北方園藝（）： ·專題綜述·第一作者簡介：王東（），男，碩士，副研究員，現(xiàn)主要從事轉基因生物安全評價與研究等工作。：責任作者：郭靈安（），男，本科，副研究員，現(xiàn)主要從事食品安全風險評價等研究工作。： 基金項目：四川省財政創(chuàng)新能力提升工程專項資金資助項目（）。收稿日期：銀耳的分子生物學研究進展王東，宋君，趙 樹 海，雷 紹 榮，常 麗 娟，郭 靈 安（四川省農(nóng)業(yè)科學院 分析測試中心，四川 成都；巴中市通江銀耳科學技術研究所，四川 通江）摘要：銀耳是我國珍貴的食用菌，具有很大的營養(yǎng)作用和藥用功效，市場前景廣闊。該研究初次系統(tǒng)地概述了銀耳在分子生物學方面的研究進展，著重闡述了銀耳的生物學分類，基因克隆、遺傳轉化、分子標記、基因組學等方面在銀耳研究中的應用與發(fā)展，以期為進一步開展銀耳的分子生物學研究提供參考依據(jù)。關鍵詞：銀耳；分子生物學；食用菌中圖分類號： 文獻標識碼： 文章編號：（）銀耳（ ），又名白木耳、雪耳，食、藥兩用，其營養(yǎng)價值和藥用功效極高，是非常珍貴的食用真菌，有“菌中之冠”的美稱。我國銀耳的研究與栽培在全世界處于領先地位，以四川通江和福建古田等地區(qū)為銀耳的道地產(chǎn)區(qū)，分別以段木（青杠木）栽培和代料（瓶栽、袋栽）栽培為代表；通江段木銀耳的產(chǎn)量和質量居全國首位，全國的銀耳為古田代料銀耳。對銀耳的研究主要集中在生物學特性、生產(chǎn)栽培、病蟲害防治、加工技術、分離純化、藥用功能、經(jīng)濟價值、遺傳育種等方面。基于核酸的銀耳分子生物學研究始于世紀年代初，至今仍是研究的熱點和前沿。該研究首次對基于核酸的銀耳研究結果及現(xiàn)狀進行了比較全面的綜述，以期為銀耳的分子生物學研究提供參考依據(jù)。 生物學分類傳統(tǒng)的真菌分類依據(jù)是孢子的類型和有性態(tài)的有無，銀耳隸屬于真菌門（）、擔子菌綱（）、銀耳目（）、銀耳科（）、銀耳屬（）。從系統(tǒng)學來看，根據(jù)形態(tài)特征對真菌分類存在諸多詬病和問題，不能充分反映物種的進化關系；從應用和方法學來說，真菌的形態(tài)結構也復雜多變，獲得有性或無性器官所需時間較長。傳統(tǒng)的真菌命名方法導致真菌命名復雜化，給相關研究帶來諸多不便。隨著以核酸（、）序列分析為主的分子系統(tǒng)學的廣泛應用，“一種真菌一個名稱”新規(guī)則為廣大學者所接納。等依據(jù)核糖體的個標記分子（、）的序列構建了銀耳綱（）的分子系統(tǒng)發(fā)育關系。等通過比較分析（）、的核酸序列，結合形態(tài)與生理特征，構建了含銀耳目（）等個目的世系分類。銀耳在生物學分類中的最新研究結果為：真菌界（），擔子菌門（），傘形亞門（），銀耳綱（），銀耳目（），銀耳科（），銀耳屬（）。 核酸提取高質量的核酸是進行后續(xù)分子試驗（、遺傳轉化、基因克隆等）的前提和保證。劉娟等采用法等種方法分別提取銀耳芽孢基因組，通過評估的得率、純度，擴增和酶切效果，確定法是這種提取方法中最適合銀耳芽孢基因組提取的方法。銀耳芽孢是核酸提取的主要材料，少有菌絲體和子實體提取報道。王凡華等用改良法的質量分數(shù)法提取銀耳干品的，獲得了較高質量的，適于擴增反應；此法提取的也適于分子標記和轉基因成分檢測。等以銀耳子實體為材料，商品化的植物試劑盒提取出銀耳的總，獲得了，通過獲得了編碼銀耳免疫調節(jié)蛋白（）基因的全序列。總的來講，法提取的核酸質量較好，得率高，而商業(yè)化的試劑盒提取的核酸質量好，但得率相對較低。 基因克隆在食用菌中，大量的香菇和雙孢蘑菇的基因被克隆，銀耳的基因克隆也取得了一定的進展。微管蛋白是微管的重要組成蛋白，微管蛋白基因在真核生物中具有高度的序列保守性，作為管家基因之一，常用作內參照基因在熒光定量、抑制差減雜交、基因芯片和 等分子生物學試驗中使用。董吉元等分別用和方法克隆了銀耳微管蛋白基因的和全長序列，其全長 ，全長 ，含個內含子，編碼個氨基酸；氨基酸序列中存在保守的結合區(qū)域，編碼的蛋白質屬于 超家族中的微管蛋白亞家族，銀耳微管蛋白基因的序列與新型隱球酵母的相似性為，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示銀耳與新型隱球酵母距離最近。該研究可為鑒定銀耳二型態(tài)相關的差異表達基因、銀耳分子育種和系統(tǒng)發(fā)育研究提供參考，也可利用銀耳微管蛋白基因的啟動子構建高效的表達載體進行銀耳轉化與基因功能研究。聶燕華等用技術對用纖維二糖和乙醇種碳源誘導培養(yǎng)銀耳芽孢的差異細胞，克隆了條特異性的差異表達基因片段，有條差異序列在纖維二糖、乙醇培養(yǎng)樣品中各有表達，其中條與編碼細胞色素基因具有較高同源性的序列在纖維二糖、乙醇下均表達，條與磷脂酶相關蛋白基因具有較高同源性的序列只在纖維二糖碳源下表達，條與編碼細胞色素氧化酶亞基的基因具有較高同源性的序列只在乙醇碳源下表達。等用法克隆到銀耳的序列，并用法從銀耳中分離到編碼銀耳上游啟動子序列，克隆的啟動子能有效地驅動外源基因在銀耳中表達。用反向長距離技術克隆了個具有活性的銀耳內源啟動子，分別為、，酶活測定表明大片段的啟動子的表達活性更高，表明大片段具有更完整的表達元件，與已報道的其它啟動子差異較大。用硫酸銨分級和離子交換層析分離到一種能激活原代小鼠巨噬細胞的免疫調節(jié)銀耳蛋白，分子量為，為不含糖殘基的同型二聚體蛋白；用末端快速擴增技術克隆到基因的序列，該序列長個核苷酸，其中開放閱讀框由個核苷酸組成，編碼的蛋白質含個氨基酸。 遺傳轉化 限制性內切酶介導轉化謝寶貴等用限制性內切酶介導將人工合成的人胰島素基因轉化銀耳芽孢，獲得了個人胰島素基因轉化子；、這種內切酶都可介導轉化獲得大量轉化子，并證明了銀耳沒有酶活性，對卡那霉素有較強的抗性，對潮霉素敏感。吳小平等用雙酶切法成功構建了含人工合成的蜜蜂抗菌肽基因的銀耳表達載體，表達載體的啟動子為，終止子為，報告基因為。等用限制性內切酶法將透明顫菌血紅蛋白基因（）轉化銀耳芽孢，在 啟動子調節(jié)下，經(jīng)和雜交分析，外源基因導入了銀耳芽孢中。北方園藝月（下） 介導轉化郭麗瓊等首次利用香菇啟動子和構巢曲霉啟動子分別驅動潮霉素抗性基因在銀耳芽孢中的表達，通過連續(xù)代轉基因芽孢繼代檢測證明，的 能高效介導銀耳原生質體的轉化，香菇啟動子能顯著驅動外源基因在銀耳芽孢中穩(wěn)定遺傳。阮玲云等首次用強啟動子，利用介導轉化法，將轉入銀耳芽孢中，驗證結果表明紅色熒光蛋白基因成功轉入到銀耳芽孢中且能表達。 電擊轉化法郭麗瓊等首次利用電擊法，以靈芝啟動子分別與外源基因和選擇性標記基因構建表達載體質粒和，共轉化進銀耳芽孢完整細胞，共轉化率為；外源目的基因以單拷貝隨機插入銀耳芽孢轉化子基因組中，能夠在銀耳芽孢中高效率表達。朱堅等用電穿孔轉化法，以銀耳菌株為受體，轉化人乳鐵蛋白基因，轉化率達到×個·質粒，插入位點不專一，插入的拷貝數(shù)也不相同，基因在銀耳中能正常轉錄成，但未檢測是否有活性的人乳鐵蛋白的產(chǎn)生。孫淑靜等用電擊法，將由雙孢蘑菇啟動子調節(jié)的綠色熒光蛋白基因成功地轉化到銀耳芽孢中，并能正確表達。 根癌農(nóng)桿菌轉化謝寶貴等最早報道了新霉素磷酸轉移酶基因和潮霉素磷酸轉移酶基因可用作轉化銀耳的篩選標記，基因可作為報告基因。等建立了一種根癌農(nóng)桿菌轉化方法，在含外源基因的載體轉化銀耳芽孢之前，先用金屬微?；旌险袷帗p傷銀耳芽孢，這種損傷法極顯著地提高了根癌農(nóng)桿菌轉化效率。等以 為啟動子，根癌農(nóng)桿菌共轉化乙肝表面抗原基因至銀耳芽孢中，經(jīng)、斑點雜交和小鼠口服轉化的銀耳芽孢試驗證明，成功地轉入銀耳芽孢中且能獲得表達蛋白。等以銀耳組成型啟動子調節(jié)，銀耳芽孢為受體，根癌農(nóng)桿菌轉化平菇疏水蛋白基因，經(jīng)、雜交、顯微熒光、實時和蛋白電泳證實，轉化成功并有活性蛋白產(chǎn)生。 超聲波介導轉化謝寶貴等用超聲波介導轉化銀耳芽孢，獲得了高達個· 以上轉化子，這是比較理想的轉化銀耳芽孢的方法，有助于開展食用菌的遺傳轉化研究。 分子標記潘麗歌等用序列分析了一種危害銀耳栽培的病菌真菌的序列與好食脈孢霉同源性超過，分子進化鑒定與形態(tài)分類結果一致，鑒定結果該病原真菌為好食脈孢霉；且好食脈孢霉的敏感藥劑主要為多菌靈可濕性粉劑、三唑酮和百菌清。張春雷等用對個銀耳段木栽培雜菌進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，遺傳距離為時，個菌株可以形成個明顯分枝，分枝與地理來源之間沒有明顯的相關性；用分子標記分析了個雜菌的相關性，聚類分析表明，在的相似水平時，個菌株可劃分為個類群，類群的劃分也與地理來源沒有明顯相關性；因供試菌株的序列明顯小于香灰菌，利用序列容易將雜菌與香灰菌分開。曲紹軒等用、和分子標記鑒定了個銀耳菌株、，個標記都將個菌株分成了組，結果一致。鑒定的遺傳相似性為平均值，鑒定的遺傳相似性為平均值，鑒定的遺傳相似性為平均值為，且種分子標記均未能將栽培上的色澤性狀區(qū)分出來。 遺傳多樣性序列分析與擴增表明，銀耳栽培雜菌之間在水平上存在比較顯著的遺傳變異，遺傳相似性較低，具有較豐富的遺傳多樣性，且與地理來源之間無明顯相關性。孫淑靜等用個和個分子標記分析了福建省不同來源的株銀耳芽孢多樣性，聚類分析結果表明，福建省栽培菌株的芽孢與野生采集分離的銀耳菌株的芽孢存在一定的差異，但栽培菌株之間沒有差異，表明其栽培菌種來源單一，遺 第期北方園藝傳背景狹窄。香灰菌是銀耳菌的重要伴生菌，一直以來關于香灰菌的分類存在較大爭議，等用序列分析和有性態(tài)的形態(tài)分析認為，在中國野生和栽培用的香灰菌均為暗色環(huán)紋炭團菌 。 基因組學研究楊雙熙等用抑制性差減雜交技術，以銀耳芽孢和菌絲為檢測對象分別構建了正向差減文庫和反向差減文庫，個文庫中分別有和的基因得到功能注釋，這些基因包含信號傳導、調控翻譯、分子伴侶、催化、調節(jié)、結合與運輸?shù)确矫?；用技術進一步對種型態(tài)的個基因片段檢測發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶催化亞基、鋅指肽酶結合域基因、激酶基因、細胞壁生化合成相關蛋白基因、琥珀酰輔酶基因、酮酸輔酶轉移酶基因等在正、反個文庫中表達差異明顯。這個文庫的構建為克隆銀耳二型態(tài)相關基因和從分子水平上闡明銀耳二型態(tài)的發(fā)生機理奠定了基礎。黃曉星等以大腸桿菌為宿主細胞，構建了銀耳菌株芽孢的文庫，通過密碼子在線軟件分析，確定了個編碼銀耳蛋白基因的高頻密碼子，銀耳密碼子含量為，且密碼子第三位堿基的含量高達，表明編碼銀耳基因的密碼子偏好以或結尾。等對銀耳菌株進行基因組測序，測試結果表明，基因組全長，預測基因為 個，編碼 個蛋白，與數(shù)據(jù)庫匹配值為；與銀耳屬的其它種相比，銀耳密碼子第三位堿基特別偏愛以或結尾。鄧優(yōu)錦等對個銀耳栽培菌株和個野生菌株進行了全基因組重測序，其線粒體基因組大小在 ，含量為；個線粒體基因組均包含有個保守的蛋白編碼基因，各一個大小亞基和數(shù)量不同的基因。各線粒體基因組的內含子含量為個，總計檢測到個不同的內含子，利用內含子的多態(tài)性設計了對特異性分子標記，檢測結果為不同來源的個菌株為同一品系，表明這些菌種廠的種質資源單一，遺傳背景狹窄。 展望銀耳是非常珍貴的藥食用菌，已作為營養(yǎng)保健食品、休閑方便食品、食品添加劑、護膚化妝品和環(huán)境保護等方面得到廣泛應用，其商業(yè)價值和市場潛力較大。銀耳的生活史上具有酵母狀的分生孢子，并因銀耳無食副毒作用，銀耳孢子已成為理想的遺傳轉化受體，用 、靈芝、香菇、雙孢蘑菇、內源等啟動子調節(jié)，終止子用、作為報告基因，作為選擇標記基因，已成功轉化了多個外源基因至銀耳芽孢中。銀耳的基因克隆和分子標記等也取得了一些進展。伴隨著生活水平的提高，人們對轉基因的食用性安全也非常關注，在棉籽殼栽培銀耳中已檢出和基因的特異片段，未檢到轉基因棉花外源基因的特異片段，也應重視銀耳的轉基因食用安全性研究。截止到年月日，在數(shù)據(jù)庫中有關銀耳的數(shù)據(jù)，登記的基因組數(shù)據(jù)為個，條核苷酸（和）序列，個蛋白質序列，個功能基因，個分子系統(tǒng)發(fā)育和種群的研究；香灰菌是銀耳的生伴生菌，而香灰菌的的分子生物學研究報道核苷酸（和）序列只有條，個蛋白質序列，個分子系統(tǒng)發(fā)育和種群的研究。相對其它作物和食用菌的研究來講，銀耳的分子生物學研究還需加強；也應開展銀耳菌和香灰菌伴生關系的分子研究，從分子水平揭示二者的遺傳和進化關系，進一步為銀耳的育種和生產(chǎn)奠定理論基礎。隨著分子生物學技術和生物信息學的發(fā)展，銀耳菌和香灰菌基因組信息的不斷豐富，更多的基因功能被注釋，培育出更多的優(yōu)質銀耳新品種，對銀耳的種質資源開發(fā)和生產(chǎn)應用具有重要意義。（該文作者還有張富麗、劉文娟、尹全，單位同第一作者。）參考文獻景曉衛(wèi)，趙樹海，李曉通江銀耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展競爭力對比分析山西農(nóng)業(yè)科學，（）：彭衛(wèi)紅，王勇，黃忠乾，等我國銀耳研究現(xiàn)狀與存在問題食用菌學報，（）：北方園藝月（下）黎勇，王曉東，高敏我國銀耳的研究歷史及現(xiàn)狀北方園藝，（）：羅信昌中國銀耳研究之歷史回顧中國菌物學會第四屆會員代表大會暨全國第七屆菌物學學術討論會論文集： ， ，：余霞，楊丹玲，陳進會，等真菌的分類現(xiàn)狀及鑒定方法中國植物病理學會年學術年會： ： ，（）： ， ， ， （，） ，： ， ， ， ，：劉娟，馬愛民，楊江濤，等銀耳芽孢基因組五種提取方法的比較食品科學，（）：王凡華，馬務迢，譚慶云，等銀耳干品的提取及隨機擴增多態(tài)性分析食品科學，（）： ， ， ， 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·專題綜述·第一作者簡介：牛曉琳（），女，碩士研究生，研究方向為植物營養(yǎng)。：責任作者：張宏彥（），男，博士，副教授，現(xiàn)主要從事養(yǎng)分資源管理等研究工作。：基金項目：“十三五”國家重點研發(fā) 計劃 資助項目（）。收稿日期：棗的裂果機制及防治措施牛 曉 琳，馬 文 鳳，陳 桂 敏，梁軍，張 宏 彥，（中國農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，北京；中國農(nóng)業(yè)大學 曲周實驗站，河北 邯鄲；山東樂陵市農(nóng)業(yè)局，山東 樂陵）摘要：裂果是我國棗生產(chǎn)中面臨的主要問題之一。作為果實發(fā)育過程中一種生理性病害，裂果會導致棗果商品價值嚴重降低，給棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來嚴重損失。該研究主要從棗裂果的類型、棗樹品種、果實解剖結構、礦質元素含量和分布、果皮性能、遺傳因素、外界環(huán)境等方面對裂果機理的研究進行匯總分析，并結合生產(chǎn)中棗裂果問題提出相應的防治管理措施。關鍵詞：棗裂果；影響因素；防治措施中圖分類號： 文獻標識碼： 文章編號：（）棗（ ）屬鼠李科（）棗屬（）植物，是我國特有的果品之一，因其營養(yǎng)價值豐富，深受廣大消費者喜愛。我國占有世界上以上的棗樹資源和近的棗產(chǎn)品國際貿易。棗樹在我國大部分地區(qū)均有栽培，但傳統(tǒng)經(jīng)濟棗樹主要分布在河北、山東、河南、山西和陜西省，栽培面積約占全國的以上。近幾年，新疆棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，截至年，棗種植面積已達到萬，產(chǎn)量占到全國總產(chǎn)量的。目前，我國棗樹栽培面積約為萬，位居全國果樹面積第三，居干果之首。盡管如此，棗生產(chǎn)中存在諸多問 ， ， ， ， ， ， ， ， （ ， ， ； ， ）： ， ， ， ， ： ； ；