<p>大白菜抗根腫病的抗源篩選和分子標(biāo)記鑒定朱明釗 張淑江 張 慧 章時(shí)蕃 李 菲 王曉武 武 劍 李國(guó)亮 &nbsp;魏云曉 岳麗昕 孫日飛*（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）摘 要：以 3 種根腫菌 M01、M02、M03 為病原菌菌源，對(duì) 24 份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定，旨在獲得優(yōu)良的抗源材料并明確材料中含有的抗病基因。結(jié)果表明：24 份大白菜材料中共有 10 份抗病材料，5 份材料對(duì) 3 種根腫菌都表現(xiàn)抗?。浩渲蠧R004和CR007含有根腫病抗病基因 CRk，CR013 含有抗病基因 CRa、 CRbkato、 CRk 和 Crr3，CR015 和CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3；3 份材料對(duì)根腫菌 M01 和 M02 表現(xiàn)抗?。篊R012 含有抗病基因 CRa 和 CRbkato，CR014 和 CR018 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 CRk；抗根腫菌 M01 的材料 CR021 含有抗病基因 Crr2 和 CRk；抗根腫菌 M02的材料 CR023 含有抗病基因 CRc 和 CRk。關(guān)鍵詞：大白菜；根腫?。豢乖春Y選；分子標(biāo)記Katoetal.，2013；Chu etal.，2014）， Crr4 位于 A06連鎖群（Suwabe etal.，2006）， Crr1 位于 A08 連鎖群（Suwabe etal.，2003）； 另 外，Gao 等（2014）將 1 個(gè)抗病基因定位到了與 CRa 相同的位置（Uenoetal.，2012），該基因可能與 CRa 是同一基因；王彤彤等（2012）將 1 個(gè)抗病基因定位到了 A08 連鎖群并證明了該基因與 Crr1 不在同一區(qū)域，是一個(gè)新的抗病基因。以往的基因定位工作只能定位1個(gè)或2個(gè)抗病基因，而對(duì)根腫菌分化的眾多的生理小種，單個(gè)基因往往不起作用，因此，將多個(gè)抗病基因聚合到同一份材料當(dāng)中是提高材料抗病的廣泛性和耐久性的 有 效 方 法（Matsumoto etal.，2012；Hatakeyamaetal.，2017）。本試驗(yàn)以根腫菌 M01、M02 和 M03為病原菌菌源，對(duì) 24 份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定，旨在篩選出抗多個(gè)根腫菌的抗源，并明確與之相關(guān)的抗病基因，以期為今后抗根腫病聚合育種工作奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料供試24份大白菜材料（表1）保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組，以感病大白菜作為對(duì)照。供試根腫菌M01、M02和M03分別朱明釗，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：18206381396163.com* 通訊作者（Correspondingauthor）：孫日飛，男，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：sunrifeicaas.cn收稿日期：2017-08-21；接受日期：2017-11-09基金項(xiàng)目 ：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0101802），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目大白菜根腫病是由蕓薹屬根腫菌（ Plasmodio-phora brassicaeWoron.）侵染引起的專性寄生的世界性土傳病害，主要危害十字花科作物，最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，現(xiàn)在許多國(guó)家都有發(fā)生（楊永林，1990）。根腫菌的休眠孢子可以在土壤中存活 7 a 以上（Karling，1968），因此，田間一旦受到污染，將長(zhǎng)期不再適合十字花科作物的種植。通過(guò)田間管理和生物化學(xué)防治的方法不能從根本上防治根腫病，選育抗根腫病的大白菜新品種是最經(jīng)濟(jì)有效的方法（Kuginukietal.，1999）。迄今為止，在大白菜中至少有 12 個(gè)抗根腫病基因被定位出來(lái)，其中 Crr2位于A01連鎖群（Suwabeetal.，2003）， CRc 位 于 A02 連 鎖 群（Sakamotoetal.，2008）， CRa、 CRb、 CRbkato、 CRk、 Crr3、PbBa3.1、 PbBa3.3 和 Rcr1 都位于 A03 連鎖群（Hiraietal.，2004；Piao etal.，2004；Sakamoto etal.，2008；Matsumoto etal.，2012；Chen etal.，2013；40新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)病蟲(chóng)防控 研究論文中 國(guó) 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES 2018（3）：40-45采自遼寧沈陽(yáng)、云南昆明和河南鄭州，根腫病菌根置于 -20冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2 接種方法1.2.1 菌液的制備 2017 年 3 月 8 日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)樓 406 進(jìn)行，制備方法在Kawamura 等（2017）的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，取 20g 保存于 -20 冰箱的根腫病菌根，室溫下解凍后加入200 mL蒸餾水于攪拌器中攪碎，8層紗布過(guò)濾，濾液于 4、4 000r·min-1離心 10 min，棄上清液，用無(wú)菌水懸浮沉淀，用血球計(jì)數(shù)板將濃度調(diào)至 2×107個(gè)·mL-1，4冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2 接種 2017年3月在本所南圃場(chǎng)春化室進(jìn)行，采用浸根法（柴阿麗 等，2015）接種。3 月 2日在鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中對(duì)大白菜種子進(jìn)行催芽，6 d 后將根系浸入配制好的根腫菌懸浮液中，30min 后將幼苗栽入提前裝好基質(zhì)并灌透底水的 50孔穴盤(pán)中，每穴 1 株，每處理 6 穴，3 次重復(fù)。42 d 后進(jìn)行病情調(diào)查。1.3 病情調(diào)查病 情 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 參 考 Kuginuki 等（1999）、Suwabe 等（2006）、Kato 等（2013）的方法：0 級(jí)，根部無(wú)腫大現(xiàn)象；1 級(jí)，側(cè)根根部有少量小腫瘤；2 級(jí)，側(cè)根根部有較大腫瘤或主根上有小腫瘤；3級(jí)，主根和側(cè)根都出現(xiàn)嚴(yán)重的腫大（圖 1）。病情指數(shù)計(jì)算及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考Zhang等（2015）的方法：抗?。≧），病情指數(shù) 26；感病（S），病情指數(shù) 26。病情指數(shù) =（各病級(jí)株數(shù) × 相應(yīng)級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù) ×3）×100圖 1 根腫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0 級(jí) 1 級(jí) 2 級(jí) 3 級(jí)1.4 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 軟件對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析： 針對(duì)每 1 份材料對(duì) 3 種根腫菌的抗性表現(xiàn)進(jìn)行方差分析； 分別計(jì)算出 24 份材料對(duì) 3 種根腫菌病情指數(shù)的平均值，然后進(jìn)行方差分析。1.5 分子鑒定1.5.1 DNA 的提取 采集 24 份大白菜材料的幼嫩葉片，采用改良 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法（Murray&amp;Thompson，1980）提取單株 DNA，用Nanodrop2000 分光光度計(jì)測(cè)定 DNA 濃度。1.5.2 分子標(biāo)記檢測(cè) &nbsp;對(duì) 24 份大白菜材料進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，共用到 22 個(gè)標(biāo)記，涉及 10 個(gè)基因。其中，標(biāo)記 HC352b-SCAR、SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、 CRaim-T 與 基 因 CRa 連鎖（Hayashida etal.，2008；Matsumoto etal.，2012；Uenoetal.，2012），標(biāo)記 TCR05、TCR09、TCR79、TCR108、K-3 與 基 因 CRb 連 鎖（Piao etal.，2004；Zhang etal.，2014；Chen etal.，2016）， 標(biāo)記 KBrH129J18R 與基因 CRbkato連鎖（Kato etal.，2013）， 標(biāo) 記 B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV與基因 CRc 連 鎖（Matsumoto etal.，2012）， 標(biāo)記 HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV 與基因 CRk 連 鎖（Matsumoto etal.，2012）， 標(biāo) 記BRMS-088 和 BRMS-096 分別與基因 Crr1 和 Crr2表 1 材料名稱及來(lái)源編號(hào) 名稱 來(lái)源CR001 德高 60-201-201 中國(guó)CR002 234-201-201 中國(guó)CR003 2K04-3C58-1-1-3-2-2-2-1-1-1-2 中國(guó)CR004 孢紅心 24-11C2-202-10-1-2-2-1-1-205-201 中國(guó)CR005 博特 6 號(hào) C35-4-1-2-5-1-2-4-203 中國(guó)CR006 BP058-8-6-2- -4-201-4-1 -4-3-1-2 中國(guó)CR007 CCR12094 抗大 3 號(hào)母本保持系 -1-1 中國(guó)CR008 XY4A-201-201-8-202-202-201-1-2-1-4-1-1-2-4-2-2-3中國(guó)CR009 CR 金錦 -201-1-3-2 中國(guó)CR010 包尖陳府 11-201-1-1-201-1 中國(guó)CR011 CR 春喜 -2-1-1-2 中國(guó)CR012 CR 金錦 -1-202-2-1 韓國(guó)CR013 CR- 利民 -201-201 韓國(guó)CR014 CR- 利民 -201-202 韓國(guó)CR015 CR- 利民 -202-2 韓國(guó)CR016 CR- 利民 -202-201 韓國(guó)CR017 CR- 涼春 -201 韓國(guó)CR018 CR- 中聯(lián)金寶 -202-201 韓國(guó)CR019 金峰 -2-1-201-4-3-3 韓國(guó)CR020 紅孩兒 -4-1C5-3-1-1-3 韓國(guó)CR021 金峰 -2-1-201-4-3×BP058 日本CR022 金娃娃 -202-3-1×ECD04-3-202 中國(guó)CR023 ECD04-1× 金娃娃 -202-3-1-201 中國(guó)CR024 CMS× 孢紅心 24-11C2（新 ）（2） 中國(guó)CK 春白菜 2（西由 08）C5-1-1-3 中國(guó)41新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)病蟲(chóng)防控 研究論文中 國(guó) 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES連鎖（Suwabe etal.，2003），標(biāo)記 OPC11-2S 與基因 Crr3 連鎖（Saito etal.，2006），標(biāo)記 M8、M9、M10 與基因 CR-A3 連鎖（Gao etal.，2014），標(biāo)記BrID11683、BrID90269 與 1 個(gè)尚未定位的基因連鎖（王彤彤 等，2012）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為 10 L：PCR mix5L，1.0 mol·L-1上下游引物各0.2L，50 ng·L-1模 板 DNA 2L，ddH2O補(bǔ)齊至 10 L。PCR 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 600 bp 的標(biāo)記利用 1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 600 bp 的標(biāo)記利用 8% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳 分離。2 結(jié)果與分析2.1 接種鑒定從圖 2 可以看出，感病對(duì)照 CK 對(duì) 3 種根腫菌都表現(xiàn)感病，說(shuō)明本試驗(yàn)采用的接種方法準(zhǔn)確可靠。24 份大白菜材料中，有 10 份抗病材料，14 份感病材料。其中，材料 CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對(duì)3種根腫菌都表現(xiàn)抗病，材料CR012、CR014 和 CR018 對(duì)根腫菌 M01 和 M02 表現(xiàn)抗病，材料 CR021 只對(duì)根腫菌 M01 表現(xiàn)抗病，材料CR023只對(duì)根腫菌M02表現(xiàn)抗病。3個(gè)根腫病小種對(duì) 24 份大白菜材料平均病情指數(shù)的單因素方差分析結(jié)果表明：根腫菌M01和M02在24份材料中的致病力差異不顯著，根腫菌 M03 在 24 份材料中的致病力與 M01 和 M02 差異顯著，從材料CR014、CR017 和 CR018 的表現(xiàn)也可以看出，根腫菌 M01 和 M02 之間的致病力差異不顯著，而根腫菌 M03 的致病力與 M01、M02 差異顯著。2.2 分子標(biāo)記鑒定鑒定結(jié)果表明，本試驗(yàn)用到的 22 個(gè)分子標(biāo)記中只有 10 個(gè)具有多態(tài)性，分別是 SC2930-T-FW/-表 2 不同大白菜材料的根腫病抗性及對(duì)應(yīng)的抗性基因材料 抗性 基因 材料 抗性 基因 材料 抗性 基因CR001 感病 CRk/Crr1 CR010 感病 CR019 感病 Crr2CR002 感病 CRk/Crr2 CR011 感病 Crr2 CR020 感病 CRkCR003 感病 CRk CR012 抗 M01、M02 CRa/CRbkatoCR021 抗 M01 Crr2/CRkCR004 抗 M01、M02、M03 CRk CR013 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/CRk/Crr3 CR022 感病 CRkCR005 感病 CRk CR014 抗 M01、M02 CRa/CRbkato/CRk CR023 抗 M02 CRc/CRkCR006 感病 CRk CR015 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/Crr3 CR024 感病 CR007 抗 M01、M02、M03 CRk CR016 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/Crr3 CK 感病 CR008 感病 CRk CR017 感病 CRkCR009 感病 Crr2 CR018 抗 M01、M02 CRa/CRbkato/CRkRV、SC2930-Q-FW/-RV、KBrH129J18R、B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV、HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV、BRMS-088、BRMS-096和 OPC11-2S，共涉及 7 個(gè)基因，分別是 CRa、CRbkato、 CRc、 CRk、 Crr1、 Crr2 和 Crr3。由表2可以看出，感病材料中有的不含抗病基因，有的含有抗病基因 CRk、 Crr1 或 Crr2。材料 CR012、CR014 和 CR018 對(duì)根腫菌 M01 和 M02表現(xiàn)出抗性，其中CR012含有基因抗病基因 CRa圖 2 不同大白菜材料對(duì) 3 種根腫菌的抗性鑒定結(jié)果圖柱上不同小寫(xiě)字母表示不同生理小種對(duì)同一材料的致病力差異顯著（ P 0.05）。. . .*ññ3BBBBBBBBBBBBBBBCBCBCBBBBBCCCCCCCCCCDDBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBCBCC CCCCCCCCCCCCDDCR001 CR005 CR009 CR013 CR017 CR021CR003 CR007 CR011 CR015 CR019 CR023 CKCR002 CR006 CR010 CR014 CR018 CR022CR004 CR008 CR012 CR016 CR020 CR024病情指數(shù)42新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)病蟲(chóng)防控 研究論文中 國(guó) 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES和 CRbkato，CR014 和 CR018 含有抗病基因 CRa、CRbkato和 CRk； 材 料 CR004、CR007、CR013、CR015 和 CR016 對(duì) 根 腫 菌 M01、M02 和 M03 表現(xiàn)出抗性，其中 CR004 和 CR007 只含有抗病基因CRk，CR013 含有抗病基因 CRa、 CRbkato、 CRk 和Crr3，CR015 和 CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3；材料 CR021 只抗根腫菌 M01 且含有抗病基因 Crr2 和 CRk，材料 CR023 只抗根腫菌 M02 且含有抗病基因 CRc 和 CRk。3 結(jié)論與討論明確根腫菌各生理小種在我國(guó)不同地區(qū)的分布，對(duì)提高抗病品種選育的效率具有非常重要的意義。根腫菌存在生理小種的分化，目前已經(jīng)鑒定出的生理小種超過(guò) 24 個(gè)（孫保亞 等，2005）。我國(guó)主要的生理小種有 2 號(hào)、4 號(hào)、7 號(hào)、10 號(hào)和 11 號(hào)，其中以 4 號(hào)生理小種為主（沈向群 等，2009；丁云花 等，2013）。彭沙莎等（2013）鑒定出湖南大白菜根腫菌生理小種有 1 號(hào)、4 號(hào)、9 號(hào)和 13 號(hào)；劉峰等（2013）鑒定出云南和西藏大白菜根腫菌生理小種有 1 號(hào)、2 號(hào)、4 號(hào)、6 號(hào)、7 號(hào)、10 號(hào)、11 號(hào)和12 號(hào)；李寧等（2015）鑒定出陜西太白縣根腫菌生理小種為 7 號(hào)。因此，明確抗源對(duì)不同生理小種或不同地區(qū)生理小種的抗性對(duì)育種工作十分重要。分子標(biāo)記在輔助選擇育種、遺傳多樣分析和基因定位及克隆等方面的應(yīng)用具有十分明顯的優(yōu)越性（McCouch etal.，1997；Liu etal.，2013）。孫保亞等（2005）從國(guó)外引進(jìn)的大白菜品種中分離出48個(gè)抗根腫病大白菜自交系；樸鐘云等（2010）通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇的方法加速回交選育，培育出大白菜優(yōu)良自交系 BJN3 的 9 份抗根腫病近等基因系。Matsumoto 等（2012）利用分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了 3 個(gè)抗根腫病基因CRa、 CRc 和 CRk 的聚合，并證明了聚合之后作物的抗病能力有所加強(qiáng)。本試驗(yàn)中，抗病基因 CRk、Crr1 和 Crr2 也存在于感病材料中，筆者推測(cè)這3個(gè)基因?qū)Σ牧系目共⌒詻](méi)有貢獻(xiàn)。材料CR012、CR014和CR018對(duì)根腫菌M01和M02表現(xiàn)出抗性，其中 CR012 含有抗病基因 CRa 和 CRbkato，CR014和 CR018 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 CRk，由此推測(cè)材料對(duì)M01和M02的抗性可能與 CRa 或CRbkato有關(guān)，也可能與兩者都有關(guān)。材料 CR013、CR015 和 CR016 對(duì) 根 腫 菌 M01、M02 和 M03 都表現(xiàn)出抗性，其中CR013含有抗病基因 CRa、CRbkato、 CRk 和 Crr3，CR015 和 CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3，推測(cè)基因 Crr3 對(duì) M03 具有特異抗性。材料 CR023 只抗根腫菌 M02 且含有抗病基因 CRc 和 CRk，因此認(rèn)為基因 CRc 可能對(duì)M02 具有特異抗性。CR004、CR007 和 CR021 是 3份比較特殊的材料，其中 CR004 和 CR007 對(duì)根腫菌M01、M02和M03都表現(xiàn)出抗性但只含有抗病基因 CRk，CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因 Crr2 和 CRk；由于本試驗(yàn)感病材料中也含有基因 Crr2 和 CRk，因此推測(cè)這3份材料中可能還含有其他抗病基因，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)對(duì) 24 份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定，首次明確了它們對(duì) 3 個(gè)不同地區(qū)根腫菌的抗性，并篩選出 10 份抗病材料。同時(shí)，利用已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記對(duì) 24 份材料進(jìn)行了分子鑒定，明確了與材料抗病性相關(guān)的基因，對(duì)今后抗病材料的篩選和抗病基因的分子聚合育種具有較高的參考價(jià)值。參考文獻(xiàn)柴阿麗，朱發(fā)娣，王惟萍，石延霞，謝學(xué)文，李寶聚2015十字花科根腫病接種技術(shù)及發(fā)病條件研究華北農(nóng)學(xué)報(bào)，（S1）：266-271丁云花，簡(jiǎn)元才，余陽(yáng)俊，汪維紅，耿麗華，康俊根2013我國(guó)8 省市十字花科蔬菜根腫菌生理小種的鑒定中國(guó)蔬菜，（16）：85-88李寧，趙利民，魚(yú)昭君，陳紅紅，惠麥俠2015大白菜品種對(duì)陜西省太白縣根腫病的抗性鑒定中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，31（34）：173-176劉峰，張麗輝，姬廣海2013 云南和西藏十字花科蔬菜根腫菌生理小種鑒定中國(guó)蔬菜，（20）：77-78彭沙莎，任佐華，黃小莉，劉敏捷，孫良菲，劉二明2013湖南十字花科作物根腫菌生理小種鑒定長(zhǎng)江蔬菜，（6）：46-49樸鐘云，吳迪，王淼，張騰2010大白菜抗根腫病近等基因系的分子標(biāo)記輔助選育園藝學(xué)報(bào)，37（8）：1264-1272沈向群，聶凱，吳瓊，張玉光，孟星河2009大白菜根腫病主要生理小種種群分化鑒定初報(bào)中國(guó)蔬菜，（8）：59-62孫保亞，沈向群，郭海峰，周永紅2005十字花科植物根腫病及抗病育種研究進(jìn)展中國(guó)蔬菜，（4）：34-37王彤彤，張淑江，章時(shí)蕃，李菲，張慧，孫日飛2012大白菜根腫病抗性基因的標(biāo)記和定位中國(guó)蔬菜，（14）：31-35楊永林1990十字花科蔬菜根腫病抑菌型土壤初探植物保護(hù)學(xué)43新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)病蟲(chóng)防控 研究論文中 國(guó) 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES報(bào)，17（2）：127-131ChenJ，Jing J，Zhan Z2013Identification ofnovelQTLsforisolate-specificpartialresistancetoPlasmodiophora brassicain Brassica rapaPLoSOne，8（12）：e85307ChenL，ZhangX，XuH2016Introgressionofclubrootresistanceintoanelitepakchoiinbredlinethroughmarker-assistedintrogressionbreedingPlantBreeding，135（4）：471-475ChuM，Song T，falk K，Zhang X，Liu X，Chang A2014Fine mappingofRcr1andanalysesofitseffectontranscriptomepatternsduringinfectionbyPlasmodiophora brassicaeBMC Genomics， 10.1186/1471-2164-15-1166GaoF，Hirani AH，Liu J，Liu Z，F(xiàn)u G，Wu C，Peter BE，McVettyPBE，Li G2014Fine mappingaclubrootresistancelocusinChinesecabbageJAmerSocHortSci，139（3）：247-252HatakeyamaK，Niwa T，Kato T，Ohara T，Kakizaki T，Matsumoto S2017The tandemrepeatedorganizationofNB-LRRgenesintheclubroot-resistantCRblocusinBrassica rapaLMolecular GeneticsandGenomics292（2）：397-405HayashidaN，Takabatake Y，Nakazawa N2008Construction ofapracticalSCARmarkerlinkedtoclubrootresistanceinChinesecabbage，with intensiveanalysisofHC352bgenesJournal oftheJapaneseSocietyforHorticulturalScience，77（2）：150-154HiraiM，Harada T，Kubo N，sukada M，Suwabe K，Matsumoto S2004A novellocusforclubrootresistanceinBrassica rapaanditslinkagemarkersTheoretical andAppliedGenetics，108（4）：639-643KarlingJS1968The plasmodiophorales：including acompletehostindex，bibliography，and adescriptionofdiseasescausedbyspeciesofthisorderMolecular Biology&amp;Evolution，22（3）：582-588KatoT，Hatakeyama K，F(xiàn)ukino N，Matsumoto S2013Fine mappingoftheclubrootresistancegeneCRbanddevelopmentofausefulselectablemakerinBrassica rapaBreedingSci，6（3）：116-124KawamuraK，Shimizu M，Kawanabe T2017Assessment ofDNAmarkersforseedcontaminationtestingandselectionofdiseaseresistanceincabbageEuphytica，213（1）：28KuginukiY，Yoshikawa H，Hirai M1999Variation invirulenceofPlasmodiophora brassicaeinJapantestedwithclubroot-resistantcultivarsofChinesecabbage（ Brassica rapaL ssp.pekinensis）European JournalofPlantPathology，105（4）：327-332LiuB，WangY，ZhaiW，DengJ，WangH，CuiY，ChengF，WangXW，WuJ2013Development ofInDelmarkersforBrassica rapabasedonwhole-genomere-sequencingTheoretical andAppliedGenetics，126（1）：231-239MatsumotoES，Ueno HS，Aruga D2012Accumulation ofthreeclubrootresistancegenesthroughmarker-assistedselectioninChinesecabbage（ Brassica rapassp.pekinensis）Journal oftheJapaneseSocietyforHorticulturalSciences，81（2）：184-190McCouchSR，Chen X，Panaud O1997Microsatellite markerdevelopment，mapping andapplicationsinricegeneticsandbreedingPlantMolecularBiology，35：89-99MurrayMG，Thompson WF1980Rapid isolationofhigh-molecularweightplantDNANucleicAcidsResearch，8：4321-4325PiaoZY，Deng YQ，Choi SR2004SCAR andCAPSmappingofCRb，a geneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage（ Brassica rapassp.pekinensis）Theoretical andAppliedGenetics，108（8）：1458-1465SaitoM，Kubo N，Matsumoto S，Suwabe K，Tsukada M，Hirai M2006Fine mappingoftheclubrootresistancegene， crr3，in Brassica rapaTheorApplGenet，114：81-91SakamotoK，Saito A，Hayashida N，Taguchi G，Matsumoto E2008Mapping ofisolate-specificQTLsforclubrootresistanceinChinesecabbage（ Brassica rapaL.ssp.pekinensis）Theoretical andAppliedGenetics，117（5）：759-767SuwabeK，Tsukazaki H，Lketani H2003Identification oftwolociforresistancetoclubroot（ Plasmodiophoru brassicae Worenin）in Brassica rapa LTheoretical andAppliedGenetics，107（6）：997-1002SuwabeK，Tsukazaki H，Iketani H，Hatakeyama K，Kondo M，F(xiàn)ujimuraM，Nunome T，F(xiàn)ukuoka H，Hirai M，Matsumoto S 2006Simplesequencerepeat-basedcomparativegenomicsbetweenBrassica rapa andArabidopsis thaliana：the geneticoriginofclubrootresistanceGenetics，173（1）：309-319UenoH，Matsumoto E，Aruga D，Kitagawa S，Matsumura H，HayashidaN2012Molecular characterizationoftheCRageneconferringclubrootresistanceinBrassica rapaPlant MolBiol，80：621-629ZhangT，Zhao Z，Zhang C2014Fine geneticandphysicalmappingoftheCRb geneconferringresistancetoclubrootdiseaseinBrassica rapaMolecularBreeding，34（3）：1173-1183ZhangH，F(xiàn)eng J，Zhang S2015Resistance toPlasmodiophora brassicaeinBrassica rapaandBrassica juncea genotypesfromChinaPlantDisease，99（6）：776-779Anti-sources Screening and Molecular Marker Identification of Chinese Cabbage Against Clubroot ZHUMing-zhao，ZHANG Shu-jiang，ZHANG Hui，ZHANG Shi-fan，LI Fei，WANG Xiao-wu，WU Jian，LIGuo-liang，WEIYun-xiao，YUELi-xin，SUNRi-fei*（ InstituteofVegetablesandFlowers， ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Beijing100081， China）44新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)病蟲(chóng)防控 研究論文中 國(guó) 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES黃瓜棒孢葉斑病病原菌RFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建謝學(xué)文 張自心 武 軍 石延霞 柴阿麗 李寶聚*（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要：由多主棒孢（ Corynespora cassiicola）侵染引起的黃瓜棒孢葉斑病已成為我國(guó)黃瓜生產(chǎn)上的重要新流行病害，目前尚缺乏抗性品種，病原菌侵染機(jī)制及與寄主的互作關(guān)系尚不清楚。為了開(kāi)展多主棒孢的病原學(xué)研究，本試驗(yàn)采用農(nóng)桿菌基因介導(dǎo)技術(shù)（ATMT），獲得了紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的多主棒孢轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化株在 PDA 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接 6 次后仍能在菌絲和分生孢子上發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，生物學(xué)測(cè)定和致病性測(cè)定結(jié)果表明該轉(zhuǎn)化株與野生型菌株無(wú)顯著差異。關(guān)鍵詞：黃瓜棒孢葉斑??；多主棒孢；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；RFP染逾530種植物。國(guó)內(nèi)外有關(guān)該病菌的研究主要集中在生物學(xué)特性、遺傳穩(wěn)定性和抗藥性等方面（Dixonetal.，2009；Miyamotoetal.，2010；高葦?shù)龋?012；李寶聚 等，2012；Déon etal.，2014），對(duì)多主棒孢致病機(jī)理及侵染途徑方面研究較少。紅色熒光蛋白（red fluorescentprotein，RFP）最早從印度洋 - 太平洋地區(qū)的珊瑚蟲(chóng)中分離而得，在不同溫度和 pH 條件下具有較高的穩(wěn)定性，且與其他蛋白形成的融合蛋白通常仍具有熒光，因其具有易于檢測(cè)、熒光穩(wěn)定、無(wú)毒害、種屬通用、易于構(gòu)建載體、可進(jìn)行活細(xì)胞定位定時(shí)觀察等特性而得到廣泛關(guān)注（Lorang etal.，2001）。RFP 隨機(jī)插入真菌基因組中，可直觀、快速、簡(jiǎn)便地動(dòng)態(tài)觀察謝學(xué)文，助理研究員，專業(yè)方向：植物病理學(xué)，E-mail：xiexuewencaas.cn * 通訊作者（Corresponding author）：李寶聚，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜病害綜合防治，E-mail：libaojucaas.cn收稿日期：2017-10-24；接受日期：2017-12-06基金項(xiàng)目 ：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401888），國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-25）黃瓜（ Cucumis sativus L.）是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，種植面積居世界首位，且逐年增加。近幾年，由多主棒孢（ Corynespora cassiicola）侵染引起的黃瓜棒孢葉斑病成為危害我國(guó)黃瓜生產(chǎn)的重要新流行病害（李寶聚 等，2008；韓小爽 等，2011；楊雙娟 等，2012），危害范圍和程度甚至超過(guò)霜霉病和白粉病。該菌寄主范圍廣泛，能夠侵Abstract：Twenty-four Chinesecabbage（ Brassica rapa L.ssp.chinensis）materials wereinoculatedwith3kindsofPlasmodiophora brassicaeM01，M02 andM03，and allthelineswereidentifiedbymolecularmarkersinordertoobtainexcellentanti-sourcesandtoconfirmallmaterialscontainingdiseaseresistantgenes.Theresultsshowedthattherew</p>