北方園藝（）： ·研究論文·第一作者簡介：姜童（），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種。：責(zé)任作者：林多（），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭卟藸I養(yǎng)生理與品質(zhì)育種。：基金項(xiàng)目：山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新資助項(xiàng)目（）；山 東 省 農(nóng) 業(yè) 良 種 工 程 資 助 項(xiàng) 目（）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)工程教學(xué)研究資助項(xiàng)目（，）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金資助項(xiàng)目（）；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（）。收稿日期：干制辣椒雄性不育系與保持系間多態(tài)性標(biāo)記的篩選姜童，王輝，楊 延 杰，林多（青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，青島市遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島）摘要：以對(duì)干制辣椒雄性不育系以及相應(yīng)保持系（，；，；，）為試材，采用標(biāo)記的方法對(duì)干制辣椒雄性不育系與保持系間進(jìn)行檢測(cè)，以期篩選出干制辣椒雄性不育與保持系間存在多態(tài)性的標(biāo)記。結(jié)果表明：在個(gè)標(biāo)記中，僅有一個(gè)標(biāo)記在對(duì)不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性，該標(biāo)記在不育系中分別擴(kuò)增出約為和左右的片段，而在相應(yīng)保持系中均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。初步認(rèn)為，分子標(biāo)記可用于干制辣椒雄性不育系與保持系間的分子標(biāo)記輔助鑒定。關(guān)鍵詞：干制辣椒；雄性不育；標(biāo)記中圖分類號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：（）辣椒（ ）屬茄科辣椒屬一年生或有限多年生植物，因其維生素含量高而深受消費(fèi)者歡迎。辣椒雄性不育是指植物花藥不能產(chǎn)生正常有功能的花粉的現(xiàn)象，通常包括花藥無法產(chǎn)生花粉，花粉敗育以及花藥無法開裂這幾種現(xiàn)象。由于辣椒雜交優(yōu)勢(shì)明顯，目前市場(chǎng)上所用的大部分種子是雜交一代，但是隨著國內(nèi)農(nóng)資以及勞動(dòng)力等價(jià)格的提高，雜種一代的生產(chǎn)成本也逐漸增高，而雄性不育是迄今為止能夠降低這一成本的有效途徑之一。即插入缺失，是針對(duì)基因組中插入缺失位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的標(biāo)記，廣泛分布于基因組，數(shù)目眾多，經(jīng)擴(kuò)增、電泳分離以及相應(yīng)的染色技術(shù)檢測(cè)，得到的多態(tài)性片段即為標(biāo)記，具有分布廣、重復(fù)性好、檢測(cè)方便、呈共顯性 ， ， ：（ ）； ； ； ； 遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于植物遺傳多樣性分析、高密度遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、種子純度鑒定和分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域。近年來，應(yīng)用標(biāo)記進(jìn)行基因定位受到許多學(xué)者關(guān)注，在種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系等領(lǐng)域已有大量研究，但對(duì)于干制辣椒標(biāo)記的研究尚鮮見報(bào)道。該研究以對(duì)干制辣椒雄性不育系以及相應(yīng)保持系為試料，采用標(biāo)記的方法對(duì)干制辣椒不育系與保持系相關(guān)標(biāo)記進(jìn)行篩選，以期篩選出標(biāo)記，為干制辣椒不育系與保持系相關(guān)分子標(biāo)記輔助選擇方面提供一定參考。 材料與方法 試驗(yàn)材料對(duì)辣椒材料雄性不育系和相應(yīng)保持系材料（，；，；，；其中和分別表示雄性不育系和保持系）由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院干制辣椒育種課題組提供；分布于辣椒條染色體上的對(duì)引物為等開發(fā)的辣椒標(biāo)記（表），引物由上海生物工程公司合成。 試驗(yàn)方法 干制辣椒基因組的提取采用改良法和植物基因組提取試劑盒種方法，分別提取干制辣椒材料。改良法具體步驟如下，取樣：新鮮葉片取直徑的小片，加入離心管中。研磨：向離心管中加入液氮用玻璃棒充分研磨至粉末狀。植物基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，按試劑盒說明書步驟，提取干制辣椒葉片基因組。 瓊脂凝膠電泳檢測(cè)取樣品與 ×混勻后上樣，瓊脂糖凝膠（含熒光染料）電泳檢測(cè)質(zhì)量。電泳條件：電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察照相。 擴(kuò)增利用干制辣椒引物對(duì)份樣品進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：模板（約），正反引物各，× ，加至終體積；循環(huán)體系為：預(yù)變性；變性，退火，延伸，共個(gè)循環(huán)；總延伸；保存擴(kuò)增產(chǎn)物，退火溫度不是固定不變的，不同引物有不同的退火溫度，將這對(duì)引物按照相近溫度分為類：、。 聚丙烯酰胺凝膠電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物于非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，分子量大小為 的 ，電壓下電泳。電泳結(jié)束后，清水沖洗玻璃板兩面，使凝膠冷卻，然后進(jìn)行銀染和顯色，置于燈箱上照相。表 試驗(yàn)所用的引物 編號(hào)標(biāo)記名稱 編號(hào)標(biāo)記名稱 編號(hào)標(biāo)記名稱 編號(hào)標(biāo)記名稱 第期北方園藝 結(jié)果與分析 基因組質(zhì)量檢測(cè)將提取的干制辣椒材料基因組進(jìn)行了瓊脂糖電泳檢測(cè)，采用種方法提取的完整性好，而且點(diǎn)樣孔干凈。但采用改良法（圖）提取的純度、質(zhì)量濃度均沒有植物基因組提取試劑盒（圖）的高，該研究采用植物基因組提取試劑盒提取的進(jìn)行了后續(xù)試驗(yàn)。 不育系和保持系基因組多態(tài)性引物篩選針對(duì)每對(duì)不育系和保持系均進(jìn)行了對(duì)引物的檢測(cè)，其中，的檢測(cè)結(jié)果如圖所示，在這對(duì)引物中有對(duì)（、）在不育系和保持系間存在多態(tài)性。對(duì)其它對(duì)材料也進(jìn)行相同的篩選過程，其中與間有對(duì)引物（和）存在多態(tài)性；與間也有對(duì)引物（和）存在多態(tài)性。所選對(duì)引物在對(duì)不育系和保持系間的多態(tài)性比例分別為、和；而且有一對(duì)引物在對(duì)不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性，多態(tài)性比例為。注：為；依次為編號(hào)、。下同。：；， ， ， 圖改良法提取辣椒基因組電泳檢測(cè) 圖植物基因組提取試劑盒提取辣椒基因組電泳檢測(cè) 在對(duì)干制辣椒雄性不育系與保持系間的擴(kuò)增情況通過對(duì)對(duì)不育系和保持系進(jìn)行的多態(tài)性引物的篩選可知（圖），標(biāo)記在對(duì)不育系和保持系間均存在一致的多態(tài)性，在份不育系中可同時(shí)擴(kuò)增出條片段，其中條大小約為和的片段是在不育系中所特有的；而在份保持系中均擴(kuò)增出條條帶?？梢娫摌?biāo)記在供試的不育系和保持系間表現(xiàn)為顯性標(biāo)記。北方園藝月（上）注：為；為對(duì)引物。：； 圖親本，的聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，圖標(biāo)記在不育系和保持系中的擴(kuò)增結(jié)果 結(jié)論與討論該研究以對(duì)干制辣椒雄性不育系以及保持系為試驗(yàn)材料，利用均勻分布于辣椒條染色體上的對(duì)引物進(jìn)行了干制辣椒雄性不育系與保持系間的檢測(cè)，結(jié)果篩選到對(duì)引物在供試的干制辣椒雄性不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性。近年來，許多辣椒育種研究者在品種選育、辣椒不育機(jī)理探尋和不育基因定位上開展了大量工作。王得元等以辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系為材料開展了標(biāo)記研究，并獲得了個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因相關(guān)的標(biāo)記和，同時(shí)認(rèn)為標(biāo)記可能與保持系中的保持基因相關(guān)。 第期北方園藝王述彬等也利用技術(shù)對(duì)辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與其相應(yīng)保持系的基因組進(jìn)行了比較分析，并獲得了不育系基因組特異的片段。魏兵強(qiáng)等也利用類似的方法獲得了與不育基因相關(guān)的標(biāo)記。這些標(biāo)記對(duì)于分子輔助育種有實(shí)踐意義和一定的利用價(jià)值。該試驗(yàn)中，利用基因組錨定標(biāo)記對(duì)對(duì)干制辣椒不育系和相應(yīng)保持系開展了多態(tài)性引物篩選，并從中篩選到了個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記。等研究認(rèn)為該標(biāo)記在第號(hào)染色體上，且目的片段為；該試驗(yàn)中份材料在目的條帶處均未表現(xiàn)多態(tài)性，但存在左右的多態(tài)性片段，可見該處的擴(kuò)增片段為非特異性擴(kuò)增。盡管該標(biāo)記在對(duì)不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性，該多態(tài)性用于區(qū)分不育系和保持系。但對(duì)于該 標(biāo)記的應(yīng)用范圍及多態(tài)性片段的序列信息等尚需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)傅鴻妃，柴偉國，呂曉菡，等雄性不育在我國辣椒品種選育中的應(yīng)用及不育基因定位研究進(jìn)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，（）：張志剛，趙智中，李巧云，等大白菜標(biāo)記開發(fā)及其在剩余雜合體鑒定中的應(yīng)用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，（）：姚國新，黃文超利用水稻秈粳分化標(biāo)記鑒定育種材料的秈粳屬性雜交水稻，（）：葛敏，蔣璐，張曉林，等利用（）分子標(biāo)記檢測(cè)玉米互交種混雜的原理及應(yīng)用分子植物育種，（）：申璐，沈炎林，柴敏，等采用和標(biāo)記分析番茄品種基因組 多態(tài)性中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，（）：李斯更，沈鏑，劉博，等基于黃瓜基因組重測(cè)序的標(biāo)記開發(fā)及其應(yīng)用植物遺傳資源學(xué)報(bào)，（）： ， ， ， （ ） ，（）：謝立波，郭亞華，孟凡娟，等辣椒擴(kuò)增體系的建立安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)報(bào)，（）：王得元，王鳴，鄭學(xué)勤，等用分析辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因核農(nóng)學(xué)報(bào)，（）：王述彬，劉金兵，潘寶貴，等辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與其保持系基因組的分析上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，（）：魏兵強(qiáng)，王蘭蘭，陳靈芝，等辣椒胞質(zhì)雄性不育基因的分子標(biāo)記西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，（）：， ， ， ， （ ， ， ）： （，；，；，） ， ， ， ：； ； 北方園藝月（上）