進(jìn)行 純化 。以純化后的樣品 為模板 ，利用試劑盒 （）進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄 ，獲得。反轉(zhuǎn) 錄得到的稀釋倍 ，用作 反應(yīng)模板 。以西瓜基因 作為內(nèi)參 ，利用型熒 光定量儀 （）對基 因 （引物見表）進(jìn)行定量分析 。采 用比較法計(jì) 算各基因的相對表達(dá)量 。表 熒光定量擴(kuò)增的引物序列 基 因 登錄號 上 游 引物 下 游 引物 （） 數(shù)據(jù) 分析采用 軟件 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 。 結(jié) 果 與分析 野生西瓜與栽培 西瓜果實(shí)整組織游離態(tài)的含 量變化檢測 “”、兩個品種西瓜果實(shí)不 同發(fā)育時期整組織游離態(tài)的含 量變化 ，結(jié)果顯示 ，二者游離態(tài)的含 量均呈現(xiàn)先升后降趨勢 ，達(dá)到 最高值 ，而后下降 。在果實(shí)發(fā)育后期 ，野生西瓜游離態(tài)的含量幾乎降為零 ，而栽 培品種仍維持較高含量的游離態(tài)。栽培 西瓜在授粉后的果實(shí)發(fā)育的各個階段游離態(tài)的含量顯著高于野生西瓜 （圖）。栽培 品種可溶 性固形物含量在白粉瓤期（）以后 迅速積累 ，一直增加 ，只在過熟期略有降低 ，而野生品種可溶性固形物含量一 直很低 （圖），不難推測出 ，栽培西瓜后期較高含量的游離態(tài)可能 對其可溶性固形物的積累起重要的作用 。潘磊等在桃果實(shí)發(fā)育中也發(fā) 現(xiàn)同樣現(xiàn)象 。 西瓜 生長素酰胺水解酶基因家族的全基因組鑒定與進(jìn)化樹分析前人的研究結(jié)果表明 ，以結(jié) 合態(tài)形式存儲 、運(yùn)輸 ，生長素酰胺水解酶 （ ， ，）可以 將其水解產(chǎn)生游離態(tài)，是游 離態(tài)積累 的限速酶 ，因此西瓜果實(shí)游離態(tài)積累可 能與基因 有關(guān) ，有必要進(jìn)一步在西瓜全基因組上鑒定分析基因 家族成員 。目前在以擬南芥上已鑒定出個基因 （，；，；，；，；，；，；，），通過 其編碼區(qū)在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn) 行 比 對 ，在西瓜中共得到個基因 （表）。不 同 小寫 字 母 表 示 在 水 平 差 異 顯 著 性 （）。下同 。 圖 不同類型西瓜果實(shí)中游離態(tài) 含量 的變化 圖 不同類型西瓜果實(shí)中可溶性固形物含量的變化 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) 期表 西瓜 基因組中基因 家族的特征 基 因 登錄號 染色 體定位預(yù)測 的蛋白 氨 基 酸長度 分子 量 結(jié)構(gòu) 域 二聚 化結(jié)構(gòu)域 表示存在此結(jié)構(gòu)域 。 利用 進(jìn)化樹分析軟件對西 瓜的個和 擬 南 芥 的個蛋 白 序 列 （，；，；，；，；，；，；，）進(jìn)行 進(jìn)化分析 。由圖可以看出 ，西瓜和擬南芥的蛋白 主要分為大類 ，西瓜中 的、基 因 編 碼 的 蛋 白 和 擬 南 芥（）、（）、（）、（）和（）蛋白 聚為一類 ，、編碼 的蛋白與（）和（）聚 為 一 類 。其 中 ，與（）親緣 關(guān)系較近 ，可能具有相似功能 。圖 西 瓜 和擬南芥 蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 西瓜基因 在不同組織部位的表達(dá)分析分別提取授粉 后的根 、葉 、頂 端生長點(diǎn) 、果柄及果肉組織 ，利用熒光定量對候選個基因 的表達(dá)情況進(jìn)行分析 。以時在果柄組織的表達(dá) 量作為，從圖中可以看出 ，和在根 部的表達(dá)量最高 ，排在第位的是它的 表達(dá) 量 約 為的，、和表達(dá) 量較低 。與其它器官相比 ，西瓜基因 家族在葉片中的表達(dá)量均相 對 較 低 。在 頂 端 生 長 點(diǎn) 中 ，主 要 表 達(dá)、基因 ，其 它基因 表達(dá)量 較 低 。果柄組織中主要表達(dá)、基 因 ，其 次 為、基因 ，與表達(dá) 量極低 。在果肉組織中 ，和表達(dá) 量極低 ，幾乎為。表達(dá) 量最高 ，高出排在第二 位 的將 近 一 倍 ，和表達(dá) 量約為的。圖 中 基因在西瓜不同組織的表達(dá)情況 期 高 嬙等：生長素酰胺水解酶基因在西瓜果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá) 基因 在野生及栽培西瓜果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)差異分析分別提取授粉 后、和授粉 后、的果肉 組織總，對比 檢測個基因 在野生與栽培西瓜品種果肉中表達(dá)差異情況 ，取相同時期果 皮 作 對 照 。以 授 粉 后時在果 皮組織的表達(dá)量作為。從圖中可以看出 ，除基因 以外 ，其余個基因 在果肉中的表達(dá)均顯著高于在果肉 及果皮 的表達(dá) ，并且在野生果肉與果皮 的表達(dá)情況基本相同 。其中 ，、在果肉 表達(dá)量變化趨勢與果實(shí)整組織游離態(tài)的濃 度變化趨勢類似 ，都在授粉后達(dá)到最高 ，在授粉后降低 ，又 在有所 上調(diào) 。這個基因均表現(xiàn)出在含糖量高的組織表達(dá)量高 ，栽培西瓜的果瓤高于野生西瓜的果瓤 ，栽培西瓜的果皮 （含糖量也低 ）與野生西瓜的果瓤同樣表現(xiàn)出較低的表達(dá)量 。其中表達(dá) 量最大 ，推測其在水解結(jié)合態(tài)生長素中發(fā)揮更大的作用 。圖 基因在不同類型西瓜果實(shí)中的表達(dá)情況 結(jié) 論 與討論生長 素很早就被報道參與果實(shí)發(fā)育過程 ，外施生長素會擾亂正常的果實(shí)成熟過程，此外 生長素對果實(shí)坐果及果實(shí)大小的調(diào)控也起到關(guān)鍵作用。除此 以外 ，在一些報道中 ，提出了果實(shí)組織中生長素合成或信號傳導(dǎo)與糖積累之間的聯(lián)系，但生 長素如何影響糖代謝進(jìn)而影響果實(shí)品質(zhì)的機(jī)理還不清楚 。在煙草細(xì)胞中 ，生長素抑制了淀粉粒的發(fā)育 ，淀粉生物合成主要酶的積累受生 長 素 的 影 響。下調(diào)生長素響應(yīng)因子的表 達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄 ，在果實(shí)發(fā)育早期積累更多的淀粉 ，后期積累更多的糖。西瓜 起 源 于 非 洲 ，西 瓜 祖 先 品 種 （或 ，或其 它 ）有著白而堅(jiān)硬的果肉 、厚厚的果皮 、極低的含糖量 ，味苦 ，以上性狀均有利于在雨季到來之前保護(hù)種子 ，防止種子過早被傳播。經(jīng)過 人為馴化過程 ，現(xiàn)代栽培西瓜和野生西瓜祖先品種在外觀和成分上有著明顯的不同 ，這些變化的結(jié)果就是由不成熟并苦澀的野生西瓜變成了完全成熟并甜的栽培西瓜 。目前西瓜馴化過程的關(guān)鍵影響因素的研究還很少 ，西瓜由不甜的野生品種馴化為可以積累糖分的栽培品種 ，涉及的關(guān)鍵因子有待于進(jìn)一步研究 。本研究測量了野生品種 “”、早熟栽 培西瓜品種果實(shí) 不同發(fā)育時期整組織的游離態(tài)濃度 的變化情況 ，發(fā)現(xiàn)不同類型西瓜果實(shí)游離態(tài)的濃 度變化有差異 。二者游離態(tài)的含 量均呈現(xiàn)先升后降趨勢 ，達(dá)到黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) 期最高 值 ，而后下降 。這可能與種子發(fā)育有關(guān) ，種子早期形成與發(fā)育會合成大量游離態(tài)，成熟后 ，游 離態(tài)的含 量迅速降低，導(dǎo)致 果實(shí)整組織游離態(tài)的降 低 。在果實(shí)發(fā)育中后期 ，果實(shí)整組織的游離態(tài)主要 來源于果肉 ，野生西瓜游離態(tài)的含 量幾乎降為零 ，而栽培品種仍維持較高含量的游離態(tài)。此時是栽培西瓜果肉 中可溶性固形物迅速積累期 （決定西瓜含糖量 ），游離態(tài)可能 是栽培西瓜果肉糖分積累的關(guān)鍵因素 ?？傮w上看 ，栽培西瓜在果實(shí)發(fā)育的各個階段游離態(tài)的含 量顯著高于野生西瓜 ，這與栽培西瓜同化物積累的能力顯著高于野生型相吻合 。作為 重要的植物激素 ，其含量的變化對植物生長發(fā)育有重要的影響 。除了從頭合成途徑 ，從結(jié)合態(tài)水解 釋放出有活性的也是其 重要來源 ，生長素酰胺水解酶基因 在此過程發(fā)揮了重要的作用。最早在擬南芥發(fā)現(xiàn)并 鑒定了生長素酰胺水解酶基因，后在許 多植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)蛋白 通過調(diào)控游離態(tài)的釋 放調(diào)控了植物的眾多發(fā)育過程 。其中 ，桃家族 的基因在 桃果實(shí)成熟過程表達(dá)量上調(diào)了倍 ，可能通過催化生長素氨基酸結(jié)合態(tài)水解的形式參與了溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟階段生長素 的 躍 變 過 程 ，進(jìn)而調(diào)控桃果實(shí)發(fā)育過程。目前基因 家族的 功 能 研 究 還 十 分有限 。本研究從西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出個家 族 成 員 ，編 碼 的 氨 基 酸 長 度 在。結(jié)果 顯示 ，西瓜家族 基因中、及在栽 培西瓜果肉中的表達(dá)量 ，明顯高于野生西瓜果肉 ，且在整個果實(shí)發(fā)育時期保持相對較高水平 ，這與栽培西瓜果實(shí)整組織游離態(tài)的含量較高相一致 。其 中 ，分析發(fā)現(xiàn)基因 的表達(dá)量變化趨勢與果實(shí)整組織游離態(tài)的濃 度變化趨勢一致 ，推測該基因是調(diào)控西瓜果實(shí)生長素含量的關(guān)鍵基因 。進(jìn)化樹結(jié)果顯示 ，編碼 的蛋白與擬南芥親緣 關(guān)系較近 。主要 水解和，推測主要以和為底 物 ，調(diào)節(jié)西瓜果實(shí)游離態(tài)的含 量 ，進(jìn)而參與栽培西瓜可溶性固形物的積累 。進(jìn)一步對果實(shí)差異表達(dá)的家族 基因的功能開展解析 ，將會探明生長素調(diào)控西瓜果實(shí)成熟及糖分積累的分子機(jī)制 ，本項(xiàng)研究為此奠定了良好工作基礎(chǔ) 。參考文獻(xiàn) ： ， ， ，（）： ， ， ，（）： ， ， ， （ ） ，（）： ， ， ， ，（）： ，（）： ， ， ，（）： ， ， ，（）： ，（）： ， ：， ，（）： ， ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ü ： ，（）： ， ， ， 期 高 嬙等：生長素酰胺水解酶基因在西瓜果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá) ，（）： ， ， ， ，（）：潘磊 ，曾 文芳 ，牛良 ，等 桃生長素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表達(dá)分析 園 藝 學(xué) 報 ，（）： ， ， ， ： ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ，： ， ： ，（）： ， ， ， ，