基于高通量測(cè)序的草莓白粉病和向日葵 白粉病群落組成分析 張振榮 1 朱維賢 1 董瓊娥 2 錢 玲 1 任建青 1 李亞平 3 王 薇 1 1 昆 明 市 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 研 究 院 云 南 昆 明 650034 2 昆 明 市 植 保 植 檢 站 云 南 昆 明 650032 3 昆 明 三 正 生 物 科 技 有 限 公 司 云南 昆明 650217 摘要 目的 探明相鄰地點(diǎn)同時(shí)爆發(fā)草莓白粉病 CM 向日葵白粉病 XRK 的微生物多樣性與 群落種類差異性 為研究白粉病的侵染特點(diǎn)和防治提供理論依據(jù) 方法 2023年5 7月 分別取位于昆 明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院嵩明基地的溫室大棚草莓白粉病樣品 與之相隔300 m的露天爆發(fā)嚴(yán)重的向日葵白粉病樣 品 進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序 對(duì)這2種植物感染白粉病部位表面的白粉層真菌群落組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行 比較分析 結(jié)果 在97 相似水平下物種分析和聚類顯示 草莓白粉病樣本群落涵蓋1域1界5門17綱 26目35科39屬50種62個(gè)OTU的真菌 向日葵白粉病樣本群落涵蓋1域1界2門5綱7目10科13屬13種 15個(gè)OTU的真菌 草莓白粉病樣本的物種豐富度高于向日葵白粉病樣本 2個(gè)樣本的真菌群落組成與物種 在門 科和屬水平上均呈顯著差異 子囊菌門 Ascomycota 在2個(gè)樣本的相對(duì)豐度均大于93 草莓白粉 病優(yōu)勢(shì)群落以枝孢科 Cladosporiaceae 枝孢屬 Cladosporium 真菌為主 同時(shí)含有青霉科 Aspergillacea 青霉屬 Penicillium 白粉菌科 Erysiphaceae 叉絲單囊殼屬 Podosphaera 等多種真菌微生物 向日葵 白粉病優(yōu)勢(shì)群落由白粉菌科 Erysiphaceae unclassified f Erysiphaceae真菌組成 群落組成相對(duì)單一 結(jié) 論 昆明市相鄰地點(diǎn)同時(shí)爆發(fā)的向日葵白粉病和草莓白粉病的微生物多樣性與群落種類差異極顯著 草莓 白粉病病原菌主要為枝孢屬 Cladosporium 真菌 同時(shí)含有其他多種真菌微生物 向日葵白粉病由白粉菌 科 Erysiphaceae unclassified f Erysiphaceae真菌組成 群落組成相對(duì)單一 且云南省昆明市向日葵白粉病病 原菌種類為白粉菌科 Erysiphaceae 真菌為首次報(bào)道 關(guān)鍵詞 向日葵白粉病 草莓白粉病 真菌多樣性 白粉菌科 Illumina高通量測(cè)序 中圖分類號(hào) S435 121 4 6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1001 3601 2025 03 0046 0093 08 Community Composition Analysis of Strawberry Powdery Mildew and Sunflower Powdery Mildew Based on High throughput Sequencing ZHANG Zhenrong1 ZHU Weixian1 DONG Qiong e2 QIAN Ling1 REN Jianqing1 LI Yaping3 WANG Wei1 1 Kunming Academy of Agricultural Sciences Kunming Yunnan 650034 2 Kunming Plant Protection and Inspection Station Kunming Yunnan 650032 3 Kunming Saturn Biological Technology Group Co Ltd Kunming Yunnan 650217 China Abstract Objective The differences in microbial diversity and community species of strawberry powdery mildew CM and sunflower powdery mildew XRK that occurred simultaneously in adjacent locations were studied to provide the theoretical basis for studying the infection features prevention and control of powdery mildew Method From May to July 2023 the Illumina MiSeq high throughput sequencing of strawberry powdery mildew samples in greenhouse of the Songming Base of Kunming Academy of Agricultural Sciences and outdoor sunflower powdery mildew samples located 300 meters apart was conducted to compare and analyze the fungal community composition and structure of powder layer in surface of two plant parts infected with powdery mildew Result The community of strawberry powdery mildew sample included 62 OTUs of fungi in 1 domain 1 kingdom 5 phyla 17 classes 26 orders 35 families 39 genera 50 species while the community of sunflower powdery mildew sample included 15 OTUs of fungi in 1 domain 1 kingdom 2 phyla 5 classes 7 orders 10 families 13 genera 13 species through species analysis and cluster analysis at the similarity level of 97 The species richness of strawberry powdery mildew sample was higher than that of sunflower powdery mildew sample There were significant differences in fungal community composition and species between the two samples at phylum family and genus levels The relative abundance of Ascomycota in both powdery mildew samples was more than 93 The community of strawberry powdery mildew was dominated by Cladosporium of the family Cladosporiaceae simultaneously containing Penicillium of the family Aspergillaceae Podospaera of the family Erysiphaceae and other fungi 收稿日期 2024 05 24 基金項(xiàng)目 昆明市級(jí)財(cái)政支持項(xiàng)目 農(nóng)業(yè)資源環(huán)境關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)及推廣應(yīng)用 昆財(cái)農(nóng) 2023 號(hào) 作者簡(jiǎn)介 張振榮 1986 女 高級(jí)農(nóng)藝師 碩士 從事農(nóng)業(yè)微生物研究 E mail 402023657 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) Guizhou Agricultural Sciences 2025 53 3 93 100 DOI 10 3969 j issn 1001 3601 2025 03 012microorganism Meanwhile the community of sunflower powdery mildew was dominated by unclassified f Erysiphaceae of the family Erysiphaceae and the community composition was relatively single Conclusion There are very significant differences in microbial diversity and community species between the strawberry powdery mildew and sunflower powdery mildew that erupted simultaneously in adjacent locations of Kunming City The pathogen of strawberry powdery mildew is mainly Cladosporium containing other multiple fungi microorganism Sunflower powdery mildew is dominated by unclassified f Erysiphaceae of the family Erysiphaceae and the community composition is relatively single The pathogen of sunflower powdery mildew in Kunming Yunnan Province is first reported to be Erysiphaceae Key words sunflower powdery mildew strawberry powdery mildew fungal diversity Erysiphaceae Illumina high throughput sequencing 0 引言 研 究 意 義 白 粉 病 病 原 菌 常 在 寄 主 植物的表面 葉片 莖 花 果實(shí)等 產(chǎn)生很 多的分生孢子和菌絲結(jié)構(gòu) 影響植株的光合 作 用 和 整 體 長(zhǎng) 勢(shì) 且 嚴(yán) 重 影 響 果 實(shí) 的 外 觀 口感和品質(zhì)等 進(jìn)而導(dǎo)致寄主作物遭受減產(chǎn) 和經(jīng)濟(jì)損失 長(zhǎng)期以來(lái) 我國(guó)許多地區(qū)白粉 病的發(fā)生普遍而嚴(yán)重 因此白粉病的有效治 理 對(duì) 農(nóng) 業(yè) 可 持 續(xù) 發(fā) 展 具 有 重 要 意 義 前 人 研 究 進(jìn) 展 關(guān) 于 國(guó) 內(nèi) 草 莓 白 粉 病 病 原 菌 種 類 分 子 鑒 定 已 有 報(bào) 道 如2014年 河 南 商 丘溫室草莓白粉病病原菌為奧隆特高氏白 粉菌 Golovinomyces orontii 1 2019年昆明市 西山區(qū)溫室草莓白粉病病原菌為叉絲單囊 殼屬 Podosphaera 2 但多數(shù)文獻(xiàn)對(duì)草莓白 粉病病原菌的描述是引用二三十年前采用 經(jīng) 典 形 態(tài) 學(xué) 觀 察 命 名 的 種 類 和 名 稱 3 如 羽 衣 草 單 囊 殼 Sphaerotheca aphanis Wallr Braun 等 資料信息相對(duì)陳舊 關(guān)于向日葵 白 粉 病 的 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 較 少 史 明 等 4 5 介 紹 了 黑 龍 江 省 向 日 葵 白 粉 病 的 危 害 癥 狀 侵 染 特性和常規(guī)防治方法 并未提及病原菌的分 類 鑒 定 1987年 陳 桂 清 等 6 報(bào) 告 了 向 日 葵 白 粉 病 病 原 菌 是 棕 絲 單 囊 殼 Sphaerotheca fusca 2007年劉鐵志 7 報(bào)道了內(nèi)蒙古向日 葵 白 粉 病 病 原 菌 是 棕 絲 叉 絲 單 囊 殼 Podo sphaera fusca 兩者均采用的是真菌形態(tài)學(xué) 經(jīng)典分類方法 目前 白粉病病原菌尚無(wú)法 實(shí)現(xiàn)人工分離純培養(yǎng) 對(duì)白粉病病原菌的鑒 定分類主要依靠真菌形態(tài)學(xué)經(jīng)典分類方法 8 但這類方法存在局限性 未對(duì)白粉菌的分子 生物學(xué)特性進(jìn)行研究 同時(shí)對(duì)于由多種真菌 侵染的白粉病 很難作出群落組成判斷和鑒 定 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展 用高通量測(cè) 序 技 術(shù)或ITS基 因 測(cè) 序 技 術(shù) 鑒 定 白 粉 病 病 原菌的種類或分析生物多樣性 已經(jīng)成為近 年來(lái)發(fā)展的趨勢(shì) 9 10 研究切入點(diǎn) 近年 來(lái) 受昆明冬春溫暖干燥氣候的影響 白粉 病在昆明地區(qū)的草莓和向日葵等植物上多 發(fā) 常 發(fā) 給 當(dāng) 地 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 造 成 了 嚴(yán) 重 損 害 而 對(duì)這2種 作 物 白 粉 病 病 原 菌 的 調(diào) 查 和 研 究 卻 鮮 有 報(bào) 道 擬 解 決 的 關(guān) 鍵 問(wèn) 題 利 用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 對(duì)位于云 南省昆明市嵩明縣的塑料溫室大棚草莓和 露天向日葵的白粉病病原菌進(jìn)行真菌多樣 性和群落組成對(duì)比分析 以期了解相鄰地點(diǎn) 不同作物同時(shí)爆發(fā)白粉病病原菌的多樣性 與群落種類差異性 為進(jìn)一步研究白粉病的 侵染特點(diǎn)和防治提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 1 1 1 供試植物 2023年5 7月 昆明市農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 研 究 院 嵩 明 基 地 東經(jīng)103 096 333 北緯25 337 102 海拔1 903 5 m 園區(qū)內(nèi)某溫 室 大 棚 面積600 m2 的 草 莓 爆 發(fā) 嚴(yán) 重 白 粉 病 與其相隔300 m的露天向日葵同時(shí)爆發(fā) 嚴(yán)重白粉病 葉片白粉層均厚且明顯 發(fā)病 率均約70 1 1 2 試 劑 和 設(shè) 備 DNA抽 提 試 劑 盒 FastDNA Spin kit for Soil 購(gòu)自MP Biomedicals生 物 醫(yī) 學(xué)公司 GeneJET膠回收試劑盒購(gòu)自Thermo fisher公司 Illumina高通量測(cè)序分析所需試 劑 設(shè)備 檢測(cè)和操作等均由上海美吉生物 醫(yī)藥科技有限公司提供 94 貴 州 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)1 2 采集樣品 2023年6月27日 對(duì)草莓白粉病葉片和 向 日 葵 白 粉 病 葉 片 分 別 取 樣 編 號(hào)為CM 草 莓白粉病 和XRK 向日葵白粉病 具體取 樣方法 在每種作物的發(fā)病區(qū)域內(nèi)選用5點(diǎn) 法 每點(diǎn)用滅菌剪刀剪取3片白粉均勻的葉 片 每個(gè)樣品5點(diǎn)共15片葉片放進(jìn)無(wú)菌采集 袋 中 盡 快 帶 回 實(shí) 驗(yàn) 室 在 無(wú) 菌 操 作 臺(tái) 上 分別用無(wú)菌脫脂棉擦拭樣品表面的白粉孢 子 將脫脂棉擦粘盡量多的白粉孢子并混勻 后 放進(jìn)無(wú)菌離心管中 扭緊管蓋 封口膜封 口 80 保 存 送 上 海 美 吉 生 物 醫(yī) 藥 科 技 有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序 1 3 DNA提取 PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序 樣品總DNA按DNA抽提試劑盒說(shuō)明書 提 取 用NanoDrop2000 美 國(guó)Thermo Scien tific公 司 檢 測(cè)DNA濃 度 和 純 度 用1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢測(cè)DNA提 取 質(zhì) 量 用 ITS3F 5 GCATCGATGAAGAACGCAGC 3 和 ITS4R 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 引 物 11 對(duì)ITS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增程序 反 應(yīng) 參 數(shù) 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 處 理 和 高 通 量 測(cè) 序 等 均 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司按相應(yīng) 標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行 1 4 數(shù)據(jù)處理 使用Fastp 12 fastp version 0 19 6 軟 件 對(duì) 雙 端 原 始 序 列 進(jìn) 行 質(zhì) 控 使用FLASH 13 version 1 2 11 http www cbcb umd edu software flash 軟 件 進(jìn) 行 拼 接 使用UPARSE v7 1 14 15 軟件 uparse 根據(jù)97 的 相 似 度 對(duì) 質(zhì) 控 拼 接 后 的序列進(jìn)行操作分類單元OTU聚類并剔除 嵌合體 為減少測(cè)序深度對(duì)后續(xù)多樣性數(shù) 據(jù)分析的影響 保障結(jié)果準(zhǔn)確可靠 將所有 樣本的序列數(shù)進(jìn)行抽平處理 之后每個(gè)樣本 的平均序列覆蓋度 Good s coverage 仍可 達(dá) 100 利用RDP classifier 16 version 2 11 http rdp cme msu edu 比對(duì)Unite version 8 0 http unite ut ee index php 的真菌數(shù)據(jù)庫(kù) 進(jìn)行OTU 物 種 分 類 學(xué) 注 釋 設(shè)置70 的 置 信 度 閾 值 并 在 門 和科2個(gè) 物 種 分 類 水 平 上 統(tǒng) 計(jì) 分 析 每個(gè)樣本的群落組成和樣本間的物種差異 Fisher exact test費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn) 數(shù)據(jù)分 析均通過(guò)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司 的 美 吉 生 物 一 站 式 科 研 服 務(wù) 平 臺(tái) https 2 結(jié)果與分析 2 1 稀釋曲線及物種統(tǒng)計(jì) 利用OTU水平上草莓 向日葵2個(gè)樣本 的Shannon指數(shù)構(gòu)建2個(gè)白粉病樣品的稀釋 曲線 圖1 顯示 測(cè)序2個(gè)樣本的稀釋曲線 中后端均趨向于平坦直線 表明測(cè)序數(shù)據(jù)量 足夠 測(cè)序數(shù)據(jù)和深度合理 樣本CM橫線 明顯高于XRK 說(shuō)明草莓白粉病的物種豐富 度明顯高于向日葵白粉病 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 5 000 10 000 15 000 20 000 25 000 30 000 35 000 40 000 45 000 樣本數(shù)量 條 Sample number Shannon curves XRK CM OTU水平的Shannon 指數(shù) Shannon index on OTU level 圖 1 草 莓 白 粉 病 和 向 日 葵 白 粉病2個(gè) 樣 本 的 稀 釋 曲 線 在 OTU水平上的Shannon指數(shù) Fig 1 Rarefaction curve Shannon index on OTU level of strawberry powdery mildew samples and sunflower pow dery mildew samples 原 始 序 列 經(jīng) 過(guò) 優(yōu) 化 處 理 后 樣本CM和 XRK獲得有效序列分別為78 032條和44 498 條 按照97 序 列 相 似 性 水 平 上 進(jìn)行OTU 聚 類 按 照 置 信度70 對(duì) 物 種 分 類 注 釋 2 個(gè) 樣 本 的 平 均 測(cè) 序 長(zhǎng) 度為305 bp 共 獲 得 OTU 68個(gè) 其中 樣本CM有59個(gè) 樣本XRK 有9個(gè) 共有的OTU數(shù)目為6個(gè) 圖2 同 時(shí) 樣 本 物 種 統(tǒng) 計(jì) 顯 示 CM涵蓋1域1界5 門17綱26目35科39屬50種62個(gè)OTU的 真 菌 XRK涵蓋1域1界2門5綱7目10科 13屬13種15個(gè)OTU的真菌 合計(jì)涵蓋1域 3 期 張振榮 等 基于高通量測(cè)序的草莓白粉病和向日葵白粉病群落組成分析 95