<p>馬鈴薯試管薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 ICS 65.020.01 B 23 DB21 遼 寧 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn) DB21/T 26752016 2016 -07- 26發(fā)布 2016 -09- 26實(shí)施 遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 &nbsp; 發(fā) 布 &nbsp;DB21/T 2675-2016 前 &nbsp;言 本規(guī)程按照GB/T 1.12009的規(guī)則起草。 本標(biāo)準(zhǔn)由沈陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由沈陽市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：沈陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、遼寧職業(yè)學(xué)院。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：潘菊、張健、劉慧銘、胡穎、高紅治、楊雙、施驥、馬東梅、李寧、李金鳳、楊璐、宋揚(yáng)、宋偉、張喆。 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范于2016年首次發(fā)布。 DB21/T 2675-2016 1 馬鈴薯試管薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 1 &nbsp;范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯試管薯生產(chǎn)所需的儀器設(shè)備及化學(xué)試劑，組培苗生產(chǎn)流程，試管薯誘導(dǎo)、收獲的操作規(guī)程。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯試管薯生產(chǎn)。 2 &nbsp;規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。 GB 18133 馬鈴薯種薯 GB/T 29375馬鈴薯脫毒試管苗繁育技術(shù)規(guī)程 GB/T 29376馬鈴薯脫毒原原種繁育技術(shù)規(guī)程 DB21/T 1735馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 DB21/T 2341馬鈴薯種薯（種苗）病毒多重 RT-PCR 檢測技術(shù)規(guī)程 3 &nbsp;術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3.1 &nbsp;脫毒苗 應(yīng)用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的再生試管苗，經(jīng)檢測不帶馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯A病毒（PVA）等病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)，即為脫毒苗。 3.2 &nbsp;試管薯 Microtuber &nbsp;用脫毒苗在容器內(nèi)生產(chǎn)的微型小薯。 3.3 &nbsp;微型薯Minituber 利用脫毒苗或試管薯在防蟲溫室或網(wǎng)室隔離條件下生產(chǎn)出來的微型種薯。 4 &nbsp;組培所需的儀器設(shè)備及化學(xué)試劑 &nbsp;4.1 &nbsp;儀器設(shè)備 培養(yǎng)基制作和滅菌設(shè)備：爐具、鍋、高壓滅菌器等。 接種及培養(yǎng)設(shè)備和容器：超凈工作臺、接種器具高溫滅菌器、培養(yǎng)架、空調(diào)及冬季加溫設(shè)備等。 DB21/T 2675-2016 2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：萬分之一天平、電子天平、顯微鏡、電冰箱、藥品柜、自來水蒸餾純化設(shè)備、pH計(jì)、手推車等。 4.2 &nbsp;玻璃器皿及器材 包括盛裝器皿（燒杯、試劑瓶等）、計(jì)量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。主要有：試劑瓶、容量瓶、燒杯、玻璃棒、洗瓶、培養(yǎng)瓶及瓶蓋、瓶刷、工作服、手套等。 4.3 &nbsp;常用化學(xué)試劑 包括組培苗基本培養(yǎng)基所需的無機(jī)鹽類和有機(jī)物類。MS 基本培養(yǎng)基成分及母液配制參見附錄A；其它常用試劑及植物生長物質(zhì)的配制參見附錄B。 5 &nbsp;培養(yǎng)基制作 5.1 &nbsp;母液的配制與保存 制作培養(yǎng)基前需先配制基本培養(yǎng)基母液，MS基本培養(yǎng)基母液配制比例參見附錄A。母液配制應(yīng)使用去離子水，配好的母液置于4保存，母液保存期應(yīng)不超過30d。母液容器上應(yīng)貼好標(biāo)簽，注明名稱、配制日期，發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽不明或母液中有沉淀、渾濁或變色現(xiàn)象應(yīng)停止使用。 &nbsp;5.2 &nbsp;培養(yǎng)基制作 &nbsp;以制作1L固體培養(yǎng)基為例：根據(jù)培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備好蒸餾水、瓊脂、蔗糖和各類母液等。加蒸餾水700mL（按所需容量的70%左右），再加入瓊脂7g，加熱并不斷攪拌使瓊脂完全融化。加入蔗糖30g，待完全溶解后，按附錄A加入母液，再根據(jù)要求加入適量植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)并充分?jǐn)嚢?，最后定容?L。用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.8。 制作液體培養(yǎng)基的過程基本相同，但不需要加瓊脂，加熱時(shí)間可以適當(dāng)縮短。 5.3 &nbsp;培養(yǎng)基滅菌 制作好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中后，裝入高壓滅菌鍋在0.1Mpa壓力下滅菌20min，取出后水平擺放，冷卻備用。 5.4 &nbsp;培養(yǎng)基配方 擴(kuò)繁培養(yǎng)基：MS+蔗糖30g/L+瓊脂7g，pH 5.8，固體培養(yǎng)基 壯苗培養(yǎng)基：MS+蔗糖30g/L，pH 5.8，液體培養(yǎng)基 試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+500mg/L CCC +80g/L白糖+0.1%活性炭，pH 5.8，液體培養(yǎng)基 6 &nbsp;試管薯生產(chǎn) 6.1 &nbsp;誘導(dǎo)材料選取 選擇具備該品種典型性狀的株系，挑選植株健壯、長勢良好、莖稈粗壯、根系發(fā)達(dá)的脫毒苗作為誘導(dǎo)材料。 6.2 &nbsp;脫毒苗繁育 DB21/T 2675-2016 3 6.2.1 &nbsp;脫毒苗轉(zhuǎn)接 將健壯基礎(chǔ)苗剪去頂芽和基部莖節(jié)，留中間帶46個(gè)節(jié)的莖段，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方及制作方法見5，用淺層靜止方式培養(yǎng)。34周后每個(gè)莖段發(fā)育成一株帶有57個(gè)節(jié)的健壯苗。 6.2.2 &nbsp;培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度為白天2325、夜間1620，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度4000Lx以上。 6.2.3 &nbsp;病毒檢測 繼代擴(kuò)繁中選留的脫毒苗，在批量誘導(dǎo)之前要作一次病毒檢測，條件具備的可在本單位進(jìn)行自檢（檢測方法可參考DB21/T 2341-2014 馬鈴薯種薯（種苗）病毒多重RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程），然后送到國家法定植檢部門復(fù)檢認(rèn)定，沒有檢出 PLRV、PVX、PVY、PVA、PVS和PSTVd等病毒和類病毒的脫毒苗，才能進(jìn)行擴(kuò)繁或誘導(dǎo)。不合格的脫毒苗不得用于生產(chǎn)。 6.3 &nbsp;試管薯誘導(dǎo) 在無菌條件下，將培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)基倒掉，再注入誘導(dǎo)結(jié)薯培養(yǎng)基（培養(yǎng)基制作見5）。在室溫及光照16h/d條件下培養(yǎng)48h以促進(jìn)匍匐莖的形成，然后轉(zhuǎn)入18±1黑暗間散射光(8h/d，光照強(qiáng)度5001000Lx)培養(yǎng)，34d后便可以產(chǎn)生試管薯，4045d試管薯發(fā)育到直徑5mm以上可以收獲。 6.4 &nbsp;試管薯收獲及儲存 收獲時(shí)將試管薯及莖段從培養(yǎng)瓶中取出，摘取符合收獲標(biāo)準(zhǔn)的小薯，用清水多次沖洗，直至洗凈表面附著的培養(yǎng)基，于陰涼處陰干或烘干，再貯藏于透氣的容器中，置于4條件下保存。試管薯經(jīng)國家法定植檢部門檢驗(yàn)合格后，方可作為商品種薯。 DB21/T 2675-2016 4 附 錄 A （資料性附錄） MS培養(yǎng)基母液成分及配制 母液種類 成分 稱取用量（g） 母液定容體積（ml） 配制1升MS培養(yǎng)基吸取量（ml） CaCl2 (無水) 3.32 KNO3 19.0 KH2PO4 1.7 NH4NO3 16.5 大量元素 （A） MgSO4·7H2O 3.7 1000 100 H3BO3 0.620 MnSO4·H2O 2.230 ZnSO4·7H2O 0.860 KI 0.083 Na2MoO4·2H2O 0.025 CuSO4 0.0016 微量元素 （B） CoCl2·6H2O 0.0025 1000 10 EDTA-Na2 3.73 鐵鹽（C） FeSO4·7H2O 2.78 1000 10 肌醇 5.000 甘氨酸 0.100 煙酸 0.025 鹽酸吡哆辛(B6) 0.025 維生素 （D） 鹽酸硫胺素(B1) 0.020 500 10 注： * A母液中 CaCl2，KH2PO4，KNO3，NH4NO3分別溶解混合加水至 800ml左右，再稱取 MgSO4·7H2O溶解后與之合并，定容至1000ml。 * C母液中EDTA-Na2與FeSO4·7H2O應(yīng)分別用熱水溶解后混合并加熱使其充分螯和。 DB21/T 2675-2016 5 附 錄 B （資料性附錄） 常用試劑及植物生長物質(zhì)的配制 B.1 &nbsp;0.1mol/L HCl 的配制：根據(jù)鹽酸的密度 37%鹽酸溶液的密度為 1.19g/ml，假設(shè)要配制1000ml 1mol/L HCl，則需要鹽酸的物質(zhì)的量為 1mol，所以需要量取 37%的鹽酸為0.1*36.5/37%/1.19=8.2ml B.2 &nbsp;0.1mol/L NaOH的配制：稱0.4gNaOH，溶于100ml蒸餾水中。 B.3 &nbsp;95%的酒精配制成 75%的酒精：用量筒量取 750ml 的 95%酒精加入 200ml 的蒸餾水即可得到75%的酒精。</p>