收 稿日期 ：2013-08-20基金項目 ：“十二五”國家科技支撐課題（2011BAD12B03）作者簡介 ：須 暉（1968-），男，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，從事設(shè)施環(huán)境與生態(tài)研究。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，201310，44(5)：585-589Journal of Shenyang Agricultural University，201310，44(5)：585-589連 續(xù)變溫對番茄灰霉病 （Botrytis cinerea）致病性的影響須 暉1a，張麗麗1a，王 倩1b，馬 健1a，王 蕊1a，劉雪飛2（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) a.園藝學(xué)院/設(shè)施園藝省部共建教育部重點實驗室；b.理學(xué)院，沈陽 110161；2. 沈陽市和平區(qū)房產(chǎn)行政管理所，沈陽 110005）摘要 ：為探究連續(xù)變溫對番茄灰霉病致病性影響 ，以中抗性品種 Money Maker 為供試植株 ，在離體葉片上接種 ，在 RH55%，RH75%，RH85%和 RH95%條件下分別設(shè)置 12 個變溫處理 ，研究接種葉片在 5d 內(nèi)病斑生長狀況 。 接種后 24h 開始觀察 ，每隔 12h 觀測 1 次 ,以病斑面積和平均生長速度作為衡量依據(jù) 。 結(jié)果表明 ：培養(yǎng) 5d 后 RH55%、RH75%和 RH85%條件下 10h 和 12h 處理病斑面積明顯大于同濕度其他處理 ；1，2，4，18，20 和 22h 處理生長量出現(xiàn)不同程度的抑制 ，最大抑制作用可達到 70%以上 。 在 RH95%條件下 1，2，4h 處理生長情況明顯低于同濕度其他變溫處理 ， 但 18，20，22h 沒有抑制作用 。 這種抑制作用與低溫或高溫時間在一天當中所占的比例有關(guān) ，24h 內(nèi)溫度低于 15的時間長于 18h 或溫度高于 25時間長于 6h 都會對菌絲產(chǎn)生抑制作用 。關(guān)鍵詞 ：番茄灰霉病 ；連續(xù)變溫 ；致病性 ；病斑面積DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2013.05.014中圖分類號 ：S641.2;S624.3;S436.412.13 文獻標識碼 ： A 文章編號 ： 1000-1700（2013）05-0585-05Effect of Continuous Variable Temperature on Botrytis cinerea to TomatoPathogenicity of MyceliumXU Hui1a, ZHANG Li-li1a, WANG Qian1b, MA Jian1a, WANG Rui1a, LIU Xue-fei2(a. College of Horticulture, Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province; b.College of Sciences, Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161, China; 2. Heping District, Shenyang City the administration of the Estate, Shenyang 110005, China)Abstract： To explore the effect of continuous variable temperature on Botrytis cinerea pathogenicity, the moderate resistantvariety Money Maker was selected for test. In vitro leaves inoculated, and respectively in RH55%, RH75%, RH85%, RH95%each were set up 12 variable temperature of treatments under the condition. Research on the effect of different continuousvariable temperature on leaf lesion on the radial growth was infected by Botrytis cinerea. In every lesion area (mm2) and theaverage growth rate (mm·d-1) were regarded as a measuring basis. The results showed that the growth conditions of 10h and 12htreatment were better than any other under the humidity. Under the situation of RH55%, lesion size was respectively 108.99mm2, 122.47 mm2. Under the situation of RH75%, lesion size was respectively 320.12 mm2, 354.36 mm2. Under the situation ofRH85%, lesion size was respectively 432.55 mm2, 486.30 mm2, other humidity condition of 1h, 2h, 4h, 18h, 20h, 22h treatmentssignificantly inhibited, aximum inhibition degree could reach above 70% . Under conditions of RH95% , the growth rate oftreatment 1h, 2h, 4h was significantly lower than other, but the 18h, 20h, 22h without inhibition. This inhibition was relation tothe proportion of time with low or high temperature in a day.Key words： tomato gray mold rot（Botrytis cinerea）; continuous variable temperature； pathogenicity; lesion size灰霉病 （Botrytis cinerea）是番茄生產(chǎn)中一種嚴重的世界性病害1，主要危害果實造成爛果2,3，嚴重影響番茄品質(zhì)和產(chǎn)量 ，直接影響設(shè)施番茄生產(chǎn)的經(jīng)濟效益4。 長期以來化學(xué)藥劑防治是最有效的防治方法 ,但藥劑防治造成嚴重的環(huán)境污染和病菌抗藥性5。 打破侵染循環(huán)是防治灰霉病的根本 ，研究發(fā)現(xiàn)合理的綜合防治可以有效地打破病害循環(huán)6。 調(diào)節(jié)環(huán)境因子是綜合防治中最有效而安全的防治方法 ，通過改變溫度 、濕度和光照等環(huán)境因子防治番茄灰霉病 , 已收到良好的效果7。研究表明 ，低溫增加番茄灰霉病發(fā)生機率8-9，溫度和相對濕度對灰霉菌菌絲的生活力有直接的影響10-12。在變溫對番茄灰霉病致病性影響研究中 ，前人只設(shè)定恒定晝溫 、恒定夜溫交替變化13-14，并沒有涉及連續(xù)變溫第44卷沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報對番茄灰霉病菌治病性影響的研究 。本研究在人工模擬條件下 ，系統(tǒng)研究連續(xù)變溫對番茄灰霉病菌致病性的影響 ，并進一步探究最適或抑制發(fā)病的連續(xù)變溫條件 ，從而為環(huán)境調(diào)控防治灰霉病提供理論依據(jù) 。1 材料與方法1.1 試驗材料試驗于 2013 年 46 月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院設(shè)施基礎(chǔ)實驗室進行 。 供試灰霉菌 (Botrytis cinerea)菌株由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供 。 經(jīng)分離 、純化 、鑒定后保存?zhèn)溆?。 供試番茄品種為 Money Maker，種植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科研基地 29 號日光溫室中 ，定植于塑料盆 （21cm×21cm）中備用 。1.2 試驗方法1.2.1 連續(xù)變溫調(diào)控 以 24h 為一個變溫周期 ，共設(shè)置 12 個連續(xù)變溫處理 。 各變溫處理都包括低溫區(qū) （12）、適溫區(qū) 、高溫區(qū) （30）。 以 8h 變溫處理為例 ：每天 1:007:00 時間段低溫 12維持 7 h，8:0011:00 時間段適溫區(qū)內(nèi)穩(wěn)步升溫 4h，12:0013:00 時間段 30條件下維持 2h，14:0017:00 時間段適溫區(qū)內(nèi)穩(wěn)步降溫 4h，18:0024:00 時間段 12條件下維持 7 h。 各變溫處理具體變溫見表 1。 連續(xù)變溫條件通過 MLR-350 多功能光照培養(yǎng)箱調(diào)節(jié) （日本三洋公司 ）。時段Time011223344556677889910101111121213131414151516161717181819192020212122222323241h1212121212121212121212153012121212121212121212122h1212121212121212121215303015121212121212121212124h1212121212121212121523303023151212121212121212126h1212121212121212152025303025201512121212121212128h12121212121212151923263030262319151212121212121210h12121212121215182124273030272421181512121212121212h12121212121518202225273030272522201815121212121214h12121212151820212325283030282523212018151212121216h12121215171921232426283030282624232119171512121218h12121518182123252627283030282726252321181815121220h12151919192223262628293030292826262322191919151222h151919192224252627272930302927272625242219191915表 1 各變溫處理 24h 周期內(nèi)溫度變化過程Table 1 Variable temperature treatment within 24h cycle temperature variation process /%1.2.2 飽和鹽溶液調(diào)節(jié)相對濕度 利用飽和鹽溶液法15，在密閉容器 LOCK&LOCK 盒內(nèi)調(diào)節(jié)相對濕度 。 設(shè)置55%、75%、85%和 95%相對濕度的 4 個試驗處理 ,分別用硝酸鎂 、氯化鈉 、溴化鉀 、硝酸鎂飽和鹽溶液調(diào)節(jié) 。 飽和溶液制作方法 ：配置 4 種鹽的飽和鹽溶液 50mL，放入 LOCK&LOCK 盒中備用 。1.2.3 連續(xù)變溫對番茄灰霉病菌菌絲生長及致病性的影響 菌株繼代培養(yǎng)在 PDA 培養(yǎng)基上 ，待菌落長至 5060mm 時打取邊緣直徑 5.0mm 菌片接種于葉背面 。 選取葉齡葉位相同的葉片 ，每片葉子接種 1 個菌片 。 葉柄處586- -須 暉等：連續(xù)變溫對番茄灰霉?。˙otrytis cinerea）致病性的影響第5期用蒸餾水浸濕的脫脂棉包裹 ，放入調(diào)整好濕度的 LOCK&LOCK 盒中 ，每個處理設(shè)置 6 次重復(fù) 。 分別在接種后24，36，48，60，72，84，96，108 和 120h 測量病斑直徑和面積 。2 結(jié)果與分析2.1 RH55%各變溫處理病斑面積隨時間變化在 RH55%的低濕條件 ，各變溫處理之間病斑面積隨時間變化較明顯 （表 2 和圖 1），隨著 24h 內(nèi)適宜溫度的時間增長各變溫處理病斑面積呈現(xiàn)先增后降的趨勢 。1h 到 12h 變溫處理病斑面積呈現(xiàn)逐漸上升趨勢 ，從 14h到 22h 病斑面積緩慢下降 。 12h 和 10h 處理生長速度最快 ，在培養(yǎng) 5d 后病斑面積最大 ，培養(yǎng) 5d 后病斑面積為122.47mm2和 108.99mm2，病斑擴展速度分別為 20.57mm2·d-1和 17.87mm2·d-1，這兩個處理病斑發(fā)展速度明顯快于其他處理 ， 侵染 5d 后病斑面大約在指甲大小 。 其次 8h 處理 5d 后病斑面積達到 76.48mm2， 平均生長速度11.37 mm2·d-1，病斑低于 10h 和 12h 處理 ，高于其他處理病斑面積擴張速度 。 1，6 和 14h 處理生長狀況相似 ，總病斑面積都在 6769mm2之間 ，平均生長速度相近 。 2，16，18，20 和 22h 處病斑面積和病斑擴展平均速度相近 ，且都比較低 。4h 處理病斑面積和擴展速度都最低 ?？傮w看來 ，RH55%相對低濕條件 10h 和 12h 變溫處理對最易于菌絲侵染 ，變溫時間過短和變溫時間過長有抑制菌絲生長 。圖 1 RH55%各變溫處理病斑面積隨時間變化Figure 1 Lesion size of each variable temperature treatment change over time on RH55%2.2 RH75%各變溫處理病斑面積隨時間變化在 RH75%條件下 ，各處理病斑擴展速度明顯加快 ，各個觀測點病斑面積呈線性增長趨勢 （表 2 和圖 2）。 各表 2 各濕度條件下各處理平均生長速度Table 2 Average growth rate processing various relative humidity conditions /mm2·d-1RH /%557585951h9.6333.4040.6461.882h5.2330.8142.7763.204h2.8552.5843.3154.516h9.6559.7676.9794.028h11.3752.1475.5878.2110h17.8760.1082.5958.7512h20.5766.9593.3480.0114h9.9851.2287.7452.0116h4.9264.56104.4775.7718h5.8039.9263.98104.2220h5.9710.5539.14107.6222h5.3232.7470.9898.55時間處理 Time treatment圖 2 RH75%各變溫處理病斑面積隨時間變化Figure 2 Lesion size of each variable temperature treatment change over time on RH75%587- -第44卷沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報處理病斑面積生長量和生長速度最快的是 12h 處理 ，該處理在培養(yǎng) 5d 后病斑面積可達到 354.36 mm2，病斑面積略大于五角錢硬幣 。然后依次是 10，16，6，8，4，14h 處理 。但這 6 個處理整體生長狀態(tài)相似 ，培養(yǎng) 5d 后病斑面積相似 ，在 280320mm2之間 。 病斑擴展速度在 52.1260.56 mm2·d-1之間 ，病斑面積擴展速度略低于 12h 處理 ，高于其他 5 個處理 。 1，2，18，22h 處理與其他處理相比 ，病斑面積和病斑擴展速度都低于上述處理 ，但明顯高于20h 處理 。培養(yǎng) 5d 后 20h 處理的病斑面積最小 ，擴展速度最低 。整體生長狀態(tài)平緩 。總體來說 ，在相對濕度 75%條件下 ，整體生長狀態(tài)更有益于灰霉菌生長 。變溫時間最短的 1h 和 2h 處理和變溫最長 18，20，22h 生長狀態(tài)比較緩慢 。 說明這幾組變溫條件對灰霉病菌絲侵染不利 ，不適宜灰霉病菌絲生長 。圖 3 RH85%各變溫處理病斑面積隨時間變化Figure 3 Lesion size of each variable temperature treatment change over time on RH85%2.3 RH85%各變溫處理病斑面積隨時間變化在 RH85%條件下 ，整體生長狀態(tài)都很好 （表 2 和圖 3）。 培養(yǎng) 5d 后生長最快的 16h 處理病斑面積可達到541.99mm2，其平均生長速度 104.4 mm2·d-1。 培養(yǎng) 5d 后 6，8，10，14，22h 處理生長狀態(tài)和發(fā)病速度相近 ，培養(yǎng) 5d后病斑面積在 400480mm2之間 ，病斑面積在一元錢硬幣面積 （直徑 24mm）左右 ，病斑擴展速度在 75.5893.34mm2·d-1之間 。 生長最緩慢的是 1，2，4，20h 處理 ，培養(yǎng) 5d 后最大病斑面積在 215233 mm2之間 ，病斑擴展速度在 39.1459.7 mm2·d-1。 在 RH85%條件下 ，菌絲發(fā)病速度和侵染能力最強的是 16h 處理 ，6h、8h、10h、14h 和 18h處理對灰霉病菌侵染促進作用明顯 。 生長最緩慢的是 24h 內(nèi)變溫處理時間最短和最長的幾個處理 ， 分別是1，2，4，20h 處理 ，這 4 個變溫處理對灰霉病生長有明顯抑制作用 。圖 4 RH95%各變溫處理病斑面積隨時間變化Figure 4 Lesion size of each variable temperature treatment change over time on RH95%2.4 RH95%各變溫處理病斑面積隨時間變化在 RH95%條件下 ，各處理菌絲侵染的整體趨勢十分相似 （圖 4 和表 2），隨著變溫時間的增長菌絲侵染速度和病斑面積越大 。 整個觀察過程菌絲侵染速度最快的是 18，20，22，6h 處理 ， 培養(yǎng) 5d 后病斑面積可達到489.71557.73mm2，病斑面積可達到總?cè)~面 70%以上 ，菌絲的平均侵染速度在 94.02107.62 mm2·d-1之間 。其次侵染較快的是 12，10，16h 處理 ，培養(yǎng) 120h 后病斑面積分別可達到 398.46mm2、410.67mm2和 419.69mm2，菌絲平均侵染速度分別為 80.01 mm2·d-1、78.21 mm2·d-1和 75.77 mm2·d-1。 在 RH95%高濕條件下生長較為緩慢的是1，2，4，10，14h 處理 ， 雖然是 RH95%條件下生長速度最為緩慢的幾個處理 ， 培養(yǎng) 120h 病斑面積在 279.56335.62 mm2之間 ，平均生長速度在 52.0163.20 mm2·d-1之間 。 總體看來 ，在高濕條件下培養(yǎng) 120h 后變溫時間長的處理更有利于菌絲侵染 ，變溫時間越短對侵染越不利 。588- -須 暉等：連續(xù)變溫對番茄灰霉?。˙otrytis cinerea）致病性的影響第5期3 結(jié)論與討論溫度濕度是番茄灰霉病的發(fā)生發(fā)展必要條件 。 國內(nèi)外的報道表明 ，低溫高濕有利于番茄灰霉病的發(fā)生和發(fā)展16-18，但對連續(xù)變溫對灰霉病發(fā)生發(fā)展相關(guān)報道很少 。 本研究中 ，在 4 個設(shè)定的濕度條件下 ，分別設(shè)置 12個連續(xù)變溫處理 ，研究不同變溫條件對番茄灰霉病的影響 。 結(jié)果表明 ：10h 和 12h 處理與同濕度其他處理相比都是生長情況最好 ，這兩個處理日平均溫度分別為 17.25和 18.08，溫度都在菌絲發(fā)展的適宜溫度范圍內(nèi) ，這與前人的研究結(jié)果相似7,11。 各濕度條件下變溫時間短的 1，2，4h 處理與相同濕度其他處理相比菌絲的發(fā)生發(fā)展都受到明顯的抑制 ，抑制程度同比相同濕度 10h 和 12h 處理可達到 70%。 這可能與一天當中高溫時間 、適宜溫度時間 、低溫時間所占的比例有關(guān) 。 對 1，2，4h 處理來說 ，一天中適溫所占時間短 ，12低溫所占時間比例過長 ，影響菌絲的發(fā)生和發(fā)展 ，這與之前相關(guān)報道結(jié)果相似3,7,11。 除 RH95%條件外變溫時間長的 18，20，22h 處理也受到明顯的抑制 ，這 3 個處理 24h 中雖然適溫時間長 ，12低溫所占時間分別為 4，2，0h，但相對高溫所占時間較長對灰霉菌的侵染起到明顯抑制作用 ,最大抑制程度也可達到 50%。對于變溫時間較長的 3 個處理日平均溫度分別為 21.25、22.33和 23.50， 前人所研究的適溫范圍內(nèi) ， 但這 3 個處理一天中高溫時間都超過6h，說明每天持續(xù)高溫 6h 對灰霉病侵染有抑制作用 。番茄生長發(fā)育所需的溫度條件是連續(xù)變化的溫度條件 ，同時也是灰霉病的發(fā)病條件 。 通過本試驗研究結(jié)果表明 10h、12h 變溫處理菌絲侵染能力最強 ，同濕度條件下 1，2，4，18，20，22h 處理都有明顯抑制作用 ，最大抑制作用可達到 70%，但 RH95%條件抑制不明顯 。 據(jù)此在生產(chǎn)中可以調(diào)節(jié)一天中溫度范圍 ，使溫度處在抑制灰霉病同時有利于番茄生長的連續(xù)變溫條件 。參考文獻 ：1 張純胄 ,陳永兵 ,胡麗秋 .番茄果實灰霉病的田間發(fā)生動態(tài)及其物候防治試驗 J.中國農(nóng)學(xué)通報 ,2002，18(5):89-91.2 ACHUO E A, AUDNAERT K, MEZIAND H, et al. The salicylic acid- dependent defense pathway is effective againstdifferent pathogens in tomato and tobacco J.Plant Pathology,2004,53(1):65-72.3 徐 明 ,李海濤 ,張子君 ,等 .番茄灰霉病病原菌生物學(xué)特性的研究 J.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) ,2009,37(3):68-71.4 徐春和 ,閆洪敏 ,嚴玉順 ,等 .番茄灰霉病及葉霉病的發(fā)生和防治 J.植物保護 ,2007,21(7):345-349.5 陳治芳 ，王文橋 ，韓秀英 ，等 .灰霉病化學(xué)防治及抗藥性研究進展 J.河北農(nóng)業(yè)科學(xué) ，2010,14(8):19-23.6 ELLISON P, ASH G, MCDONALD C. An expert system for the management of Botrytis cinerea in Australian vineyards (I:Development)J.Agricultural Systems,1998,56:185-207.7 ONEILL T M, SHTIENBERG D, ELAD Y. Effect of some host and microclimate factors on infection of tomato stems byBotrytis cinereaJ.Plant Disease,1997, 81(1):36-40.8 CHARLES W B, HARRIS R E. Tomato fruit-set at high low temperatures, Canadian J. Journal of Plant Sciences, 1972,(52):497-506.9 MORGAN W M. The effect of night temperature and glasshouse ventilation on the incidence of Botrytis cinerea in a lateplanted tomato cropJ.Crop Prot,1984(3):243-251.10 RAPOSO R, GOMEZ V, URRUTIA T, et al. Survival of Botrytis cinerea in southeastern Spanish greenhouses J. EuropeanJournal of Plant Patholog,2001,107:229-236.11 WILLIAMSON B,DUNCAN G H,HARRISON J G, et al. Effect of humidity on infection of rose petals by dry-inoculatedconidia of Botrytis cinereaJ.Mycological Research,1995,99:1303-1310.12 李寶聚 ,陳立芹 ,孟偉軍 ,等 .溫度調(diào)控對番茄灰霉病菌侵染的影響 J.植物保護 ,2004,30(2):75-80.13 CHARLES W B, HARRIS R E. Tomato fruit-set at high low temperaturesJ.Journal of Plant Sciences,1972,(52):497-506.14 BAPTISTA F J, BAILEY B J, MENESES J F. Effect of nocturnal ventilation on the occurrence of Botrytis cinerea inMediterranean unheated tomato greenhousesJ.Crop Protection, 2012,32:144-149.15 GREENSPAN L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.J.Res Nat Bur Stand,1977,81:89-96.16 李寶聚 ,陳立芹 ,孟偉軍 ,等 .濕度調(diào)控對番茄灰霉病菌侵染的影響 J.植物保護 ,2003,33(2):167-169.17 MORGAN W M. The effect of night temperature and glasshouse ventilation on the incidence of Botrytis cinerea in a lateplanted tomato cropJ.Crop Prot.,1984,(3):243-251.18 RAPOSO R, GOMEZ V, URRUTIA2 T, et al. Survival of Botrytis cinerea in southeastern Spanish greenhousesJ.EuropeanJournal of Plant Patholog,2001,107:229-236.責(zé)任編輯 于洪飛 589- -