試驗(yàn)研究 年第 期 總第 期 收稿日期 基金項(xiàng)目 菌株 抗黃連根腐病效果及代謝組學(xué)的研究 黔科院 字 號(hào) 作者簡介 陳迎麗 女 寧夏固原人 高級(jí)工程師 主要從事農(nóng)藥分析 植物病害及其生物防治研究 生物農(nóng)藥創(chuàng)制及農(nóng)藥毒理學(xué)研 究 株黃連根腐病生防菌的鑒定 陳迎麗 余 水 曾 羲 陳貴廷 貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心 貴州貴陽 廣州市食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 摘要 本文采用平板對(duì)峙 分子生物學(xué)鑒定和不同指示培養(yǎng)基檢測(cè)相結(jié)合的方法 篩選并鑒 定土壤中具有拮抗黃連根腐病菌的菌株并研究其抑菌機(jī)制 以期為黃連根腐病 的 防治提供更好的生物防治方法 結(jié)果表明 從土壤中篩選出 株對(duì)黃連根腐病具有明顯拮抗效 果的芽孢桿菌 編號(hào) 均為貝萊斯芽孢桿菌 經(jīng)抗菌譜實(shí)驗(yàn)證明 株菌株具有廣譜抗菌性 對(duì)多種植物病原真菌均有明顯拮抗作用 其中對(duì)辣椒炭疽病菌 的抑制效果最明顯 分別為 特定平板測(cè)定發(fā)現(xiàn) 均能產(chǎn)生纖維素酶和磷酸酯酶 是有極高生物防治潛力的菌株 關(guān)鍵詞 黃連 根腐病菌 抑制作用 貝萊斯芽孢桿菌 中圖分類號(hào) 文獻(xiàn)識(shí)別碼 文獻(xiàn)編號(hào) 黃連 是毛茛科 黃連屬的多年 生草本植物 具有抗菌 抗毒和解毒的功效 主要產(chǎn) 于廣西 云南 貴州等地區(qū) 是一味重要的民間中藥 材 黃連根腐病是危害黃連生產(chǎn)的主要土傳病害之 一 發(fā)病面積廣 發(fā)病情況嚴(yán)重 主要危害黃連的地下 莖塊 初期葉片發(fā)黃 后變黑褐色并干枯 極大影響了 黃連的生產(chǎn) 目前 防治黃連根腐病害的方法包括農(nóng) 業(yè)防治 化學(xué)防治和生物防治 但農(nóng)業(yè)防治效果 差 化學(xué)防治雖然效果好 操作便捷 價(jià)格低 但長期 使用容易造成農(nóng)藥殘留量超標(biāo) 中藥材污染 危害人 類健康并造成環(huán)境污染 而且還易產(chǎn)生抗藥性 隨著人們對(duì)健康和環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng) 安全無污 染的中藥材根腐病的防治方法越來越受到重視 而 生物防治法可以彌補(bǔ)以上不足 不僅成本低且對(duì)環(huán) 境友好 是一種理想的防治手段 近年來 中藥 材根腐病的生物防治多為微生物活菌體 沈永昶 等從三七植株中篩選出解淀粉芽孢桿菌 和枯草芽孢桿菌 對(duì)三七根腐病具有顯著的拮抗效 果 其防治效果高達(dá) 游景茂等從白術(shù)體內(nèi) 分離得到一株枯草芽孢桿菌 經(jīng)田間防效試 驗(yàn)證明 抑菌率超過 具有促生效果 生物防治作為抗病研究的先鋒 其中的芽孢桿 菌更是以可產(chǎn)生具有拮抗效果的次生代謝產(chǎn)物以 及抗逆性強(qiáng)的芽孢而倍受推崇 并且芽孢桿菌拮抗 機(jī)制多樣化 能在植物根際有效定殖并保持較高群 體數(shù)量 而貝萊斯芽孢桿菌 是 芽孢桿菌中的一種 是連接土壤和植物的優(yōu)勢(shì)微生 物 對(duì)環(huán)境兼容性高 可抑制植物病原菌和促進(jìn)植物 生長 具有廣譜抗菌活性 在植物病蟲害生物防治 提 年第 期 總第 期 試驗(yàn)研究 高糧食產(chǎn)量和品質(zhì)以及生物農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用上有較大 應(yīng)用前景 陳爽等探究了貝萊斯芽孢桿菌 對(duì)大豆根腐病盆栽防治效果和防御酶活性 結(jié)果表 明 不僅具有促生作用 對(duì)大豆根腐病還具有 防治作用 可以誘導(dǎo)防御酶的活性 近年來 因黃連根腐病發(fā)病率高 嚴(yán)重制約了 黃連的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展 但尚未見利用貝萊斯芽孢桿菌 防治黃連根腐病的報(bào)道 本文將以黃連根腐病菌 為防治對(duì)象 從土壤中分離出微生物 進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn) 篩選并鑒定土壤中具有拮抗黃 連根腐病菌的菌株并探究其抑菌機(jī)制 以期為黃連 根腐病的最佳防治方法提供依據(jù) 材料與方法 試驗(yàn)材料 土壤 年 月在貴州省貴陽市白云區(qū)青山村采 集黃連根腐病發(fā)病較重地塊的健康植株根際土壤 使 用 點(diǎn)取樣法采集 深度的土壤 再用經(jīng) 酒精滅菌 無菌水清洗 次的鐵鍬收集土壤于滅 菌過的牛皮紙信封袋中 在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng) 菌株 病原菌為黃連根腐病菌 煙草黑 脛病菌 番茄灰霉病菌 辣椒炭疽病菌 由貴 州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)教研室保存并提供 供試培養(yǎng)基 參照文獻(xiàn) 配制 液體培養(yǎng)基 固體培 養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基 纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基和磷 酸酯酶檢測(cè)培養(yǎng)基 試驗(yàn)方法 菌株分離 將 試驗(yàn)土壤添加至盛有 無菌水的 錐形瓶中 于 水浴鍋中水浴 每隔 振蕩錐形瓶 使混合液中大部分細(xì)菌除芽孢桿菌外 被殺死 搖培結(jié)束后靜置 將 混合液添 加至 無菌水中 并采用梯度稀釋法 分別得到 的稀釋液 取 稀釋液 均勻涂抹至固體 培養(yǎng)基上 待菌液干漬后密 封 倒置存放于細(xì)菌培養(yǎng)箱中 在 下培養(yǎng) 菌液制備 挑取菌株單菌落接種劃線于固體 培養(yǎng)基上 純化菌株 將純化后的菌株接種到 的離心管 中 內(nèi)有 的 液體養(yǎng)基 在搖床中以 黑暗條件下培養(yǎng) 培養(yǎng)結(jié)束后以 離心收集離心管底部菌體 最后加入 無菌水懸浮制備成細(xì)菌懸浮液 另外取 的菌液與 滅過菌的 甘油混合 保存于 冰箱中 拮抗芽孢桿菌篩選及抑菌譜測(cè)定 以黃連根腐病菌為靶標(biāo)病原菌 煙草黑脛病菌 番茄灰霉病菌 辣椒炭疽病菌為對(duì)峙病原菌 采用平 板對(duì)峙法 同 制備懸浮菌液 再將病原菌菌 餅 使用打孔器切割直徑約 接種至 平板 中央處 距菌餅 處對(duì)稱滴加細(xì)菌懸浮液 以只接病原菌 板為對(duì)照組 培養(yǎng) 待 空白對(duì)照病原菌菌落長滿整個(gè)平板時(shí) 觀察并記錄菌 落直徑 采用十字交叉法 計(jì)算抑菌率 抑菌率 對(duì)照菌落直徑 處理菌落直徑 對(duì)照菌落直徑 菌落形態(tài)觀察 根據(jù) 制備的懸浮液滴 加 至 平板中 央 密封于培養(yǎng)箱中 條件下暗培養(yǎng) 觀察 生理生化特征測(cè)定 根據(jù) 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 進(jìn)行生理生化 特性測(cè)定 分子生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌 提取試劑盒 無錫百泰克生物 技術(shù)有限公司 提取待測(cè)菌株基因組 以菌株 為模板 通用引物 和 對(duì)菌 株 進(jìn)行 擴(kuò)增 擴(kuò)增采用 的反應(yīng)體 系 引物各 反應(yīng)程序 預(yù)變性 變性 退火 延伸 個(gè) 循環(huán)后 延伸 的 反應(yīng)程序與 相似 但退火溫度為 擴(kuò)增產(chǎn)物 送生工生物工程 上海 有限公司進(jìn)行測(cè)序 將獲取的基因序列在 基因數(shù)據(jù)庫中 通過 進(jìn)行同源序列相似性比對(duì)分析 再在 上下載相關(guān) 權(quán)威菌種對(duì)應(yīng)序列 使用 軟件將所測(cè)序列 試驗(yàn)研究 年第 期 總第 期 和從 下載的相關(guān)序列進(jìn)行人工調(diào)整以保證各 對(duì)堿基的同源性 利用 軟件 進(jìn)行 分析 系統(tǒng)構(gòu)建采用啟發(fā)式搜索 以隨機(jī)添加序列方式 次重復(fù) 自展 法檢驗(yàn) 用于評(píng)估系統(tǒng)樹各節(jié)點(diǎn)的支持 率 在測(cè)試中重復(fù) 次分別構(gòu)建 和 的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹 機(jī)制測(cè)定 通過制備特定平板檢測(cè)菌株是否產(chǎn)生纖維素 酶 磷酸酯酶等 測(cè)定其生防機(jī)制 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用 分析軟件處理 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析 結(jié)果與分析 拮抗菌篩選 初篩 通過平板對(duì)峙篩選出對(duì)黃連根腐病菌有 拮抗效果的菌株 分別編號(hào) 圖 圖 黃連根腐病菌拮抗菌初篩 復(fù)篩 再次對(duì)菌株 進(jìn)行平板對(duì)峙 拮抗效果明顯 的抑菌率為 的抑菌率為 圖 圖 黃連根腐病菌復(fù)篩 拮抗真菌菌絲 將黃連根腐病菌菌絲置于顯微 鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)處理組菌絲出現(xiàn)畸形或膨大的現(xiàn)象 圖 拮抗菌鑒定 菌株生理生化測(cè)定 測(cè)定結(jié)果表明 菌株和 菌株革蘭 氏染色 甲基紅 硫化氫 亞硝酸還原及 反應(yīng)均 圖 處理組菌絲變化情況 呈陽性 可以產(chǎn)生過氧化氫酶 淀粉水解酶 使明膠 液化 葡萄糖氧化發(fā)酵 并能分解麥芽糖 鼠李糖和 甘露醇 表 表 菌株和 菌株的生理生化測(cè)定結(jié)果 特征結(jié)果特征結(jié)果 革蘭氏染色反應(yīng) 甘露醇 甲基紅 麥芽糖 鼠李糖 過氧化氫 淀粉水解 硫化氫試驗(yàn) 反應(yīng) 明膠液化 山梨醇 葡萄糖氧化反應(yīng) 亞硝酸還原 硝酸還原酶 注 陽性 陰性 拮抗菌分子鑒定 經(jīng)過 基因比對(duì)發(fā)現(xiàn) 與貝萊斯 芽孢桿菌 的同源性為 與貝萊斯芽孢桿菌 的同源性為 通過 的基因比對(duì)發(fā)現(xiàn) 與貝萊斯芽孢桿菌 的同源性為 與貝萊斯芽 孢桿菌 及 的同源性為 圖 圖 拮抗菌形態(tài) 通過芽孢桿菌形態(tài)鑒定可知 均為圓形乳 黃色菌落 為圓形乳白色菌落 有一圈隆 起狀圈中部分干燥 中心光滑呈花狀 圖 圖 菌落形態(tài) 結(jié)合以上部分 通過形態(tài)學(xué) 分子生理學(xué)鑒定 得知 菌株 均為貝萊斯芽孢桿菌 生防機(jī)制 抑菌譜測(cè)定 室內(nèi)對(duì) 株芽孢桿菌抑菌譜進(jìn)行測(cè)定 并對(duì)其 年第 期 總第 期 試驗(yàn)研究 圖 芽孢桿菌 的 系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 芽孢桿菌 的 系統(tǒng)發(fā)育樹 抑菌率進(jìn)行方差分析 結(jié)果如圖 和表 所示 發(fā) 現(xiàn) 菌株對(duì)辣椒炭疽病的抑菌效果最明 顯 抑菌率分別為 株菌株對(duì)煙 草黑脛病也有抑制效果 抑菌率分別為 此外 對(duì)番茄灰霉病抑制效果較差 抑制率 分別為 株菌株對(duì)煙草黑脛病 番 茄灰霉病 辣椒炭疽病的抑制率不存在明顯差異 圖 株芽孢桿菌抑菌譜測(cè)定 表 株芽孢桿菌對(duì) 株病原真菌抑菌率測(cè)定結(jié)果 菌株辣椒炭疽病菌番茄灰霉病菌煙草黑脛病菌 注 不同小寫字母表示差異顯著 機(jī)制測(cè)定 由圖 可知 株芽孢桿菌均在磷酸酯酶和纖 維素酶檢測(cè)平板產(chǎn)生消解圈 表明其均能產(chǎn)生磷酸 酯酶和纖維素酶等物質(zhì) 圖 株芽孢桿菌纖維素酶和磷酸酯酶檢測(cè) 試驗(yàn)研究 年第 期 總第 期 結(jié)論與討論 本研究從采集的土壤中分離得到對(duì)黃連根腐 病有明顯生防能力的 菌株 經(jīng)形態(tài)學(xué) 生理生化和分子學(xué)鑒定 株菌株均為貝萊斯芽孢桿 菌 并發(fā)現(xiàn) 可以使黃連根腐病菌菌絲 膨大和畸形 對(duì)煙草黑脛病菌 番茄灰霉病菌和辣 椒炭疽病菌的病原菌均具有明顯的抑制效果 對(duì) 株菌株的抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步的探究 發(fā)現(xiàn)其均可 產(chǎn)生纖維素酶和磷酸酯酶 具有降解真菌細(xì)胞壁 去磷酸化促進(jìn)生長的潛力和產(chǎn)生伊枯草菌素 伊枯草菌素 等脂肽類物質(zhì)從而防治植物病 原菌 程歡歡等研究發(fā)現(xiàn) 從辣椒根部土壤中篩選獲 得的貝萊斯芽孢桿菌 可以抑制多種病原菌 生長 并且能產(chǎn)生纖維素酶和磷酸酯酶 而倪方 方等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌分泌的蛋白質(zhì)酶 纖維素酶等能 致使真菌細(xì)胞壁破壞 導(dǎo)致真菌結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 使得 真菌菌絲膨大 畸形 從而直接抑制真菌的生長 菌株 不僅擁有廣泛的抑菌譜 還可產(chǎn) 生纖維素和磷酸酯酶 這說明菌株 可 以分泌纖維素酶等物質(zhì)直接抑制病原真菌的生長 自然環(huán)境下 能被植物直接吸收利用的無機(jī)磷較 少 但卻有較多的有機(jī)磷 而有機(jī)磷可以被溶磷類 菌株有效地分解成無機(jī)磷并直接被植物吸收利用 有研究指出菌株 能夠產(chǎn)生磷酸 酯酶 能高效地分解土壤中的有機(jī)磷 其解磷量可 高達(dá) 而菌株 和菌株 能使磷酸酯酶檢測(cè)培養(yǎng)基產(chǎn)生消解圈 證明菌株 和菌株 具有分解土壤有機(jī)磷促進(jìn)植物 生長的能力 生物防治是當(dāng)代的研究熱門方向之一 大量拮 抗菌如芽孢桿菌被用于生物防治 且已有芽孢桿菌 成為商業(yè)產(chǎn)品投入作物生產(chǎn)中 本次研究表明 菌 株 和菌株 具有較高的生防潛力 下一 步 將繼續(xù)更深入的研究菌株 和菌株 的盆栽防效和促生作用 并對(duì)防御酶活性及主要抑 菌物質(zhì)進(jìn)行探究 以期為黃連根腐病菌提供更好的 生物防治方法 推動(dòng)黃連的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展 參考文獻(xiàn) 程歡歡 楊芳 高晉 等 黃連根腐病病原鑒定及其對(duì)殺菌劑敏 感性測(cè)定 植物病理學(xué)報(bào) 穆向榮 馬逾英 楊枝中 等 藥用植物根腐病防治的研究進(jìn)展 中藥與臨床 鄭祿宇 常見根莖類中藥材根腐病的為害與防治 植物醫(yī) 生 沈永昶 曹貝貝 胡淼 等 三七根腐病原菌拮抗菌的篩選與活性分 析 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 游景茂 熊坤 穆森 等 內(nèi)生細(xì)菌 的鑒定及對(duì)白術(shù)根腐 病的生物防治研究 中國中藥雜志 郭慶港 王培培 董麗紅 等 雙組分系統(tǒng)對(duì)枯草芽 胞桿菌 菌落形態(tài)和芽胞形成的影響 植物病理學(xué) 報(bào) 蔡高磊 張凡 歐陽友香 等 貝萊斯芽孢桿菌 研究進(jìn)展 北方園藝 陳爽 王繼華 張必弦 等 貝萊斯芽孢桿菌對(duì)大豆根腐病盆 栽防效及防御酶活性檢測(cè) 分子植物育種 方中達(dá) 植病研究方法 第 版 北京 中國農(nóng)業(yè)出版 社 邱德文 我國植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策略 植物 保護(hù) 東秀珠 蔡秒英 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 北京 科學(xué)出版 社 程歡歡 姚偉偉 彭麗娟 等 一株辣椒炭疽病生防芽孢桿菌 的篩選 北方園藝 倪方方 徐紅梅 宋騰蛟 等 生防菌對(duì)白術(shù)根腐病菌的拮抗 作用及盆栽防治效果 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 晉婷婷 任嘉紅 劉瑞祥 南方紅豆杉根際解有機(jī)磷細(xì)菌的鑒 定及其解磷特性和促生作用研究 西北植物學(xué)報(bào)