百合在NaHCO3脅迫下的生理響應機制
<p>園藝學報， 2016， 43 (6)： 1126 1140. Acta Horticulturae Sinica 1126 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0969； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2016 03 17； 修回日期 ： 2016 06 02 基金項目 ： 國家科技支撐計劃項目（ 2012BAD01B07） ；國家社會公益研究專項（ 2005DIB3J022） ；北京市花卉重點項目（ YLHH2006001，YLHH201300101） ；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室項目 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： mingjuncaas.cn） 百合在 NaHCO3脅迫下的生理響應機制 李雅男1，袁素霞1，徐雷鋒1，楊盼盼2，馮亞言1，Younes Pourbeyrami Hir1，明 軍1,*（1中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2南京林業(yè)大學風景園林學院，南京 210037） 摘 要： 比較了耐鹽堿的岷江百合（ Lilium regale Wilson）和對鹽堿敏感的東方百合索邦（ Sorbonne ）在不同濃度的堿性鹽 NaHCO3脅迫下葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、活性氧清除物質(zhì)、離子調(diào)節(jié)物質(zhì)（ Na+、 K+）及有機酸含量的變化，探討百合耐鹽堿的生理機制。研究發(fā)現(xiàn)，兩種百合葉片中各種物質(zhì)的變化趨勢基本相似，但整體上岷江百合的各種物質(zhì)含量或者活性均高于索邦 。隨著 NaHCO3脅迫濃度的增加，兩種百合葉片中的可溶性蛋白、脯氨酸含量增加，可溶性糖含量先升后降； SOD、 GR 的活性和 AsA 的含量先上升后下降， APX 的活性和 GSH 的含量在低濃度脅迫時無明顯變化，高濃度脅迫時顯著下降； 索邦 Na+主要積累在成熟葉和新生葉中，岷江百合則主要積累在莖和成熟葉中，且能維持根、成熟葉和新生葉中較高水平的 K+/Na+值； 岷江百合中的草酸、 乳酸和乙酸含量都一直增加或高于對照， 索邦中的蘋果酸和乙酸含量一直增加。與索邦相比，岷江百合在低濃度 NaHCO3脅迫下提高 SOD 活性和 AsA 含量，高濃度 NaHCO3脅迫下增加可溶性蛋白的含量并保持可溶性糖的穩(wěn)定性 ，是其耐鹽堿性較強的原因之一。 關(guān)鍵詞： 百合；堿性鹽脅迫； NaHCO3；滲透調(diào)節(jié)；活性氧調(diào)節(jié)；離子調(diào)節(jié)；有機酸調(diào)節(jié) 中圖分類號： S 682.2 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2016） 06-1126-15 The Physiological Response of Lily to NaHCO3Stress LI Ya-nan1， YUAN Su-xia1， XU Lei-feng1， YANG Pan-pan2， FENG Ya-yan1， Younes Pourbeyrami Hir1，and MING Jun1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；2College of Landscape Architecture， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China） Abstract： In this experiment， osmotic regulation substances， antioxidant substances and ion were compared between Lilium regale Wilson（ salt tolerance） and Sorbonne （ salt sensitiveness） . The results showed that the change trend of these substances was the same in two lilies and L. regale Wilson produced more substances content than Sorbonne . Soluble protein， proline content increased with the concentration of alkaline-salt（ NaHCO3） increasing. Soluble sugar and AsA content increased under lower concentration of NaHCO3stress， then decreased under higher concentration and the activities of SOD and GR had the same trend. The activities of APX and GSH content decreased sharply under higher concentration of NaHCO3. 李雅男，袁素霞，徐雷鋒，楊盼盼，馮亞言， Younes Pourbeyrami Hir，明 軍 . 百合在 NaHCO3脅迫下的生理響應機制 . 園藝學報， 2016， 43 (6)： 1126 1140. 1127 Na+mainly accumulated in middle leaves and upper leaves in Sorbonne ， but stem and middle leaves in L. regale Wilson. Middle leaves and upper leaves seemed to be main storage organs for Na+in Sorbonne ，but stem and middle leaves in L. regale Wilson. Compared with Sorbonne ， L. regale Wilson had higher K+/Na+ ratios in root， middle leaves and upper leaves. The content of oxalic acid， lactic acid and acetic acid in L. regale Wilson increased， as well as malic acid and acetic acid in Sorbonne . All the data indicated that compared with Sorbonne ， L. regale Wilson could increase SOD activity and AsA content under low concentration of NaHCO3， increase soluble protein content and maintain established soluble sugar content under higher concentration of NaHCO3， all of which are good explanations for its alkaline-salt tolerance. Key words： lily； alkaline-salt stress； NaHCO3； osmotic regulation； antioxidant substances regulation；ion regulation； organic acid regulation 土壤鹽化和堿化常常相伴發(fā)生（ Shi & Wang， 2005； Li et al.， 2010）。已有研究表明，鹽化的土壤會對植物造成滲透脅迫、離子毒害以及活性氧傷害，而堿化的土壤除了這 3 種脅迫之外，還會對植物造成高 pH 的傷害，且這種傷害最為嚴重（ Yin & Shi， 1993）。植物在長期進化過程中對鹽堿脅迫在組織水平上形成了一系列的適應機制，主要包括合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、離子調(diào)節(jié)（ Mahouachi et al.， 2013）、合成有機酸（ Shi & Sheng， 2005）以及合成保護酶等 4 種途徑。 華智銳等（ 2007）對麝香百合組培苗進行 NaCl 脅迫，發(fā)現(xiàn)電導率和 MDA 含量可以作為評價百合抗鹽性的穩(wěn)定指標。劉衛(wèi)衛(wèi)等（ 2011）用不同濃度的 NaCl 處理百合外植體，發(fā)現(xiàn)百合對鹽脅迫特別敏感，隨著鹽濃度的增加，百合不定芽的脯氨酸和丙二醛含量均不斷升高。有關(guān)百合耐鹽突變體的篩選（劉艷妮和王飛， 2010） ，耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的研究工作也有開展（楊宇紅 等， 2007；華智銳 等， 2010） 。但目前多數(shù)研究集中于對中性鹽的脅迫響應上，對于百合在堿性鹽脅迫下響應機制的研究少見報道。 岷江百合（ Lilium regale Wilson）是分布于中國四川岷江流域的原生種，極耐寒，也耐堿性石灰土，在 pH 8.5 的土壤中仍可正常開花結(jié)實，是百合耐鹽堿育種的重要材料（張彩霞 等， 2008）。索邦東方百合則對鹽堿敏感，在 pH > 6.5 的環(huán)境中會生長衰弱，種球生長受阻。本試驗中對這兩種百合在堿性鹽（ NaHCO3）脅迫后的生理響應機制進行比較分析，以期初步了解百合在堿性鹽脅迫下生理生化水平上的 4 種適應機制如何響應，找到百合耐鹽堿的主要途徑及發(fā)揮作用的主要物質(zhì)，確定百合耐鹽堿的適宜評價指標，為耐鹽堿資源篩選和品種選育提供參考依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試驗材料的處理 2015 年 5 9 月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所溫室，挑選生長一致的岷江百合（耐鹽堿）和索邦東方百合（鹽堿敏感）種球栽于底部及周邊打孔的塑料花盆中，以酸洗及清水淋洗的陶粒固定，定期澆灌 1/3 Hoagland 營養(yǎng)液（ pH 6.0） 。溫室內(nèi)相對濕度 70%，溫度 18 22 。定植 1個月后進行 NaHCO3脅迫處理。 共設 6 個處理， 1/3 Hoagland 培養(yǎng)液中添加 NaHCO3后濃度分別為 0（對照， pH 6.0）、 40、 80、120、 160、 200 mmol · L-1（ pH 7.84 8.16），每處理 5 株， 3 次重復，每 5 d 處理 1 次。為避免鹽Li Ya-nan， Yuan Su-xia， Xu Lei-feng， Yang Pan-pan， Feng Ya-yan， Younes Pourbeyrami Hir， Ming Jun. The physiological response of lily to NaHCO3stress. 1128 Acta Horticulturae Sinica， 2016， 43 (6)： 1126 1140. 沖擊效應，各處理逐步遞增到目標濃度，且 全部處理于同一天達到目標濃度，設此時為 NaHCO3脅迫處理第 1 天。 1.2 測定指標及方法 于脅迫處理第 15 天取中位葉片進行生理生化指標的測定。葉綠素含量采用丙酮提取法（李合生， 2001），丙二醛（ MDA）含量采用硫代巴比妥酸法（ Heath & Packer， 1968）測定。質(zhì)膜透性采用電導法（李合生， 2000），可溶性糖含量采用蒽酮比色法（李合生， 2000），可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法（ Marion & Bradford， 1976）測定。脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法（李合生，2000）測定。 維生素 C（ AsA）含量、谷胱甘肽（ GSH）含量、谷胱甘肽還原酶（ GR）活性、抗壞血酸過氧化物酶（ APX）活性和超氧化物歧化酶（ SOD）活性采用北京方程生物科技有限公司試劑盒法測定。草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸和檸檬酸含量測定參照郭立泉（ 2005）的方法略作改動，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所質(zhì)量安全與檢測實驗室完成。 分別取上位新生葉、中位成熟葉、莖和根， 105 殺酶 15 min， 75 烘干，研磨粉碎過篩，準確稱取 0.1 g 經(jīng)濃硝酸消煮，用電感耦合等離子體光譜儀（ ICP-OES）測定 Na+和 K+含量。計算離子吸收和運輸?shù)?K+、 Na+選擇性比率（鄭青松 等， 2001）：離子吸收 ASK，Na = 根（ K+/Na+/介質(zhì)（ K+/Na+）；離子運輸 TSK，Na = 庫器官（ K+/Na+） /源器官（ K+/Na+）。 試驗數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2003 和 SPSS 17.0 軟件進行處理，利用 t 檢驗法進行同一處理兩種百合之間的差異顯著性分析（ P 成熟葉 > 莖 > 根，說明在不同濃度的 NaHCO3處理下，兩種百合均能通過調(diào)節(jié) Na+、 K+的運輸保證生理代謝旺盛的幼嫩組織具有較高的 K+/Na+值，維持正常的生命活動。兩種百合相比，相同濃度 NaHCO3脅迫下，岷江百合除莖外各器官的 K+/Na+值一直明顯高于索邦，表明岷江百合各器官保證了較高的 K+/Na+值，減少 NaHCO3脅迫對各器官的傷害，能夠更好地維持正常的生命活動。 表 1 NaHCO3脅迫對百合不同器官 K+/Na+值的影響 Table 1 K+/Na+ratios in different organs of lily under NaHCO3treatment 岷江百合（ Lilium regale Wilson） 索邦 Sorbonne 根 莖 成熟葉 新生葉 根 莖 成熟葉 新生葉 NaHCO3/（ mmol · L-1）Root Stem Middle leaves Upper leaves Root Stem Middle leaves Upper leaves 0 2.20 a 18.14 a 31.24 a 38.52 a 0.44 a 9.05 a 11.61 a 19.06 a 40 1.30 b 13.58 b 18.58 b 36.67 a 0.41 a 8.38 a 9.72 b 12.30 b 80 1.34 b 7.86 c 9.80 c 18.12 b 0.29 ab 8.43 a 7.45 c 12.23 b 120 1.01 bc 6.38 cd 6.88 d 13.79 c 0.40 a 7.26 ab 6.60 cd 10.29 b 160 0.63 c 5.10 de 6.76 d 15.00 bc 0.18 b 5.72 bc 5.66 de 7.99 b 200 0.89 c 3.80 e 5.77 d 14.49 bc 0.18 b 4.16 c 4.69 e 6.17 b 注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著（ P < 0.05）。 Note： Different lowercase in the same column means significant difference（ P < 0.05） . 李雅男，袁素霞，徐雷鋒，楊盼盼，馮亞言， Younes Pourbeyrami Hir，明 軍 . 百合在 NaHCO3脅迫下的生理響應機制 . 園藝學報， 2016， 43 (6)： 1126 1140. 1135 2.6.4 NaHCO3脅迫對百合K+、Na+吸收和運輸選擇性比率的影響 如表 2 所示， NaHCO3處理下兩種百合根系吸收選擇性比率（ ASK，Na）和岷江百合莖新生葉運輸選擇性比率（ TSK，Na）呈上升趨勢，其余各器官與對照相比并沒有顯著變化，說明 NaHCO3處理使得兩種百合根系 K+向地上運輸?shù)倪x擇性提高。兩種百合相比，索邦的根莖運輸選擇性比率 TSK，Na在各處理下都高于岷江百合，但岷江百合的根吸收 ASK，Na、莖成熟葉、莖新生葉運輸選擇性比率 TSK，Na均高于索邦。說明 NaHCO3處理下，與索邦相比，岷江百合莖具有更強的拒 Na+和吸收 K+的能力。表 2 NaHCO3脅迫對百合 K+、 Na+吸收選擇性比率（ ASK， Na）和運輸選擇性比率（ TSK， Na）的影響 Table 2 Effects of NaHCO3 treatment on K+， Na+absorption（ ASK， Na） and transportation selectivity ratio（ TSK， Na） of lily 岷江百合 Lilium regale Wilson 索邦 Sorbonne TSK， NaTSK， NaNaHCO3/（ mmol · L-1） ASK， Na 根 Root 根 莖 Root stem 莖 成熟葉 Stem middle leaves 莖 新生葉 Stem upper leaves ASK， Na 根 Root 根 莖 Root stem莖 成熟葉 Stem middle leaves 莖 新生葉 Stem upper leaves 0 0.01 d 8.32 ab 1.72 a 2.12 b 0.002 d 21.10 a 1.30 a 2.13 a 40 5.11 c 10.76 a 1.39 abc 2.76 b 1.590 c 21.00 a 1.19 a 1.50 a 80 10.57 b 5.93 bc 1.25 bc 2.30 b 2.260 bc 30.00 a 0.92 a 1.50 a 120 11.84 b 6.41 bc 1.08 c 2.16 b 4.670 a 19.55 a 0.91 a 1.45 a 160 9.91 b 8.24 ab 1.37 abc 3.06 ab 2.900 bc 31.15 a 1.00 a 1.42 a 200 17.49 a 4.43 c 1.56 ab 3.92 a 3.440 ab 25.29 a 1.14 a 1.50 a 注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著（ P < 0.05）。 Note： Different lowercase in the same column means significant difference（ P < 0.05） . 3 討論 目前已有多位學者探討了植物耐鹽堿的生理生化機制，但是基本集中于 4 種生理機制中的一種或兩種，并沒有提出植物耐鹽堿的完整生理途徑。本試驗中對這 4 種生理機制系統(tǒng)進行分析，并找到了其在百合抗鹽堿過程中的作用。 鹽堿脅迫會使植物葉片中的葉綠素含量下降（ Khan， 2003），光合速率降低，影響植物的生長。本研究發(fā)現(xiàn)， NaHCO3脅迫使兩種百合的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量都有所下降， 但是相比于 索邦，岷江百合的葉綠素，尤其是葉綠素 a 的含量和類胡蘿卜素的含量下降幅度較小，能維持在比較穩(wěn)定的水平。相對電導率反映了膜的完整性（ Verslues et al.， 2006）， MDA 則是膜脂過氧化程度的指標（ Meloni et al.， 2003），二者共同反映了細胞的受損程度。本試驗中，岷江百合的相對電導率和 MDA 含量都顯著升高，但上升幅度明顯低于索邦。這說明岷江百合受損程度小于索邦，具有較強的耐鹽堿性。 3.1 岷江百合產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御堿性鹽脅迫 滲透調(diào)節(jié)是植物應對逆境、增強抗性的基礎，也是植物在鹽堿脅迫條件下的適應手段之一?？扇苄蕴牵?Parida et al.， 2002） 、可溶性蛋白和脯氨酸（ Ueda et al.， 2007； Nemat & Hassan， 2012）作為主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對調(diào)節(jié)滲透勢具有重要作用（ Heuer， 1994） 。研究表明，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累越多，對鹽堿的抗性越強（ Munns & Termaat， 1986；李合生， 2002；倪建偉 等， 2012） 。本試驗中，兩種百合葉片中 3 種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)總體上均有所積累，但高濃度 NaHCO3脅迫時，索邦的可溶性糖含量隨著脅迫濃度的增加顯著下降，岷江百合的可溶性糖和可溶性蛋白增加幅度較大?？梢酝茰y，堿性鹽脅迫下，岷江百合的有機物質(zhì)積累多于索邦，是其耐鹽堿的原因之一。 </p>
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