<p>西北植物學報 ，（）： 文章編號 ：（）外源鈣和茉莉酸甲酯誘導番茄植株抗灰霉病研究李天來 ，張亢亢 ，余朝閣 ，李琳琳（沈陽農業(yè)大學 園藝學院 ，設施園藝省部共建教育部重點實驗室 ，遼寧省設施園藝重點實驗室 ，沈陽）摘要 ：以 遼園多麗 番茄幼苗為材料 ，研究了經鈣 （）、鈣螯合劑 （）和茉莉酸甲酯 （）處理后接種番茄灰霉病幼苗葉片的病情指數 、活性氧 （、·）含量和過氧化氫酶 （）、超氧化物歧化酶 （）、過氧化物酶 （）活性的變化 。結果顯示 ：（）、處理番茄幼苗的灰霉病發(fā)病率分別比對照顯著降低、和 ，而處理又顯著低于 、處理 和 ；處理高于 處理 ，但低于 處理 ；處理低于 處理 。（）、及 處理番茄幼苗葉片中活性氧積累量高于對照 ，處理又高于 、處理 ；但 處理活性氧積累量低于 處理 ，而高于 處理 ；處理的活性氧含量高于 處理 。（）、及 處理幼苗葉片的 、的活性均比對照提高，且以處理最高；而處理抗氧化酶活性低于 處理 ，但高于 處理 ；處理抗氧化酶活性高于 處理 。研究表明 ，鈣在茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病過程中具有重要調節(jié)作用 ，這種作用與鈣促進茉莉酸甲酯誘導番茄活性氧積累和抗氧化酶活性有關 。關鍵詞 ：鈣 ；茉莉酸甲酯 ；灰霉病 ；番茄 ；誘導抗性中圖分類號 ： 文獻標志碼 ： ， ， ， （ ， ， ， ，）： ， （ ·） ， ， ， ：（）， （） ， ， ， （） ， 收稿日期：；修改稿收到日期 ：基金項目 ：國家 “十二五 ”科技支撐計劃項目 （）；遼寧省重大科技攻關項目 （）作者簡介 ：李天來 （），男 ，博士 ，教授 ，主要從事設施蔬菜栽培與生理研究 。： ， （） ， ， ， ， ：； ； ； 灰霉病是設施番茄生產中最重要的病害之一 ，長期依賴于農藥防治 ，極易導致環(huán)境和產品污染 ，而誘導抗性為蔬菜病害防治指明一條可持續(xù)途徑。茉莉酸是一種重要的植物激素 ，它不僅影響植物體的生長和發(fā)育 ，而且與抵抗病原侵染有關 ，它可啟動植物體內抗病防御基因的表達 ，從而調控植物的防御反應 ?，F(xiàn)已證明茉莉酸對增強水稻 、番茄 、馬鈴薯 、甜菜等抗病有積極的作用。近年來研究認為活性氧的積累是植物抗病反應的早期特征之一 ，并參與一系列抗病防衛(wèi)反應的過程 。在植物與病原物不親和互作中 ，活性氧快速大量積累 ，而親和互作中則基本維持不變。病原菌侵染植株而激活信號轉導防御途徑 ，原生質膜的受體激發(fā)子和透過細胞膜的離子流動（、）調節(jié)下游反應 ，產生活性氧爆發(fā) （活性氧產物 ）、第二信使茉莉酸 、乙烯和水楊酸的形成。擬南芥中發(fā)現(xiàn)胞外及胞內共同參與茉莉酸誘導的鈣動員，表明鈣信號參與了茉莉酸途徑 ，且鈣作為胞內第二信使也參與植物抗病防衛(wèi)反應。雖然迄今鈣和茉莉酸分別在植株抗病中的作用研究較多 ，但關于鈣在茉莉酸甲酯防御途徑中所起的作用和鈣與茉莉酸甲酯復合施用對植株的抗病性影響 ，國內外鮮有報道 ，而且鈣對茉莉酸甲酯誘導番茄抗病 、活性氧及抗氧化酶系統(tǒng)的影響機制尚不明確 。因此 ，本實驗通過鈣 、鈣螯合劑與茉莉酸甲酯分別及復合施用后接種番茄灰霉病 ，測定番茄葉片活性氧及抗氧化酶等指標 ，探討鈣在茉莉酸甲酯誘導下番茄抗灰霉病途徑中的作用 ，并為番茄品種抗病性改良和防治措施制定提供理論依據 。 材料和方法 材料本實驗于年月在沈陽農業(yè)大學園藝科研基地日光溫室內進行 ，供試番茄品種為 遼園多麗 （ ）。供試灰霉菌（ ）由田間分離所得 。病菌培養(yǎng)基為馬鈴薯 葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 （）。茉 莉 酸 甲 酯（ ）為公司生產 ，鈣抑制劑為上海國藥生產 。 設計 番茄幼苗培養(yǎng)年月日 ，挑選籽粒飽滿 、大小均勻的番茄種子 ，經溫水處理后 ，于水溫浸種，然后置光照培養(yǎng)箱中催芽 ，選擇出芽一致的種子 ，進行穴盤基質育苗 。植株長到片真葉時 ，選擇長勢一致的植株于×塑料缽中進行分苗 。待植株長到片真葉時 ，轉至安有空調的拱棚中 ，保證：到：棚內溫度。 灰霉病孢子懸浮液的制備將灰霉菌常規(guī)方法純化后 ，接種到培養(yǎng)基上 ，下培養(yǎng)，在超凈工作臺上將培養(yǎng)基切下放入裝有無菌水的錐形瓶中 ，振蕩，層紗布過濾 ，鏡檢調整孢子懸浮濃度為× 。 幼苗處理試驗共設置 ：茉莉酸甲酯 （）、（）、（）、茉莉酸甲酯（）和茉莉酸甲酯（）等個處理 ，以 蒸 餾 水 為 對 照 （）。其 中 的、濃度分別為、和·，每組處理株 。按照實驗設計將上述溶液分別均勻噴施于番茄幼苗葉片背面 ，直到滴水為止 。為增強吸收效果 ，在上述溶液中加入的。噴施處理第天噴施灰霉菌孢子懸浮液于植株第、片葉 ，濃度為× ，接菌后內進行遮蔭 ，保證濕度在以上 ，第天正常光照 。于接菌后的、取植株第、葉 ，經液氮速凍后置于的冰箱保存 ，用于相關指標的測定 。單株取樣 ，次重復 。 測定項目與方法 病情指數接種后調查發(fā)病情況 ?；颐共“l(fā)病程度分級標準為 ：級 ，無病斑 ；級 ，病斑西北植物學報卷面積占葉面積以下 ；級 ，病斑面積占葉面積；級 ，病斑面積占葉面積；級 ，病斑面積占葉面積；級 ，病斑面積 占葉面積以上 。采用分級計數法計算病情指數 。病 情 指 數 （）（各級病葉數×各級代表值 ）調查總葉數×最高一級代表值× 超氧陰離子產生速率和過氧化氫含量葉片超氧陰離子 （·）的產生速率采用羥胺氧化法測定，過氧化氫 （）含量采用等的方法測定 。 抗 氧 化 酶 活 性葉 片 超 氧 化 物 歧 化 酶（）活性的測定采用光氧化還原法 ，以抑制光氧化還原的酶量為一個酶活性單位；過氧化氫酶 （）活性的測定采用紫外吸收法 ，以每分鐘吸光度減少為一個酶活力單位 ；過氧化物酶 （）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法 ，將每分鐘吸光度增加時為一個酶活力單位。 數據處理試驗所得數 據 采 用軟 件 處 理 ，軟件進行單因素方差 （）分析 ， 軟件進行繪圖 。 結果與分析 不同處理對番茄幼苗病情指數的影響由圖可知 ，與相比 ，、處理病情指數分別顯著降低、和（），而處理病情指數與對照相比沒有顯著差異 ；處理病情指數比、單獨處理顯著下降、，但處理病情指數比單獨處理顯著升高，低于處理；處理比處理極顯著降低。此結果說明和茉莉酸甲酯均能顯著誘導降低番茄灰霉病發(fā)病率 ，外源鈣對茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病具有促進作用 ，而缺鈣處理則抑制茉莉酸甲酯對番茄抗灰霉病的誘導作用 。 不同處理對番茄葉片活性氧代謝的影響圖，顯示 ，隨著接種時間的延長 ，番茄幼苗葉片的·產生速率在、和處理中變化趨勢相似 ，均表現(xiàn)為先上升后下降的單峰曲線 ，并均在接種時達到高峰 。而、處理的·產生速率均出現(xiàn)個峰值 ，且各處理出現(xiàn)峰值的時間有異 。其中 ，處理·產生速率在接種之后迅速上升 ，在達到高峰之后下降 ，·產生速率顯著高于；處理·產生速率在接種和時形成個峰值 ，均顯著高于期李天來 ，等 ：外源鈣和茉莉酸甲酯誘導番茄植株抗灰霉病研究處理 ，之后·產生速率減慢 ；處理·產生速率的變化趨勢與類似 ，但始終低于處理 。處理·產生速率低于處理 。就含量而言 ，除處理產生個峰值外 ，各處理的變化趨勢基本相同 ，即均在接種和達到峰值 ，之后逐漸下降 （圖，）。其中 ，處 理個 峰 值 的含 量 分 別 高 出、；處理達到峰值的含量分別高出處理、；處理的兩個峰值均低于處理 ，但高于處理 。對照組和處理的含量變化是一個動態(tài)平衡的過程 ，前期波動上升 ，之后下降 。說明外源鈣能夠促進了茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病信號物質的合成 ，而缺鈣處理則抑制了茉莉酸甲酯誘導的合成 。 不同處理對番茄葉片抗氧化性酶的影響圖，顯示 ，隨著接種時間的延續(xù) ，蕃茄幼苗中活性在處理和處理均出現(xiàn)個峰圖 不同處理番茄幼苗的 （）、（）、（）活性隨接種時間的變化 （），（），（） 值 ，并顯著高于，而在其他處理則呈現(xiàn)先逐漸上升后平緩下降的單峰曲線 。處理活性前期明顯增加 ，而后呈現(xiàn)動態(tài)平衡 ，但始終高于；處理的活性顯著高于處理 ，而處理的活性始終低于處理 ，但高于單獨處理 。同時 ，各處理番茄幼苗活性的變化趨勢與對照相似 ，先升高然后較緩慢地下降 ，、處理均在接種第天達到最大值 ，和處理則在第天達到峰值 ，并且均高于（圖，）。各處理活性在接種后變化幅度差異不大 ，其中處理在接種上升之后始終處于較高水平 ，說明其幼苗中能清除過多超氧陰離子 ，有效減輕體內氧化損傷 。番茄幼苗活性在處理中隨接種時間的延續(xù)逐漸升高 ，于第天時達到峰值 ，之后下降 ；其他處理的活性均在接種第天時達到峰值 ，之后逐漸下降 ，每個處理都高于（圖，）。其中 ，處理活性顯著高于，在接種第天時是對照活性的倍 ；處理的活性始終高于處理 ，接種第天時約是處理的倍 ；處理的活性始終低于處理 ，高于處理 ?？梢?，誘導能茉莉酸甲酯提高番茄幼苗的活性 。 討論已有研究證實 ，在很多植物系統(tǒng)中和茉莉酸在調控病原菌引起的防御反應中起關鍵作用。本研究結果表明 ，外源鈣能提高茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病能力 ，而鈣螯合劑抑制茉莉酸甲酯抗灰霉病能力 ，即鈣信號途徑對茉莉酸甲酯抗灰霉病防御途徑有影響 ，這和 等及等研究結果一致 。病原菌或者其他激發(fā)子侵入植株后可誘導超氧陰離子 、過氧化氫等活性氧爆發(fā) ，·的產生速率增加 ，可以誘導植保素的積累；低濃度可抑制真菌孢子萌發(fā) ，高濃度活性氧對植株有害。在本實驗中 ，外源鈣能提高茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病過程中的·產率 ，·產生速度快 ，表明處理對灰霉病菌侵染更敏感 ，能較早 、較快地產生·；同時 ，外源鈣也增加誘導茉莉酸甲酯抗灰霉病過程中的含量 ，可直接作為信號傳遞過程中的中間體 ，在轉錄水平和調控植物體內各種防御相關基因的表達。而外源抑制了茉莉西北植物學報卷酸甲酯誘導番茄抗灰霉病活性氧的積累 ，這是因為鈣螯合劑影響了防御途徑 ?？寡趸冈谥仓牦w內相互協(xié)調 ，限制病菌侵染 ，從而有效保護細胞膜穩(wěn)定性和功能 ，增強植株抗病能力 。但、在植株抗病反應中的變化規(guī)律說法不一 。一種是酶活性增加與抗病性呈正相關 ，另一種是酶活性與抗病性呈負相關 。本實驗中發(fā)現(xiàn) ，抗氧化酶活性與番茄抗灰霉病強弱呈正相關 ，這與前人研究結果一致。是主要的活性氧清除酶類 ，它催化·轉化為和。經處理的番茄葉片中·產生速率高 ，刺激活性增強 ，所以處理活性高于其他處理 ，且長時間保持較高水平 ，導致葉片含量升高 。通過活性提高進而引起含量的增加 ，這是鈣誘導茉莉酸甲酯抗番茄灰霉病的機制之一 。雖然活性氧維持在相對較高的水平對植物的抗病性是有益的 ，但過量的活性氧通過脂質過氧化破壞植物細胞 ，所以必須有足夠的抗氧劑而使活性氧維持在一個較低水平。和能使轉化為和，在活性氧的清除和維持植物體內活性氧的正常水平中起作用 。處理后 ，番茄葉片中、活性上升 ，且處理后番茄葉片、活性比處理顯著升高 ，更有利于植株體內活性氧的平衡 ，而鈣螯合劑抑制茉莉酸甲酯抗灰霉病途徑中抗氧化酶活性 。這說明鈣提高了茉莉酸甲酯抗灰霉病途徑中抗氧化酶活性 ，減少活性氧爆發(fā)對番茄造成的傷害 。綜上所述 ，外源鈣在茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病過程中 ，一方面加快前期活性氧水平的升高 ，升高的活性氧作為信號分子調控植株抗病過程 ；另一方面也影響番茄葉片抗氧化酶系統(tǒng) ，維持植株體內活性氧的平衡 。外源鈣促進茉莉酸甲酯誘導番茄抗灰霉病的原因在于激活了活性氧代謝 ，進而增加抗氧化酶活性 ，具體機理是激活了番茄抗灰霉病的防御途徑 ，降低番茄灰霉病發(fā)病指數 ，對植株抵御番茄抗灰霉病起到了積極作用 。參考文獻 ： ， ， ，： ， ： ， ，： ， ， ， ，（）： （張智慧 ）， （聶燕芳 ）， （何磊 ）， （植物病理學報 ），（）：（ ） （余朝閣 ）， （李天來 ）， （孟慶娟 ）， （沈陽農業(yè)大學學報 ），（）：（ ）楊艷麗 外源茉莉酸影響馬鈴薯對晚疫病抗性的初步研究 長沙 ：湖南農業(yè)大學 ，石力偉 茉莉酸處理對甜菜抗叢根病性的作用 呼和浩特 ：內蒙古農業(yè)大學 ， ： ，： （宋鳳鳴 ）， （鄭重 ）， （葛秀春 ） （植物生理學通訊 ），：（ ） ， ，： ， ， ， ，： ， ，：期李天來 ，等 ：外源鈣和茉莉酸甲酯誘導番茄植株抗灰霉病研究 （潛宗偉 ）， （唐曉偉 ）， （吳震 ）， （中國農學通報 ），（）：（ ） （孫清鵬 ）， （于涌鯤 ）， （萬善霞 ）， （中國農業(yè)科學 ），（）：（） （龍書生 ）， （曹遠林 ）， （康振生 ） （植物病理學報 ），（）：（ ） （趙俊霞 ）， （陳穎 ）， （王立安 ） （微生物學通報 ），（）：（ ） ： ，： ， ， ，（）：曹建康 果蔬采后生理生化實驗指導 北京 ：中國輕工業(yè)出版社 ，：陳建勛 ，王曉峰 植物生理學實驗指導 （第 版 ）廣州 ：華南理工大學出版社 ，： ， ， ， ，： ， ， ， ，： ， ， ，（）： ， ，： ， ， ， ，： ， · ，： ， ， ， （ ） ，（）： ，： （黃艷 ），（明建 ）， （鄧雨 艷 ）， （食品科學 ），（）：（ ） ， ， ， ，（）：西北植物學報卷</p>