2025 01 09 發(fā)布 2025 05 01 實施 萵苣品種鑒定 SSR分子標(biāo)記法 05 中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 備案號 XXXX XXXX 65 020 01 CCS B 4494 2025 Identification of lettuce Lactuca sativa L varieties SSR marker method 中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 發(fā)布 NY T 目 次 前言 范圍 規(guī)范性引用文件 術(shù)語和定義 縮略語 原理 主要儀器設(shè)備及試劑 溶液配制 引物相關(guān)信息 參照品種 操作程序 結(jié)果統(tǒng)計 結(jié)果判定 附錄A 規(guī)范性 主要儀器設(shè)備及試劑 附錄B 規(guī)范性 溶液配制 附錄C 規(guī)范性 引物名單及序列 附錄D 資料性 引物相關(guān)信息 附錄E 資料性 參照品種相關(guān)信息 NY T 前 言 本文件按照GB T 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 部分 標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則 的規(guī)定起 草 請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利 本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任 本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種業(yè)管理司提出 本文件由全國植物新品種測試標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會 SAC TC 歸口 本文件起草單位 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京市農(nóng)林科學(xué)院 本文件主要起草人 鄧超 凌晨 徐振江 趙洪 李波 顏軍 龐雪兵 王晨宇 馬瑩雪 張靖立 馮艷芳 唐 浩 陳紅 張秀杰 NY T 萵苣品種鑒定 SSR分子標(biāo)記法 范圍 本文件規(guī)定了利用簡單重復(fù)序列 SSR 標(biāo)記進(jìn)行萵苣 LactucasativaL 品種鑒定的操作程序 結(jié) 果統(tǒng)計與結(jié)果判定 本文件適用于萵苣品種SSR指紋數(shù)據(jù)采集 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和品種鑒定 規(guī)范性引用文件 下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款 其中 注日期的引用文件 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改單 適用于本文 件 GB T 農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程 扦樣 GB T 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 NY T 植物品種鑒定 DNA分子標(biāo)記法 總則 術(shù)語和定義 NY T 規(guī)定的術(shù)語和定義適用于本文件 縮略語 下列縮略語適用于本文件 APS 過硫酸銨 ammoniumpersulphate bp 堿基對 basepair CTAB 十六烷基三甲基溴化銨 cetyltrimethylammoniumbromide DNA 脫氧核糖核酸 deoxyribonucleicacid dNTPs 脫氧核糖核苷三磷酸 deoxy ribonucleosidetriphosphate EDTA 乙二胺四乙酸 ethylenediaminetetraaceticacid PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerasechainreaction SSR 簡單重復(fù)序列 simplesequencerepeat Taq酶 耐熱DNA聚合酶 Taq DNApolymerase Tris 三羥甲基氨基甲烷 Tris hydroxymethyl methylaminomethaneTHAM TE 三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸 Tris EDTA TBE 三羥甲基氨基甲烷硼酸鹽乙二胺四乙酸 Tris borate EDTA TEMED 四甲基乙二胺 N N N N tetramethylethylenediamine 原理 不同萵苣品種基因組中SSR的重復(fù)次數(shù)存在差異 這種差異可通過PCR擴(kuò)增及電泳方法進(jìn)行檢測 進(jìn)而區(qū)分不同的萵苣品種 主要儀器設(shè)備及試劑 主要儀器設(shè)備及試劑見附錄A NY T 溶液配制 溶液配制方法見附錄B 引物相關(guān)信息 引物名單及序列見附錄C 引物相關(guān)信息見附錄D 參照品種 參照品種相關(guān)信息見附錄E 操作程序 樣品準(zhǔn)備 送檢樣品可為種子 幼苗 葉片等組織或器官 樣品需扦樣時 應(yīng)符合GB T 的要求 每份樣 品取不少于 個個體的葉片或其他等效物 混合分析 必要時進(jìn)行個體檢測 DNA提取 取幼苗或葉片 mg mg 置于 mL離心管 加液氮充分研磨 每管加入 L經(jīng) 預(yù) 熱的CTAB提取液 充分混合 水浴 min min 其間多次輕緩顛倒混勻 每管加入與CTAB 提取液等體積的三氯甲烷和異戊醇混合液 輕緩混勻后靜置 min 在 r min離心 min 吸取 上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中 加入等體積預(yù)冷的異丙醇 輕輕顛倒混勻 放置 min r min離心 min 棄上清液 用體積分?jǐn)?shù)為 的乙醇溶液洗滌 遍 晾干 加入 L雙蒸 水或TE緩沖液充分溶解 檢測DNA濃度后 備用 注 以上為推薦的DNA提取方法 DNA質(zhì)量能夠滿足PCR擴(kuò)增要求的其他DNA提取方法均適用 DNA溶液的紫 外吸光度OD 與OD 的比值宜介于 注 三氯甲烷和異戊醇混合液中三氯甲烷與異戊醇的體積比為 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積和各組分的終濃度參照表 配制 可以依據(jù)試驗條件調(diào)整 表 中的緩 沖液若含有氯化鎂 MgCl 不再加MgCl 溶液 加等體積雙蒸水替代 利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGE 檢測時選擇普通引物 利用熒光毛細(xì)管電泳檢測時選擇熒光標(biāo)記引物 熒光標(biāo)記位于上游引物 端 推薦的熒光標(biāo)記見附錄D 表 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 反應(yīng)組分原濃度終濃度推薦加樣體積 L 緩沖液 含MgCl dNTPs mmol L mmol L Taq酶 U L U L 上游引物 mol L mmol L 下游引物 mol L mmol L DNA ng L ng L 雙蒸水 總體積 反應(yīng)程序 推薦反應(yīng)程序為 預(yù)變性 min 變性 s 退火 s 延伸 min 共 個循環(huán) NY T 延伸 min 產(chǎn)物 保存 反應(yīng)程序中各反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)PCR擴(kuò)增儀型號 酶 引物等不同而做 適當(dāng)?shù)恼{(diào)整 PCR產(chǎn)物檢測 變性PAGE 制膠 用洗滌劑將玻璃板清洗干凈 再用雙蒸水 無水乙醇分別擦洗 遍 玻璃板干燥后 將 mL親和 硅烷工作液均勻涂在長玻璃板上 將 mL剝離硅烷工作液均勻涂在帶凹槽的短玻璃板上 操作過程 中防止 塊玻璃板互相污染 玻璃板徹底干燥后 將 mm厚的塑料隔條整齊放在長玻璃板兩側(cè) 蓋上 凹槽短玻璃板 用夾子固定 用水平儀檢查玻璃膠室是否水平 配制 PAGE膠 取 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為 的PAGE膠溶液 加入 mL蒸餾水 L四甲基乙二胺 TEMED 和 L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 的 過硫酸銨 APS 迅速混勻 將膠灌入玻璃膠室 灌膠過程中防止出現(xiàn)氣泡 待膠室灌滿后 在凹槽處將 mm厚鯊魚齒梳子平齊端向里輕輕插入膠液約 mm 室溫聚合 h以上 膠聚合后 清理膠板表面 溢出的膠液 輕輕拔出梳子 用水清洗干凈備用 注 為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性 建議玻璃板的規(guī)格為 cm cm 變性 在 LPCR產(chǎn)物中加入 L 加樣緩沖液 混勻 在PCR儀上運(yùn)行 變性 min 取出立即 置于冰上 冷卻 min以上備用 電泳 將膠板安裝于電泳槽上 在電泳正極槽 下槽 加入 mL的 TBE緩沖液 負(fù)極槽 上槽 加入 mL經(jīng)的 TBE緩沖液 使其超過凝膠頂部約 cm W恒功率預(yù)電泳 min min 用移液 器吹吸加樣槽 清除氣泡和雜質(zhì) 將樣品梳 鯊魚齒朝下 插入凝膠 mm mm 每一個加樣孔點(diǎn)入 L L樣品 除送檢樣品外 還應(yīng)同時加入?yún)⒄掌贩N擴(kuò)增產(chǎn)物 W恒功率電泳 電泳時間參考二 甲苯青指示帶移動的位置和擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段大小范圍 見附錄D 加以確定 二甲苯青指示帶在 PAGE膠電泳的移動位置與 bp擴(kuò)增產(chǎn)物泳動的位置大致相當(dāng) 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在 bp bp bp bp范圍的 電泳參考時間分別為 h h h h 電泳結(jié)束后關(guān)閉電源 取下玻璃板并輕輕撬開 通常凝膠附著在長玻璃板上 染色 將附著凝膠的長玻璃板膠面向上浸入固定液中 輕輕晃動 min后取出 在雙蒸水中快速漂洗 時間 不超過 s 將膠板放入染色液中 輕輕晃動 min后取出 在雙蒸水中快速漂洗 時間不超過 s 將膠板 放入顯影液中 輕搖晃動待條帶清晰后取出 再迅速放入固定液中定影 min取出 在雙蒸水中漂洗 min 取出膠板 晾干 放在膠片觀察燈上觀察 記錄結(jié)果 拍照保存 注 固定液 染色液 雙蒸水和顯影液的用量 可依據(jù)膠板數(shù)量和大小調(diào)整 以淹沒膠面為準(zhǔn) 熒光毛細(xì)管電泳 PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)備 按照預(yù)先確定的引物分組 分別取等體積的同一組中不同熒光引物的擴(kuò)增產(chǎn)物 混勻稀釋 從混合液 中吸取 L 加入DNA分析儀專用 孔板中 板中各孔分別加入 L分子量內(nèi)標(biāo)和 L去離子 甲酰胺 在PCR儀上 變性 min 取出后立即置于冰上 冷卻 min以上 瞬時離心 s后備用 注 引物分組和稀釋倍數(shù)通過熒光毛細(xì)管電泳預(yù)實驗確定 等位變異檢測 打開DNA分析儀 檢查儀器工作狀態(tài)和試劑狀態(tài) 將裝有樣品的 孔上樣板放置于樣品架基座 上 打開數(shù)據(jù)收集軟件 按照儀器使用手冊 編輯樣品表 執(zhí)行運(yùn)行程序 DNA分析儀將自動運(yùn)行 并保存 電泳原始數(shù)據(jù) NY T 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)讀取 每個SSR位點(diǎn)的等位變異參照擴(kuò)增片段大小命名 見附錄D 對于變性PAGE 將送檢樣品在某一 位點(diǎn)擴(kuò)增片段的遷移位置與對應(yīng)的參照品種進(jìn)行比較 確定送檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異 對于熒光毛 細(xì)管電泳 通過參照品種消除不同批次間或者不同型號DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差 使用片段分 析軟件讀取送檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異 純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記為X X 雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X Y 其中X Y分別為該位點(diǎn) 上的 個等位變異 小片段數(shù)據(jù)在前 大片段數(shù)據(jù)在后 缺失位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為 示例 樣品在某個位點(diǎn)上僅出現(xiàn) 個等位變異 為 bp 則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為 示例 樣品在某個位點(diǎn)上有 個等位變異 分別為 bp bp 則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為 數(shù)據(jù)比對 將送檢樣品每個位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)逐一比對 按照位點(diǎn)相同 差異 數(shù)據(jù)缺失 無法判定等情形 記 錄每個位點(diǎn)的結(jié)果 結(jié)果統(tǒng)計 統(tǒng)計比對結(jié)果為位點(diǎn)差異的情況 計算差異位點(diǎn)數(shù) 結(jié)果判定 判定規(guī)則 當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù) 判定為 不同 當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù) 判定為 疑同 當(dāng)品種間差異位 點(diǎn)數(shù) 但存在位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失或無法判定情形時 不做判定 結(jié)果表述 送檢樣品與對照樣品 或數(shù)據(jù)庫中品種 采用檢測平 臺 檢測位點(diǎn)數(shù)為 差異位點(diǎn)數(shù)為 判定為 當(dāng)存在位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失或無 法判定情形時 應(yīng)表述具體情況 示例 送檢樣品A與對照樣品B采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測平臺 檢測位點(diǎn)數(shù)為 差異位點(diǎn)數(shù)為 判定為 疑同 示例 送檢樣品A與對照樣品B采用熒光毛細(xì)管電泳檢測平臺 檢測位點(diǎn)數(shù)為 差異位點(diǎn)數(shù)為 送檢樣品在 WSULs 位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失 NY T 附 錄 A 規(guī)范性 主要儀器設(shè)備及試劑 A 主要儀器設(shè)備 A PCR擴(kuò)增儀 A 高壓電泳儀 最高電壓不低于 V 具有恒電壓 恒電流和恒功率功能 A 垂直電泳槽及配套的制膠附件 A 離心機(jī) A 水平搖床 A 膠片觀察燈 A 電子天平 感量為 g和 g A 微量移液器 規(guī)格分別為 L L L L L 連續(xù)可調(diào) A 磁力攪拌器 A 核酸濃度測定儀或超微量紫外分光光度計 A 微波爐 A 高壓滅菌鍋 A 酸度計 A 水浴鍋 A 低溫冰箱 A 制冰機(jī) A 凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀 A DNA分析儀 基于毛細(xì)管電泳 有片段分析功能和數(shù)據(jù)分析軟件 最低區(qū)分力 bp A 其他相關(guān)儀器和設(shè)備 A 主要試劑 除非另有說明 在分析中均使用分析純試劑 A 十六烷基三甲基溴化銨 CTAB C H CH NBr CAS號 A 三氯甲烷 CHCl CAS號 A 異戊醇 C H O CAS號 A 異丙醇 CH CHOH CAS號 A 乙二胺四乙酸二鈉 EDTA Na C H N Na O CAS號 A 三羥甲基氨基甲烷 Tris C H NO CAS號 A 濃鹽酸 HCl CAS號 A 氫氧化鈉 NaOH CAS號 A PCR緩沖液 含Mg mmol L A 種脫氧核糖核苷酸 dATP dTTP dGTP dCTP A 氯化鈉 NaCl CAS號 NY T A TaqDNA聚合酶 Taq酶 CAS號 A DNAMarker DNA片段分布范圍在 bp bp A 甲酰胺 CH NO CAS號 A 溴酚藍(lán) C H Br O S CAS號 A 二甲苯青 C H N NaO S CAS號 A 甲叉雙丙烯酰胺 H C CHCONH CH CAS號 A 丙烯酰胺 C H NO CAS號 A 硼酸 H BO CAS號 A 尿素 CH N O CAS號 A 親和硅烷 A 剝離硅烷 A 無水乙醇 C H O CAS號 A 四甲基乙二胺 TEMED C H N CAS號 A 過硫酸銨 APS NH S O CAS號 A 冰醋酸 CH COOH CAS號 A 硝酸銀 AgNO CAS號 A 甲醛 HCHO CAS號 A DNA分析儀用丙烯酰胺膠液 A DNA分析儀用分子量內(nèi)標(biāo) A DNA分析儀用電泳緩沖液 A DNA分析儀用光譜校準(zhǔn)基質(zhì) NY T 附 錄 B 規(guī)范性 溶液配制 試劑配制用水需符合GB T 的要求 B DNA提取溶液的配制 B mol LEDTA溶液 稱取 gNa EDTA H O 溶于 mL水中 充分?jǐn)嚢枞芙?加NaOH調(diào)pH至 加水定 容至 mL 高壓滅菌 min B mol LHCl溶液 量取 mL濃鹽酸 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 加水定容至 mL B mol LNaOH溶液 稱取 gNaOH 溶于 mL水中 充分?jǐn)嚢枞芙?加水定容至 mL B mol LTris HCl溶液 稱取 gTris堿 溶于 mL水中 充分?jǐn)嚢枞芙?加HCl調(diào)pH至 加水定容至 mL 高壓滅菌 min B CTAB提取液 稱取 gCTAB gNaCl置于 mL燒杯中 量取 mL mol LTris HCl溶液和 mL mol LEDTA溶液倒入燒杯中 加 mL水 充分?jǐn)嚢枞芙?加水定容至 mL 高壓滅菌 min B TE緩沖液 量取 mL mol LTris HCl溶液和 mL mol LEDTA溶液 加水定容至 mL 高壓 滅菌 min 保存 B PCR擴(kuò)增試劑的配制 B dNTP溶液 分別配制dATP dTTP dCTP dGTP終濃度為 mmol L的儲存液 各取 L混合 加 L TE緩沖液定容 配制成每種脫氧核糖核苷酸終濃度為 mmol L的工作液 高壓滅菌 min 保存 B SSR引物溶液 開蓋前瞬時離心 s 按照說明書加TE緩沖液分別配制正向引物和反向引物終濃度為 mol L 的儲存液 取 L儲存液 加 LTE緩沖液配制成終濃度 mol L的工作液 B 變性PAGE試劑的配制 B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 PAGE膠溶液 稱取 g丙烯酰胺和 g甲叉雙丙烯酰胺 溶于 mL水中 充分?jǐn)嚢枞芙?加水定容至 mL 置于棕色瓶中 儲存 B 親和硅烷緩沖液 分別量取 mL無水乙醇和 L冰醋酸 混勻 NY T B 親和硅烷工作液 分別量取 mL親和硅烷緩沖液和 L親和硅烷原液 混勻 B 剝離硅烷工作液 分別量取 mL氯仿溶液和 mL二甲基二氯硅烷溶液 混勻 B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 的APS溶液 稱取 g過硫酸銨 溶于 mL去離子水中 混勻 于 保存 不超過 d B TBE緩沖液 稱取Tris g 硼酸 g 溶于 mL水中 加入 mLEDTA溶液 mol L pH 定 容至 mL B TBE緩沖液 量取 mL TBE緩沖液 加水定容至 mL 混勻 B 加樣緩沖液 分別稱取 g溴酚藍(lán)和 g二甲苯青 加入 mL去離子甲酰胺和 mLEDTA溶液 mol L pH 攪拌溶解 B 銀染溶液的配制 B 固定液 量取 mL冰醋酸 加水定容至 mL B 染色液 稱取 g硝酸銀 加水定容至 mL B 顯影液 稱取 g氫氧化鈉 溶于 mL水中 用前加 mL甲醛 NY T 附 錄 C 規(guī)范性 引物名單及序列 引物名單及序列見表C 表C 引物名單及序列 引物 編號引物名稱 參考 文獻(xiàn) 所在 染色體上游引物序列 下游引物序列 WJ WSULs Chr GGACTTCACTAGTCGACGACATCGCTTGTCTTTCCAACCCAAAAG WJ WSULs Chr ACCGCTCTCACTCTGAGCACACCAGTTTGTGCTAGCGTTTCACCA WJ LSE Chr CTAGTTCTTCTGCTGCTAGGGATAGGATCGGATCGGATTG WJ KSL Chr GGTCTCTTTCCTCTGCCCTGTCGCGTTCTGAAGTAGCCAT WJ LSE Chr CCTCCATAACCAAAACCTCAACTTCTTTCGACATGCTTCT WJ SSR Chr GTTGTCTCGTCTCGACCAAAGCGTTCTGAAGTAGCCATGG WJ WSULs Chr TTTCTCGCTTTCTCTCCTTTCCCAAATCTCCACCCCCAAATAGG WJ KSL Chr CGGGGAGCATTTAGTGTGTGAATTTGGGGTCCGATTTGAG WJ LSE Chr CCGAAAACAGCCTTGCATCTGTATTGTAGCTGACGGTGGC WJ LSSA Chr TTCATCTCTCTCCTCCTTCAGCATCCCCATTGTCCTCCC WJ Li Chr TTTACCTCCCACCACACACACCGGCGATTCCATTATTGAT WJ LSE Chr TTGATACCTCCGCCATCCTCAGCACAGAAAACACACACACA WJ KSL Chr CTTCACCTCCGGAATCCTGTGAGGCACGACTGCCATTTAG WJ KSL Chr CGCAGAAAAGGGATCAGACATCAGAGACACTGCAAAAGGGA WJ SH Chr GCAAGCTAAAGGGCTTTTTGTCAGCCTGGGAATATTTACTCTGA WJ WSULs Chr GAAGGTGGTGGGTTGCTGTCTGGGCAATTGCAGATTGAGA WJ SSR Chr CAGATCAAGCGGGTAACTAATATCAAGACCCTAAGCGAAC WJ LSSA Chr AGAACAACGGTAGCTTGTTAAATTGATCGTCGGTTAATCTTCGTCG WJ LSSA Chr TTGTACCCAGTTGTCCAAACAGCAGATTGTTGCAGATTTCTTCG WJ SML Chr GTGATTGCATGCCAAATGAATTAGTAGCCCGCATGCTTTT WJ SML Chr TTGAGGAGGGCATTTACGTCGAGGCGTATCTCCAAGGTGT WJ LSE Chr TGTCCACAGATCAGCGATGACTGGACAGTCGGGATCAGAA 注 表中 對引物主要參考文獻(xiàn) HongJH OliyaBK PatellaA RiarDS SimkoI WangS ZhangGW ZhouH NY T 附 錄 D 資料性 引物相關(guān)信息 引物相關(guān)信息見表D 表D 引物相關(guān)信息 引物編號引物名稱熒光標(biāo)記等位變異范圍 bp主要等位變異 bp參照品種 WJ WSULs TAMRA 火棍筍 R 香優(yōu)九號 N 紅萵筍 S 紅萵筍 KNV 耐寒二白皮 尖葉萵筍 青皮臭 L KAY WJ WSULs HEX KNV N 紅福 火棍筍 紅萵筍 耐寒二白皮 青皮臭 香優(yōu)九號 N 紫葉萵筍 L 白皮筍 S KAY KNV WJ LSE TAMRA 耐寒二白皮 WJ LSE TAMRA 紅萵筍 火棍筍 青皮臭 紅福 紫葉萵筍 KAY KNV N KNV KNV NY T 表D 續(xù) 引物編號引物名稱熒光標(biāo)記等位變異范圍 bp主要等位變異 bp參照品種 WJ KSL FAM N N 紅福 紅萵筍 光葉萵苣 青皮臭 火棍筍 滬優(yōu)仕 尖葉萵筍 L 醬筍 WJ LSE FAM N 白皮筍 L N 滬優(yōu)仕 B 火棍筍 青皮臭 紅萵筍 L R WJ SSR TAMRA N 紅福 紅萵筍 光葉萵苣 青皮臭 火棍筍 WJ SSR TAMRA N KAY L KNV WJ WSULs ROX KNV L 紫葉萵筍 R L 青皮臭 火棍筍 耐寒二白皮 香優(yōu)九號 紅福 N KNV NY T 表D 續(xù) 引物編號引物名稱熒光標(biāo)記等位變異范圍 bp主要等位變異 bp參照品種 WJ KSL ROX 火棍筍 L B 青皮臭 KNV 紅福 R SY WJ LSE TAMRA KNV S KAY R L B 灰葉萵苣 青皮臭 火棍筍 WJ LSE TAMRA 紅萵筍 KNV 紅萵筍 滬優(yōu)仕 KNV 紅福 紫葉萵筍 KNV KNV 香優(yōu)九號 香優(yōu)九號 白皮香萵筍 白皮香萵筍 WJ LSSA FAM KNV KNV 圓葉白皮筍 布萊克柔絲 KNV N 四季白尖葉 N KNV KNV KNV KAY 尖葉萵筍 紅萵筍 紫葉筍 L 青皮臭 香優(yōu)九號 火棍筍 白皮筍 WJ LSSA FAM 耐寒二白皮 S NY T 表D 續(xù) 引物編號引物名稱熒光標(biāo)記等位變異范圍 bp主要等位變異 bp參照品種 WJ Li FAM N 青皮臭 N B WJ LSE ROX 紅萵筍 碧霄 R 滬優(yōu)仕 紫葉萵筍 青皮臭 火棍筍 KNV 光葉萵苣 香優(yōu)九號 SY KNV KAY B R LS KNV KNV 滬優(yōu)仕 N N N WJ KSL FAM B N N 紅福 滬優(yōu)仕 S 青皮臭 火棍筍 WJ KSL HEX S 紫葉萵筍 WJ KSL HEX 青皮臭 KNV N WJ SH TAMRA 滬優(yōu)仕 KNV 尖葉萵筍 L 滬優(yōu)仕 火棍筍 N L KAY N 紅萵筍 紫葉萵筍 青皮臭 NY T 表D 續(xù) 引物編號引物名稱熒光標(biāo)記等位變異范圍 bp主要等位變異 bp參照品種 WJ WSULs ROX 滬優(yōu)仕 KAY KNV M 紫葉筍 滬優(yōu)仕 火棍筍 白皮筍 尖葉萵筍 WJ SSR FAM N 尖葉萵筍 紫葉筍 S 紅萵筍 N N 碧霄 WJ LSSA ROX KAY N N KAY 滬優(yōu)仕 WJ LSSA ROX KNV 紅福 青皮臭 滬優(yōu)仕 KNV 紫葉萵筍 M N L S WJ LSSA HEX N KNV R S 青皮臭 N 尖葉萵筍 S 火棍筍 醬筍 白皮香萵筍 滬優(yōu)仕 KNV 光葉萵苣 紫葉筍 KNV L L NY T 表D 續(xù) 引物編號引物名稱熒光標(biāo)記等位變異范圍 bp主要等位變異 bp參照品種 WJ SML FAM KNV 青皮臭 N 灰葉萵苣 M 碧霄 滬優(yōu)仕 紅萵筍 N 火棍筍 WJ SML FAM 耐寒二白皮 紅福 WJ SML FAM 滬優(yōu)仕 紅福 KNV 滬優(yōu)仕 S 尖葉萵筍 R WJ LSE TAMRA 綠葉鯽瓜筍 KNV KNV 綠葉鯽瓜筍 紫葉萵筍 N N R S SY KNV KNV 注 附錄D中采用的熒光標(biāo)記僅為示例 采用其他熒光標(biāo)記類型時 需要用參照品種校正數(shù)據(jù) 注 對于附錄D中未包括的等位變異 應(yīng)按本文件方法 確定其大小和相應(yīng)參照品種 注 附錄D中所列參照品種僅為示例 與參照品種具有相同等位變異的其他品種也可用作該等位變異的參照品種 注 品種右上角的編號 保藏編號為V F 保藏編號為V F NY T 附 錄 E 資料性 參照品種相關(guān)信息 參照品種相關(guān)信息見表E 表E 參照品種相關(guān)信息 編號品種名稱 代號品種來源保藏編號編號品種名稱 代號品種來源保藏編號 LS NCGBXIN SY BAAFS KAY NCGBXIN SY BAAFS 耐寒二白皮NCGBXIN L BAAFS 碧霄NCGBXIN S BAAFS 布萊克柔絲NCGBXIN L BAAFS 四季白尖葉NCGBXIN L BAAFS 火棍筍IVFCAASV F N BAAFS 紅萵筍IVFCAASV F M BAAFS 紅萵筍IVFCAASV F N BAAFS 尖葉萵筍IVFCAASV F N BAAFS 青皮臭IVFCAASV F N BAAFS 綠葉鯽瓜筍IVFCAASV F L BAAFS 紫葉萵筍IVFCAASV F N BAAFS 紫葉筍IVFCAASV F M BAAFS 醬筍IVFCAASV F N BAAFS 白皮筍IVFCAASV F KNV SAGC 白皮香萵筍IVFCAASV F KNV SAGC 光葉萵苣IVFCAASV F KNV SAGC 灰葉萵苣IVFCAASV F KNV SAGC 圓葉白皮筍IVFCAASV F KNV SAGC 香優(yōu)九號SSCNPVTMARA KNV SAGC 紅福SSCNPVTMARA KNV SAGC 滬優(yōu)仕SSCNPVTMARA KNV SAGC B BAAFS KNV SAGC R BAAFS KNV SAGC L BAAFS KNV SAGC R BAAFS KNV SAGC S BAAFS 注 NCGB為國家作物種質(zhì)庫 IVFCAAS為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 SSCNPVTMARA為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測 試 上海 分中心 BAAFS為北京市農(nóng)林科學(xué)院 SAGC為上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心