UK1蛋白互作分析

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白菜翻譯起始因子eIF（iso）4E.a/c與蕪菁花葉病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2017， 44 (7)： 1299 1308. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0168； http： /www. ahs. ac. cn                                                 1299 收稿日期： 2017 03 17；修回日期： 2017 05 09 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31372069）；十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（ 2013BAD01B04-03）；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 * 對(duì)本文貢獻(xiàn)相同  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： sunrifeicaas.cn； Tel： 010-82109511）  白菜翻譯起始因子 eIF(iso)4E.a/c 與蕪菁花葉病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析  李國(guó)亮*，錢  偉*，張淑江，李  菲，章時(shí)藩，張  慧，謝露露，武  劍，王曉武，孫日飛*（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京  100081）  摘  要：為闡明白菜翻譯起始因子異構(gòu)體 eIF(iso)4E 的表達(dá)特性，以及該異構(gòu)體與蕪菁花葉病毒（ TuMV）的互作關(guān)系，在白菜極早春中克隆了 eIF(iso)4E.a 基因，在 BP8407中克隆了 eIF(iso)4E.c基因。這兩個(gè)基因長(zhǎng)度一致，均編碼 200 個(gè)氨基酸。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明： eIF(iso)4E.a僅與 TuMV-C4 株系互作，而不與 TuMV-UK1 株系互作； eIF(iso)4E.c 僅與 TuMV-UK1 株系互作，而不與TuMV-C4 株系互作。對(duì)白菜 eIF(iso)4E 蛋白氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)： eIF(iso)4E 蛋白包含帽結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)， eIF(iso)4E.a 和 eIF(iso)4E.c 蛋白間存在 20 個(gè)差異氨基酸，其中 17 個(gè)差異氨基酸位于帽結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)上； TuMV-C4 VPg 與 TuMV-UK1 VPg 蛋白有 4 個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)。通過對(duì) TuMV 不同株系的 VPg蛋白（病毒基因組連接蛋白）氨基酸序列頻率分析發(fā)現(xiàn)，在 4 個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)處，氨基酸的使用頻率具有選擇性。  關(guān)鍵詞：白菜； eIF(iso)4E； TuMV； VPg（ virus genome-linked protein）；互作關(guān)系  中圖分類號(hào)： S 634       文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A        文章編號(hào)： 0513-353X（ 2017） 07-1299-10 Analysis of the Protein Interaction of eIF(iso)4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis  LI Guoliang*， QIAN Wei*， ZHANG Shujiang， LI Fei， ZHANG Shifan， ZHANG Hui， XIE Lulu，WU Jian， WANG Xiaowu， and SUN Rifei*（ Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）  Abstract： To clarify the expression characteristics of eukaryotic initiation factors eIF(iso)4E and the interaction relationship of eIF(iso)4E with TuMV VPg， the eIF(iso)4E.a and eIF(iso)4E.c genes were cloned from the Brassica rapa ssp. chinensis materials Jizaochun and BP8407 ， respectively. Both of the two genes could encode 200 amino acids. The yeast two-hybridand bimolecular fluorescence complementation（ BiFC） results showed that TuMV-C4 could only interact with eIF(iso)4E.a， instead of eIF(iso)4E.c； the TuMV-UK1 could only interact with eIF(iso)4E.c， instead of eIF(iso)4E.a. Analyzing the  Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIF(iso)4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1300                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (7)： 1299 1308. amino acid sequence and the domain tertiary structure of eIF(iso)4E protein revealed that it contained the cap-reception site. There were 20 different amino acids between eIF(iso)4E.a and eIF(iso)4E.c， 17 of which were located in the cap-reception site（ accounting for 85%） . Through aligning the TuMV-C4/UK1 VPg amino acid sequences， four different amino acids were found； and after comparative analyzing the sequences from different TuMV strains， the frequency of the amino acids had certain selectivity in the four amino acid points. Keywords： Brassica rapa ssp. chinensis； eIF(iso)4E； TuMV； VPg（ virus genome-linked protein）；protein interaction  翻譯起始因子 eIF4E 所編碼的蛋白又稱為帽結(jié)合蛋白（ cap binding protein， CBP），是真核生物中一種相對(duì)分子量為 24 000 的細(xì)胞質(zhì)蛋白，能夠與 mRNA 帽子或帽子同系物特異地交叉結(jié)合，在蛋白質(zhì)翻譯的過程中起核心作用（盧航  等， 2007）。  蕪菁花葉病毒（ Turnip mosaic virus， TuMV）是引起白菜病害的主要病原。 TuMV VPg 蛋白是一種多功能蛋白，在病毒侵染過程中起重要作用，可與寄主擬南芥的翻譯起始因子 eIF(iso)4E 互作，調(diào)控病毒 RNA 翻譯的起始（ Duprat et al.， 2002）；酵母雙雜交試驗(yàn)表明，擬南芥的翻譯起始因子 eIF4E以及其異構(gòu)體 eIF(iso)4E 可以同 TuMV-VPg 相互作用（ Wittmann et al.， 1997； Léonard et al.， 2000），而煙草 eIF4E 和 eIF(iso)4E 僅與 TuMV-NIa 相互作用（ Schaad et al.， 2000）； Gallois 等（ 2010）通過酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， TuMV 的 UK1 和 CDN1 株系 VPg 蛋白只能和擬南芥的 eIF(iso)4E 拷貝互作，而不能和 eIF4E 拷貝互作；在擬南芥 eIF(iso)4E 基因的帽結(jié)合蛋白中，將第 46 和 92 位氨基酸 Trp突變?yōu)?Leu 后， eIF(iso)4E 就不能與病毒 VPg 互作（ Miyoshi et al.， 2006）； Dinkova 等（ 2016）發(fā)現(xiàn)辣椒 eIF4E 的 94、 107 位氨基酸突變后，將影響 TuMV VPg 與 eIF4E 的互作，但 eIF4E 其他位置的突變，對(duì)二者的互作沒有影響，由此可知關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變化對(duì)其功能的表達(dá)具有重要的影響。  白菜 eIF(iso)4E 有 3 個(gè)拷貝，為 eIF(iso)4E.a、 eIF(iso)4E.b 和 eIF(iso)4E.c，其中 eIF(iso)4E.b 為假基因（ Jenner et al.， 2010）。以白菜抗 TuMV 高代自交系 BP8407和感 TuMV 高代自交系極早春為親本，構(gòu)建 F2家系，通過遺傳分析和基因定位研究發(fā)現(xiàn)， eIF(iso)4E.a 基因序列存在 SNP多態(tài)性，與病毒抗性密切相關(guān)（ Qian et al.， 2013）。目前白菜抗 TuMV 研究中， eIF4E、 eIF(iso)4E不同拷貝與 TuMV 不同株系間的互作關(guān)系并不明確，互作過程中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)也需深入探究。  本研究中在白菜極早春中克隆了 eIF(iso)4E.a 基因，在 BP8407中克隆了 eIF(iso)4E.c 基因，通過酵母雙雜交試驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， eIF(iso)4E.a 和 eIF(iso)4E.c 可以與 TuMV 的不同株系進(jìn)行互作；蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，決定 eIF(iso)4E 與 TuMV VPg 互作的關(guān)鍵氨基酸位于帽結(jié)合蛋白和帽狀蛋白上，且特定位點(diǎn)上的氨基酸具有選擇偏好性。白菜中抗 TuMV 的不同基因，對(duì)TuMV 不同株系的抗性也不一樣，通過進(jìn)一步明確白菜 eIF(iso)4E 與 TuMV 的互作關(guān)系，闡明不同抗性材料對(duì) TuMV 的抗性范圍，為白菜抗 TuMV 的性狀改良提供理論依據(jù)，同時(shí)也為揭示二者互作的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  材料  白菜 BP8407 ，為抗 TuMV 的高代自交系；白菜極早春，為感 TuMV 的高代自交系；芥李國(guó)亮，錢  偉，張淑江，李  菲，章時(shí)藩，張  慧，謝露露，武  劍，王曉武，孫日飛 . 白菜翻譯起始因子 eIF(iso)4E.a/c 與蕪菁花葉病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2017， 44 (7)： 1299 1308.                                                                                  1301 菜 Tendgreen ，為高感 TuMV 材料，由英國(guó)華威大學(xué)的 John A. Walsh 惠贈(zèng)。上述 3 種材料于 2016年 4 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所玻璃溫室種植。 pGBKT7/pGADT7 酵母載體、酵母 AH109菌株、 pSPYNE/pSPYCE 載體以及農(nóng)桿菌 EHA105 菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所大白菜遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。  質(zhì)粒小提試劑盒、 DNA 標(biāo)記、 DNA 擴(kuò)增酶、 DNA 回收試劑盒以及 RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司； RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和克隆載體 pEASY-T1 Cloning Kit 購(gòu)自全式金（北京）有限公司； T4 連接酶， EcoR、 BamH、 Cla和 Xho限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 NEB 公司；酵母雙雜交系統(tǒng)（ Matchmarker Gold Yeast Two-Hybrid System）、 Aureobasidin A（ AbA）、 X-Gal、 YPD、YPDA 及各種酵母缺陷型培養(yǎng)基購(gòu)自 Clontech 公司。  1.2  白菜 eIF(iso)4E 和 TuMV VPg 基因克隆及酵母載體的構(gòu)建  白菜 eIF(iso)4E.a 基因編號(hào)為 Bra035393， eIF(iso)4E.c 基因編號(hào)為 Bra035531（ http： / brassicadb.org/brad/）。在基因 3和 5端設(shè)計(jì)引物 bio120854/bio120855（已加入 EcoR和 Xho的酶切位點(diǎn)，表 1）。 2016 年 5 月，取白菜 BP8407和極早春的新鮮葉片，提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)體系為 15 L，包括 10 × PCR 緩沖液， 0.25 mmol · L-1 dNTPs， 1.0 mol · L-1上、下游引物， 50 ng · L-1模板 DNA， 1 U Taq。 PCR 循環(huán)程序?yàn)椋?94 變性 5 min， 94 變性 40 s， 55 退火 40 s， 72 延伸 50 s， 35 個(gè)循環(huán)。 2%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目標(biāo)片段，獲得eIF(iso)4E.a 和 eIF(iso)4E.c 基因，分別連接到 pEASY-T1 載體上（參考全式金 pEASY-T1 載體克隆說明書）進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)驗(yàn)證后將上述兩個(gè)基因分別構(gòu)建酵母誘餌質(zhì)粒 pGADT7 eIF(iso)4E.a 和pGADT7 eIF(iso)4E.c 載體。  表 1  擴(kuò)增 eIF(iso)4E 和 TuMV VPg 的引物序列  Table 1  The primers of amplifying eIF(iso)4E and TuMV VPg 引物名稱 Primer name 引物序列 Primer sequence（ 5 3）  bio120213 CCCATATGATGGCGAAAGGCAAGAGGCbio120214 CCCCGGGTCACTCGTGGTCCACTGGGAbio120854 GGAATTCATGGCGACAGAGGATGTGAACGAbio120855 CCTCGAGGTCAGACACTAAATCGACTTCTTCBiFC-120213-In CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAAAGGCAAGAGG BiFC-120214-In GAGCGGTACCCTCGAGCTCGTGGTCCACTGGGACGAG BiFC-120854-In CGCCACTAGTGGATCCATGGCGACAGAGGATGTGBiFC-120854-In GAGCGGTACCCTCGAGGACACTAAATCGACTTCTTCTuMV-C4 毒源擴(kuò)繁材料選用易感 TuMV 的芥菜材料 Tendgreen ， 2016 年秋季玻璃溫室播種，三葉期人工摩擦接種 TuMV-C4 株系。取 80 保存的 TuMV-C4 毒源病葉 1 g，放入高溫滅菌過的研缽中，加入磷酸鹽緩沖液（ 0.05 mol · L-1， pH 7.0） 5 mL，研磨成漿，雙層紗布過濾毒液。在三葉期芥菜葉片表面撒少量金剛砂，人工摩擦接種， 20 d 后取感病葉片提取 RNA，進(jìn)行 RT-PCR 驗(yàn)證接種效果。以 bio120213/bio120214 為引物（包含 Xma和 Nde酶切位點(diǎn)，表 1），擴(kuò)增 TuMV-C4/UK1 VPg 基因，分別克隆到 pEASY-T1 載體上，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將上述 TuMV-C4/UK1 VPg 基因分別構(gòu)建酵母獵物質(zhì)粒 pGBKT7 C4 VPg 和 pGBKT7 UK1 VPg。  1.3  酵母質(zhì)粒自激活與毒性檢測(cè)及酵母雙雜交試驗(yàn)  參考 Clontech 公司 Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手冊(cè)。從 YPDA 固體培養(yǎng)基上挑選直徑Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIF(iso)4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1302                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (7)： 1299 1308. 為 2 3 mm 的酵母 AH109 單菌落，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。采用醋酸鋰激活轉(zhuǎn)化法，分別將重組質(zhì)粒 pGBKT7 TuMV VPg 和 pGADT7 eIF(iso)4E 轉(zhuǎn)化到酵母 AH109 感受態(tài)細(xì)胞中，同時(shí)將酵母雙雜交系統(tǒng)自帶的 pGBKT7-Lam 陰性對(duì)照和 pGADT7-53 陽性對(duì)照分別轉(zhuǎn)化到酵母 AH109 感受態(tài)細(xì)胞中。上述酵母轉(zhuǎn)化子分別涂在 SD/ Trp 和 SD/ Leu 固體平板上， 30 培養(yǎng) 3 5 d，進(jìn)行自激活和毒性檢測(cè)。陽性對(duì)照正常生長(zhǎng)，陰性對(duì)照不長(zhǎng)菌，說明該酵母雙雜交系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)可靠（酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)具體流程請(qǐng)參考 Clontech 公司操作說明書）。  從酵母 AH109 轉(zhuǎn)化子中分別挑取單個(gè)陽性克隆于 450 µL 液體 YPDA 培養(yǎng)基中混勻， 30 中培養(yǎng) 20 24 h，取適量混合菌液涂于 SD/ Trp、 SD/ Leu 和 SD/ Leu/ Trp（以下簡(jiǎn)稱 -TL）固體培養(yǎng)基上， 30 倒置培養(yǎng) 3 5 d 至陽性克隆出現(xiàn)。在 SD/ Leu/ Trp 固體培養(yǎng)基上挑取陽性克隆分別涂于 SD/ Leu/ Trp/ AbA（以下簡(jiǎn)稱 -TAL）和 SD/ Leu/ Trp/ AbA/ His（以下簡(jiǎn)稱 -THAL）固體培養(yǎng)基上， 30 培養(yǎng) 3 5 d，觀察是否有陽性克隆出現(xiàn)。  1.4  雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)  雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)（ BiFC）即將熒光蛋白分子的兩個(gè)互補(bǔ)片段分別與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，如果熒光蛋白活性恢復(fù)，則表明兩個(gè)目標(biāo)蛋白發(fā)生了相互作用。在白菜 eIF(iso)4E 基因 3和 5端設(shè)計(jì)引物 BiFC-120854-In/BiFC-120855-In（已加入 BamH和 Xho的酶切位點(diǎn)，表 1），將白菜 eIF(iso)4E.a和 eIF(iso)4E.c 基因構(gòu)建 pSPYNE 載體；在 TuMV VPg 基因 3 和 5 端設(shè)計(jì)引物BiFC-120213-In/BiFC-120214-In（已加入 Cla和 Xho的酶切位點(diǎn)，表 1），將 TuMV-C4/UK1 VPg基因構(gòu)建 pSPYCE 載體。將上述載體組合轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌 EHA105 菌株中，注射到 4 6 葉期的本氏煙葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)， 2 3 d 后取葉片背面表皮細(xì)胞，在共聚焦激光掃描顯微鏡（ Laser Scanning Confocal Microscope）下進(jìn)行觀察鑒定。  1.5  白菜 eIF(iso)4E 和 TuMV VPg 蛋白序列和結(jié)構(gòu)分析  利用 SWISS-MODLE 軟件（ http： /swissmodel.expasy.org/）對(duì) eIF(iso)4E 蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用 Protscale 軟件對(duì) eIF(iso)4E 和 TuMV VPg 蛋白序列進(jìn)行親水 /疏水性分析；利用 WebLogo（ http： /weblogo.berkeley.edu/）對(duì) eIF(iso)4E 蛋白氨基酸序列頻率進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用 DNAMAN 軟件（ DNAMAN Vision 4.0）進(jìn)行序列比對(duì)，酶切位點(diǎn)分析及克隆載體分析。  2  結(jié)果與分析  2.1  酵母雙雜交試驗(yàn)分析 TuMV 與白菜 eIF(iso)4E 的互作關(guān)系  將白菜極早春中克隆的 eIF(iso)4E.a 基因和白菜 BP8407中克隆的 eIF(iso)4E.c 基因，分別構(gòu)建酵母誘餌質(zhì)粒 pGADT7 eIF(iso)4E.a 和 pGADT7 eIF(iso)4E.c 載體。將已構(gòu)建好的酵母獵物質(zhì)粒 pGBKT7 C4 VPg 和 pGBKT7 UK1 VPg 分別與上述酵母誘餌質(zhì)粒組合，轉(zhuǎn)化到酵母 AH109 菌株中，在 SD/ Leu/ Trp 固體培養(yǎng)基上， 30 培養(yǎng) 3 5 d。陽性對(duì)照生長(zhǎng)白色菌落，陰性對(duì)照未長(zhǎng)菌。挑取 SD/ Leu/ Trp 固體培養(yǎng)基上的單菌落，轉(zhuǎn)接到 SD/ Leu/ Trp/ His 和 SD/ Leu/ Trp/ His/ Ade固體培養(yǎng)基上， 30 培養(yǎng) 3 5 d。  酵母雙雜交試驗(yàn)表明（圖 1）， pGBKT7 C4 VPg 與 pGADT7 eIF(iso)4E.a 組合，在 THAL 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而 pGBKT7 C4 VPg 與 pGADT7 eIF(iso)4E.c 組合，僅能在 TL 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，李國(guó)亮，錢  偉，張淑江，李  菲，章時(shí)藩，張  慧，謝露露，武  劍，王曉武，孫日飛 . 白菜翻譯起始因子 eIF(iso)4E.a/c 與蕪菁花葉病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2017， 44 (7)： 1299 1308.                                                                                  1303 說明 TuMV-C4 VPg 僅與 eIF(iso)4E.a 互作，而與 eIF(iso)4E.c 不互作； pGBKT7:UK1 VPg 與pGBKT7:C4 VPg 的結(jié)果相反，即 TuMV-UK1 VPg 僅與 eIF(iso)4E.c 互作，而與 eIF(iso)4E.a 不互作。  圖 1  利用酵母雙雜交檢測(cè) UK1/C4 VPg 和 eIF(iso)4E.a/c 之間的互作關(guān)系  Fig. 1  The interactions relationship between UK1/C4 VPg and eIF(iso)4E.a/c in yeast two-hybrid assays TL： SD/-Leu/-Trp； THAL： SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade. 2.2  雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)確定白菜 eIF(iso)4E 與 TuMV 的互作關(guān)系  為了進(jìn)一步驗(yàn)證酵母雙雜交的結(jié)果，分別將 TuMV VPg 和 eIF(iso)4E 構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體pSPYNE 和 pSPYCE，即為 YNE C4 VPg， YNE UK1 VPg， YCE eIF(iso)4E.a 和 YCE eIF(iso)4E.c。將上述載體組合，聯(lián)同共轉(zhuǎn)化載體 P15 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 EHA105 中，注射到煙草葉肉細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。取葉片下表皮在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察（圖 2），發(fā)現(xiàn) YNE C4 VPg/ YCE eIF(iso)4E.a和 YNE:UK1 VPg/ YCE eIF(iso)4E.c 組合能夠檢測(cè)到較強(qiáng)黃色熒光信號(hào)，表明上述兩個(gè)組合在煙草葉肉細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用；而 YNE C4 VPg/ YCE eIF(iso)4E.c 和 YNE UK1 VPg/ YCE eIF(iso)4E.a組合未檢測(cè)到黃色熒光信號(hào)，表明二者在煙草體內(nèi)未發(fā)生互作。  圖 2  煙草葉片下表皮細(xì)胞的熒光共聚焦檢測(cè)  Fig. 2  Identification in the mesophyll cells of Nicotiana by bimolecular fluorescence complementation technology Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIF(iso)4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1304                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (7)： 1299 1308. 2.3  白菜 eIF(iso)4E 蛋白和 TuMV VPg 蛋白氨基酸性質(zhì)分析  利用 Protscale 軟件對(duì) eIF(iso)4E.a 蛋白序列進(jìn)行親水 /疏水性分析。氨基酸分值越高疏水性越強(qiáng)，分值越低親水性越強(qiáng)。圖 3 顯示，第 144 位氨基酸 Leu 分值最高（ 1.82），疏水性最強(qiáng)；第 194 位氨基酸 Arg 分值最低（ 2.83），親水性最強(qiáng)。由圖 3 還可以看出 eIF(iso)4E.a 蛋白親水性氨基酸數(shù)量明顯多于疏水性氨基酸，在蛋白序列中不均勻分布，推斷為可溶性蛋白。同時(shí)對(duì) TuMV-C4 VPg 蛋白序列進(jìn)行親 /疏水性分析，如圖 4 所示，第 3 位氨基酸 Gly 的分值最低（ 2.9），親水性最強(qiáng)；第152 位氨基酸 Leu 分值最高（ 1.3），疏水性最強(qiáng)，尤其從第 158 位到 162 位氨基酸分值驟降，從 1.3降到 2.7 左右；親 /疏水性嚴(yán)重失衡，親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸，推斷該蛋白也為可溶性蛋白，可以進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)。  圖 3  eIF(iso)4E.a 蛋白的親 /疏水性分布曲線  Fig. 3  The distributing curve of hydrophobicity of eIF(iso)4E.a protein 圖 4  TuMV-C4 VPg 蛋白的親 /疏水性分布曲線  Fig. 4  The distributing curve of hydrophobicityof TuMV-C4 VPg protein 2.4  白菜 eIF(iso)4E 蛋白氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)分析  經(jīng)過對(duì)白菜 eIF(iso)4E.a 與 eIF(iso)4E.c 的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者包括 200 個(gè)氨基酸，二者之間存在 20 個(gè)氨基酸差異（圖 5），其中 17 個(gè)差異氨基酸位點(diǎn)處于帽結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)上（占 85%），進(jìn)一步表明 eIF(iso)4E 帽狀結(jié)構(gòu)蛋白在病毒侵染白菜的過程中起著重要作用。  李國(guó)亮，錢  偉，張淑江，李  菲，章時(shí)藩，張  慧，謝露露，武  劍，王曉武，孫日飛 . 白菜翻譯起始因子 eIF(iso)4E.a/c 與蕪菁花葉病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2017， 44 (7)： 1299 1308.                                                                                  1305 圖 5  白菜 eIF(iso)4E.a/c 氨基酸序列比對(duì)  * 表示一致；表示強(qiáng)相似； . 表示弱相似；空白表示不一致。  Fig. 5  Alignment of eIF(iso)4E.a/c amino acid sequence * represent identity； represent strong similarity； . represent weak similarity； Blank represent not identity. 利用 SWISS-MODLE（ http： /swissmodel.expasy.org/）對(duì)白菜 eIF(iso)4E 蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建以 eIF(iso)4E.a 為例，如圖 6，該蛋白由帽結(jié)合蛋白（ CBP）組成，能夠與病毒的 VPg（帽狀結(jié)構(gòu)蛋白）特異地交叉結(jié)合，二者互作來促使病毒的翻譯、增殖。  圖 6  eIF(iso)4E.a 蛋白結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)分析  Fig. 6  Analysis of eIF(iso)4E.a protein domain tertiary structure 2.5  TuMV VPg 蛋白氨基酸序列及差異氨基酸偏好性分析  利用 DNAMAN 軟件，對(duì) TuMV-UK1 VPg 與 TuMV-C4 VPg 氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者間存在 4 個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，且相對(duì)集中（圖 7），分別是第 89（ F/L）、 105（ N/D）、 114（ P/S）和 119（ M/V）位氨基酸。  在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中，對(duì) TuMV C4 VPg 氨基酸序列進(jìn)行 blast，在檢索到的結(jié)果中選取 TuMV UK1/C1/C2/C3/C4/C5 等 6 個(gè)株系的 VPg 序列（檢索號(hào)分別為 AF169561_1、 AF394601_1、AF395674_1、 AF395675_1、 AF395676_1 和 AF395677_1），對(duì) 81 130 個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行序列頻率分析（圖 8）：第 89 位氨基酸為苯丙氨酸（ F）或亮氨酸（ L），前者為芳香性氨基酸，而后者為脂肪族氨基酸，二者間替換，對(duì) VPg 蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響較大，其中亮氨酸（ L）的使用頻率高于苯丙Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIF(iso)4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1306                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (7)： 1299 1308. 氨酸（ F）。第 105 位氨基酸為天冬氨酸（ D）或天冬酰胺（ N），前者為酸性氨基酸，后者為極性氨基酸，距離氨基較遠(yuǎn)的羧基換成酰胺，酸性明顯降低，二者間的替換使局部蛋白性質(zhì)發(fā)生變化，如圖 8 所示，天冬氨酸（ D）的使用頻率較高。第 114 位氨基酸為絲氨酸（ S）或脯氨酸（ P），第 119位氨基酸為甲硫氨酸（ M）或纈氨酸（ V），在上述兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)處，前者都為極性氨基酸，而后者都為非極性氨基酸，二者側(cè)鏈 R 基團(tuán)的極性不同，相互替換后導(dǎo)致蛋白的極性發(fā)生改變。在第 114位氨基酸位點(diǎn)處，脯氨酸（ P）的使用頻率明顯高于絲氨酸。在 119 位氨基酸位點(diǎn)處，纈氨酸（ V）的使用頻率明顯比甲硫氨酸（ M）高。不同的 TuMV 株系在特定氨基酸位點(diǎn)處，對(duì)氨基酸具有一定的選擇性，不同氨基酸間的替換，決定了其蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和功能表達(dá)的差異。  圖 7  TuMV-UK1/C4 VPg 氨基酸序列分析  * 表示一致；表示強(qiáng)相似； . 表示弱相似。  Fig. 7  Sequence analysis of TuMV-UK1/C4 VPg amino acid * represent identity； represent strong similarity； . represent weak similarity. 圖 8  TuMV VPg 氨基酸（ 81 130）序列頻率分析  Fig. 8  Sequence frequency analysis of TuMV VPg amino acids 3  討論  白菜作物中翻譯起始因子 eIF4E 以及其異構(gòu)體 eIF(iso)4E，在 mRNA 翻譯起始過程中發(fā)揮著重要作用。二者通過與 TuMV-VPg 或 TuMV-HC 蛋白相互作用，對(duì)病毒 mRNA 翻譯起始進(jìn)行干擾，從而影響病毒的侵染（ Freire， 2014）。 Jenner 等（ 2010）在白菜中分離出 eIF(iso)4E 的 3 個(gè)拷貝，即BraA.eIF(iso)4E.a、 BraA.eIF(iso)4E.b 和 BraA.eIF(iso)4E.c，其中在白菜 BAC 文庫中未檢測(cè)到BraA.eIF(iso)4E.b，推測(cè)該拷貝為假基因。 Rusholme 等（ 2007）以大白菜感病材料（ R-o-18）和抗病材料（ BP058）為親本，鑒定了 TuMV 的抗病基因 retr01 和 ConTR01，其中， retr01 為BraA.eIF(iso)4E.a， ConTR01 為 BraA.eIF(iso)4E.c。 Qian 等（ 2013）以白菜感 TuMV 的高代自交系材料極早春和抗 TuMV 的高代自交系 BP8407為親本，構(gòu)建 F2分離群體，通過人工磨擦接李國(guó)亮，錢  偉，張淑江，李  菲，章時(shí)藩，張  慧，謝露露，武  劍，王曉武，孫日飛 . 白菜翻譯起始因子 eIF(iso)4E.a/c 與蕪菁花葉病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2017， 44 (7)： 1299 1308.                                                                                  1307 種 TuMV-C4 株系，采用 ELISA 進(jìn)行植株抗感病鑒定，進(jìn)行抗病性遺傳分析，定位了抗 TuMV 的 retr02基因。 retr02 也對(duì)應(yīng) BraA.eIF(iso)4E.a。由此推測(cè) retr01 和 retr02 基因應(yīng)該為同一個(gè)基因BraA.eIF(iso)4E.a（ Nellist et al.， 2014）。 Li 等（ 2016）根據(jù) BraA.eIF(iso)4E.a 抗性基因中 SNP 位點(diǎn)，開發(fā) dCAPS 和 KASP 標(biāo)記，可高通量鑒定 BraA.eIF(iso)4E.a 位點(diǎn)，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種（ MAS）。  目前白菜中已定位 13 個(gè)抗 TuMV 基因，分別為 TuRB01（ Walsh et al.， 1999）、 TuRB01b（ Fujiwara et al.， 2011）、 TuRB02（ Walsh et al.， 2002）、 TuRB03（ Hughes et al.， 2003）、 TuRB04（ Walsh & Jenner，2002）、 TuRB05（ Walsh & Jenner， 2002）、 retr01/C</p>

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