doi 10 16473 j cnki xblykx1972 2025 01 011 生防菌株L2 2的分離鑒定及其對(duì) 藍(lán)莓灰霉病的防治效果研究 楊威平 顏倩 侯瑞 貴州大學(xué) 林學(xué)院 貴州 貴陽(yáng) 550025 摘要 為明確生防菌株L2 2對(duì)藍(lán)莓灰霉病的防治機(jī)理 根據(jù)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)對(duì)菌株L2 2進(jìn)行鑒定 利用平 板對(duì)峙法測(cè)定其對(duì)藍(lán)莓灰霉病致病菌灰葡萄孢菌HM4 1菌絲和生長(zhǎng)的抑制效果 同時(shí) 通過(guò)盆栽試驗(yàn)測(cè)定菌株 L2 2對(duì)藍(lán)莓灰霉病的防治效果和對(duì)藍(lán)莓相關(guān)防御酶活性的影響 并分析藍(lán)莓葉際微生物群落組成變化 結(jié)果顯示 1 菌株L2 2為蘇云金芽孢桿菌 菌株L2 2及其發(fā)酵液對(duì)藍(lán)莓灰霉病原菌抑制率分別為72 01 41 56 2 菌株L2 2回接藍(lán)莓盆栽苗處理中對(duì)藍(lán)莓灰霉病預(yù)防和治療效果達(dá)75 55 69 58 3 植物防御酶SOD POD CAT PPO PAL活性出現(xiàn)不同程度提高 出現(xiàn)的最高提升分別為142 04 199 35 428 85 1 318 74 127 33 4 葉際微生物群落分析中 菌株L2 2處理的盆栽苗芽孢桿菌屬相對(duì)豐度提高了52 53 可得結(jié)論 菌株L2 2能夠有效降低藍(lán)莓灰霉病的發(fā)生 研究結(jié)果能夠?yàn)樗{(lán)莓灰霉病生物防治提供一定的理論依據(jù) 關(guān)鍵詞 藍(lán)莓灰霉病 蘇云金芽孢桿菌 生物防治 防御酶活性 葉際微生物 中圖分類號(hào) S 763 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1672 8246 2025 01 0085 08 Isolation and Identification of Biocontrol Bacterium L2 2 and Its Control Effect on Blueberry Gray Mold YANG Weiping YAN Qian HOU Rui College of Forestry Guizhou University Guiyang Guizhou 550025 P R China Abstract To clarify the control mechanism of the biocontrol strain L2 2 against blueberry gray mold the strain was identified using morphological and molecular biology methods The antagonistic effect of strain L2 2 against the gray mold pathogen Botrytis cinerea HM4 1 was assessed using the dual culture plate method Additionally pot experi ments were conducted to evaluate the efficacy of strain L2 2 in controlling blueberry gray mold and its impact on re lated defense enzyme activities in blueberries as well as to analyze the changes in the leaf associated microbial com munity composition The results indicated that strain L2 2 is B thuringiensis The inhibition rates of strain L2 2 and its fermentation broth against the gray mold pathogen were 72 01 and 41 56 respectively The treatment of potted blueberry seedlings with strain L2 2 achieved prevention and treatment efficacy rates of 75 55 and 69 58 against gray mold The activities of plant defense enzymes SOD POD CAT PPO and PAL increased to varying degrees with the highest increases of 142 04 199 35 428 85 1 318 74 and 127 33 respectively In the analysis of the leaf associated microbiota the relative abundance of Bacillus species in potted seedlings treated with strain L2 2 in creased by 52 53 In summary strain L2 2 effectively suppresses the occurrence of blueberry gray mold and the re search findings provide a theoretical basis for the biological control of blueberry gray mold 第54卷 1期 2025年2月 西 部 林 業(yè) 科 學(xué)Journal of West China Forestry Science Vol 54 No 1 Feb 2025 收稿日期 2024 10 29 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 32260651 貴州省基礎(chǔ)研究 自然科學(xué) 項(xiàng)目 黔科合基礎(chǔ) ZK 2023 一般094 第一作者簡(jiǎn)介 楊威平 1999 男 碩士研究生 主要從事植物病理研究 E mail 401546368 qq com 通信作者簡(jiǎn)介 侯瑞 1988 女 副教授 主要從事林木病害鑒定和綠色防控方面的研究 E mail jiayouhourui123 163 com Key words blueberry gray mold Bacillus thuringiensis biological control defense enzyme activity leaf asso ciated microbiota 藍(lán)莓為淺根系多年生低灌木 隸屬于杜鵑花科 Ericaceae 越橘屬 Vaccinium spp 1 2 因富 含營(yíng)養(yǎng)而被廣泛栽培 其酚類活性物質(zhì)花色苷具有 保護(hù)心血管 減輕氧化應(yīng)激反應(yīng) 調(diào)節(jié)腸道菌群 改善視力多種功能 3 4 中國(guó)于20世紀(jì)80年代對(duì) 藍(lán)莓進(jìn)行引進(jìn)栽培 2022年中國(guó)藍(lán)莓總產(chǎn)量與栽 培總面積已達(dá)到世界第一 5 貴州省以貴陽(yáng) 麻 江 息烽 鳳崗等地為藍(lán)莓主栽區(qū) 兔眼 高叢等 藍(lán)莓品種種植面積達(dá)15 200 hm2 其中麻江縣規(guī)模 為全國(guó)第一 6 7 藍(lán)莓灰霉病 blueberry gray mold 是由世界 分布 寄主范圍廣泛的兼性寄生菌灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 侵染引起的病害 該病發(fā)病快 范圍廣而造成產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失 對(duì)藍(lán)莓灰霉病的防治 主要以化學(xué)防治為主 生物與生態(tài)防治為輔 由于 病原菌對(duì)農(nóng)藥的抗性 其難以完全清除土壤中的病 原菌 使得農(nóng)藥效果持續(xù)性降低 而生物菌劑不僅 抑制病原菌生長(zhǎng)還避免環(huán)境污染 使其成為控制植 物病害的重要手段 8 12 生物防治是一種利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物 對(duì)農(nóng)作物病害進(jìn)行有效防治的技術(shù)與方法 具有無(wú) 污染 無(wú)殘留 作用譜廣等優(yōu)點(diǎn) 13 14 目前已發(fā)現(xiàn) 多種真菌能夠有效地預(yù)防和治療灰霉病 如淡紫擬 青霉 Paecilomyces lilacinus 盾殼霉 Coniothyri um minitans 和叢枝菌根真菌 Arbuscular Mycorrhi za 分別在對(duì)番茄 Solanum lycopersicum 人參 Panax ginseng 草莓 Fragaria ananassa 的灰 霉病防治中表現(xiàn)出顯著拮抗作用 而細(xì)菌中假單胞 菌屬 Pseudomonas sp 芽孢桿菌屬 Bacillus sp 對(duì)黃瓜 Cucumis sativus 馬鈴薯 Solanum tuberosum 灰霉病具有較好的防治效果 15 16 芽孢 桿菌防治植物病害的機(jī)理主要包括營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn) 競(jìng)爭(zhēng) 分泌抗菌物質(zhì) 溶菌和誘導(dǎo)植物抗病性 等 17 短小芽孢桿菌 B pumilus 菌株能分泌出 脂肽類物質(zhì) 其活性物質(zhì)能明顯抑制番茄灰霉病菌 絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā) 18 蘇云金芽孢桿菌UM96幾丁 質(zhì)酶在對(duì)灰霉病防治機(jī)制起到關(guān)鍵作用 含幾丁質(zhì) 酶活性的菌株能更好減少三葉草受到灰霉病菌的感 染 19 因此 本研究從藍(lán)莓根際土壤中分離篩選出一 株對(duì)藍(lán)莓灰霉病病原菌具有較好抑制作用的細(xì)菌菌 株L2 2 對(duì)菌株L2 2進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué) 鑒定 并探究其對(duì)藍(lán)莓灰霉病病菌抑菌效果 同 時(shí) 探究菌株L2 2回接至藍(lán)莓盆栽苗對(duì)藍(lán)莓灰霉 病的防治效果以及對(duì)葉際微生物的影響 以期為防 治藍(lán)莓灰霉病提供微生物資源和理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 1 1 1 供試菌株 藍(lán)莓灰霉病病原菌灰葡萄孢菌HM4 1菌株 細(xì)菌L2 2菌株于2022年5月分離于藍(lán)莓植株 品種為 萊格西 根際土壤 貴州省麻江縣 藍(lán)莓栽培基地 107 36 26 E 26 31 40 N 海拔 864 32 m HM4 1 L2 2菌株現(xiàn)保存于貴州大 學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)學(xué)學(xué)科 1 1 2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 PDA 200 g馬鈴薯 20 g葡萄糖 20 g瓊脂 1 000 mL蒸餾水 PDB培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基不加瓊脂 LB固體培養(yǎng)基 10 g胰蛋白胨 5 g酵母提取 物 10 g氯化鈉 20 g瓊脂 1 000 mL蒸餾水 LB液體培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基不加瓊脂 培養(yǎng)基pH值自然 于121 條件下高溫高壓 滅菌30 min 1 1 3 供試植株 1 a生健康 萊格西 藍(lán)莓盆栽植株 1 2 研究方法 1 2 1 菌株L2 2形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定 參照 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 和 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè) 對(duì)接種到LB平板7 d后 的L2 2菌株菌落顏色 大小 生長(zhǎng)速度 形狀和 邊緣特征等觀察 并拍照記錄 20 21 利用電鏡對(duì) 菌形態(tài)特征進(jìn)行觀察 22 分子生物學(xué)鑒定 提取L2 2菌株DNA送至 重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司 以細(xì)菌16S rD NA通用引物27F 1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增 結(jié)果在 BLAST多序列比對(duì)并于MEGA 7 0軟件以鄰接法 Neighbor Joining NJ 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 23 1 2 2 菌株L2 2對(duì)病原菌HM4 1拮抗作用 采用平板對(duì)峙法觀察菌株L2 2對(duì)病原菌HM4 1 68西 部 林 業(yè) 科 學(xué) 2025年 在PDA平板生長(zhǎng)的抑制率 對(duì)照組病原菌基本長(zhǎng) 滿培養(yǎng)皿后分別測(cè)量對(duì)照組與對(duì)峙組菌落半徑 計(jì) 算抑菌率 每組處理重復(fù)3次 24 菌株L2 2發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制性 參考 Stinson et al 方法 每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù) 測(cè)量各 處理組HM4 1菌落直徑 并利用以下公式計(jì)算其 對(duì)病原菌抑菌率 25 抑菌率 對(duì)照組病原菌半徑 對(duì)峙組的病原 菌趨向半徑 對(duì)照組病原菌半徑 100 菌株L2 2對(duì)病原菌孢子萌發(fā)影響 細(xì)菌接種 至LB在搖床培養(yǎng)24 h 發(fā)酵液濃度設(shè)置為原液 稀釋10倍 50倍涂布40 L孢子懸浮液 18 h后 觀察孢子萌發(fā) 隨機(jī)觀察處理組各樣本孢子 約 200個(gè) 計(jì)算萌發(fā)率 每組處理6個(gè)樣本 進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn) 26 孢子萌發(fā)率 萌發(fā)的孢子 總孢子數(shù) 100 孢子萌發(fā)抑制率 對(duì)照孢子萌發(fā)率 處理孢 子萌發(fā)率 對(duì)照孢子萌發(fā)率 100 1 2 3 回接菌株L2 2對(duì)藍(lán)莓灰霉病盆栽苗的防 治效果 選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的藍(lán)莓幼苗 以單接清水 生防菌發(fā)酵液 病原菌孢子懸浮液處理為對(duì)照 生 防菌與病原菌順?lè)错樞蚬步犹幚?其中接種間隔為 24 h 接種后于20 25 保濕處理48 h 置于室溫 15 d 調(diào)查發(fā)病情況并計(jì)算其病情指數(shù)和相對(duì)防效 每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù) 每個(gè)重復(fù)15株苗 27 相對(duì)防效 對(duì)照組病情指數(shù) 處理組病 情指數(shù) 對(duì)照組病情指數(shù) 100 1 2 4 回接菌株L2 2對(duì)藍(lán)莓盆栽苗生理指標(biāo)影響 各處理組回接藍(lán)莓幼苗24 h后 稱取葉片0 5 g 將葉片切成碎片后在預(yù)冷研缽中進(jìn)行研磨 加 入1 mL預(yù)冷磷酸緩沖液后冰浴條件下快速研磨成 勻漿 立即移至10 mL容量離心管中加緩沖液定容 至5 mL 離心機(jī)溫度為4 以10 000 r min 1離 心20 min 取上清液移入新的離心管 對(duì)其相關(guān)防 御酶超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase SOD 過(guò)氧化氫酶 Catalase CAT 苯丙氨酸 解胺酶 Phenylalanine ammonia lyase PAL 多 酚氧化酶 Polyphenol oxidase PPO 過(guò)氧化物 酶 Peroxidase POD 按照索萊寶 北京索萊寶 科技有限公司 試劑盒操作方法進(jìn)行酶活測(cè)定 1 2 5 菌株L2 2對(duì)藍(lán)莓盆栽苗葉際微生物的影響 對(duì)1 2 3及其1 2 4具有較好防治效果及生理 指標(biāo)提高更明顯處理組進(jìn)行葉際微生物分析 高通 量測(cè)序分析藍(lán)莓葉際真菌和細(xì)菌 基因擴(kuò)增使用通 用引物ITS1F ITS2R 338F 806R分別操作 最后 在Illumina MiSeq PE 300平臺(tái)對(duì)所采集樣品測(cè)序 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司 中國(guó)上海 測(cè)序結(jié)束以后于該公司分析平臺(tái)上進(jìn)行藍(lán)莓葉際微 生物群落的數(shù)據(jù)分析 1 3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行分析 運(yùn)用origin 2022繪制柱狀圖 使用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 2 結(jié)果與分析 2 1 菌株L2 2形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定 菌株L2 2在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后對(duì)菌落進(jìn)行 觀察 菌落生長(zhǎng)較快 圓形 邊緣整齊光滑 隆 起 乳黃色 蠟狀光澤 不透明 粘稠 圖1a 電鏡下觀察 菌株L2 2分布較為均勻 外觀致密 且光滑 整體桿狀 兩端鈍圓 無(wú)鞭毛結(jié)構(gòu) 細(xì)菌 與細(xì)菌不粘連 圖1b 將菌株L2 2的基因序列 提交到NCBI獲得登錄號(hào)PP474256 并進(jìn)行 BLAST比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 圖1c 結(jié)合形態(tài) 學(xué)特征 初步鑒定菌株L2 2為蘇云金芽孢桿菌 Bacillus thuringiensis 圖1 菌株L2 2平板電鏡圖及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 注 a為菌株L2 2培養(yǎng)7 d平板菌落正面 b為菌株L2 2培養(yǎng)7 d 在電鏡下的菌體形態(tài) 標(biāo)尺 1 m c為基于菌株L2 2 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig 1 Strain L2 2 plate electron microscope and phylogenetic tree 78 第1期 楊威平等 生防菌株L2 2的分離鑒定及其對(duì)藍(lán)莓灰霉病的防治效果研究 2 2 菌株L2 2對(duì)病原菌HM4 1的拮抗作用 將菌株L2 2與藍(lán)莓灰霉病病原菌HM4 1分 別進(jìn)行平板對(duì)峙和生防發(fā)酵液培養(yǎng) 將處理組和對(duì) 照組病原菌菌落直徑進(jìn)行比對(duì) 平板對(duì)峙中 菌株 L2 2對(duì)HM4 1的抑制率為72 01 圖2 a1 a2 菌株L2 2發(fā)酵液培養(yǎng)基對(duì)病原菌抑制率為 41 56 表明菌株L2 2對(duì)灰霉病病原菌HM4 1 具有顯著抑制能力 P 0 05 同時(shí) 對(duì)接種于不 同濃度發(fā)酵液平板的HM4 1進(jìn)行孢子數(shù)量統(tǒng)計(jì) 原液抑制率最高 為67 69 50倍稀釋濃度抑制 率最低 為31 00 圖2 c 結(jié)果表明菌株L2 2對(duì)病原菌HM4 1的菌絲生長(zhǎng)及其孢子萌發(fā)具有 顯著抑制作用 P 0 05 圖2 菌株L2 2對(duì)灰霉病HM4 1的抑菌測(cè)試及菌液對(duì)其抑菌效果 注 a1為灰霉病病原真菌HM4 1在PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)平板圖 a2為同時(shí)接種菌株L2 2與病原菌HM4 1平板對(duì)峙圖 b1為灰霉病病原真菌 HM4 1在PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)平板圖 b2為灰霉病病原真菌HM4 1在菌株L2 2發(fā)酵液平板生長(zhǎng)圖 c為病原菌HM4 1孢子在菌株L2 2不 同發(fā)酵液濃度下萌發(fā)率 原液為未經(jīng)無(wú)菌水稀釋孢子萌發(fā)率 10 為發(fā)酵液稀釋10倍孢子萌發(fā)率 50 為發(fā)酵液稀釋50倍孢子萌發(fā)率 CK 為未經(jīng)發(fā)酵液處理孢子萌發(fā)率 星號(hào) 代表各處理間經(jīng)過(guò)多重比較在水平下差異顯著 P 0 05 Fig 2 Bacteriostatic test of strain L2 2 against HM4 1 gray mold and bacteriostatic effect of bacterial solution on HM4 1 2 3 L2 2對(duì)藍(lán)莓灰霉病盆栽苗的防治效果及相關(guān) 防御酶活性測(cè)定 所有處理組在相同的環(huán)境下培養(yǎng)15 d后 對(duì) 植株病情指數(shù)進(jìn)行調(diào)查 與對(duì)照組相比 接種L2 2菌株的藍(lán)莓苗病情指數(shù)均顯著下降 病情指數(shù)分 別為8 61 10 71 防治效果分別為75 55 69 58 表明L2 2可以顯著提高藍(lán)莓對(duì)灰霉病的 抗性 圖3 表1 對(duì)各組藍(lán)莓幼苗進(jìn)行酶活測(cè)定 結(jié)果顯示 表1 與CK組相比 單接菌株L2 2可以顯著 提高SOD PPO POD活性 SOD PPO POD CAT分別提升了47 07 1 318 74 199 35 49 58 單接HM4 1后 CAT活性顯著增加 PAL CAT活性分別提升了55 59 428 85 在L2 2 HM4 1的處理組中 SOD PPO PAL 的酶活性顯著上升 SOD PPO PAL POD CAT 的酶活性分別提升了142 04 181 66 114 49 7 09 2 96 在HM4 1 L2 2的處理 中SOD PAL POD酶活性顯著上升 SOD PPO PAL POD CAT酶活性分別提升了89 92 105 29 127 33 31 61 33 86 2 4 藍(lán)莓葉際微生物群落結(jié)構(gòu)分析 綜合上述研究結(jié)果 L2 2對(duì)藍(lán)莓灰霉病的預(yù) 防處理 L2 2 HM4 1 較治療處理 HM4 1 L2 2 效果更為顯著 因此 選取預(yù)防處理組進(jìn)行 后續(xù)研究 對(duì)CK L2 2 HM4 1 L2 2 HM4 1 處理組進(jìn)行葉際微生物組成測(cè)定 Venn圖分析結(jié) 果表明 CK的細(xì)菌與真菌群落OTU總數(shù)量高于各 接菌處理組 其中CK L2 2 HM4 1 L2 2 HM4 1藍(lán)莓葉際真菌群落特有OTU數(shù)目分別為 139 112 26 34 細(xì)菌群落特有OTU數(shù)目分別 為77 57 44 32 圖4 88西 部 林 業(yè) 科 學(xué) 2025年 圖3 藍(lán)莓盆栽苗接種菌株L2 2對(duì)灰霉病的預(yù)防及其治療效果 注 a 無(wú)菌水處理 1 整體圖 2 局部細(xì)節(jié)圖 下同 b 單接菌株L2 2 c 單接灰霉病病原菌菌株HM4 1 d 接種菌株L2 2發(fā)酵液24 h后接種菌株HM4 1孢子懸浮液 e 接種菌株HM4 1孢子懸浮液24 h后接種菌株L2 2發(fā)酵液 Fig 3 Prevention and control effect of inoculated strain L2 2 on gray mold in potted blueberry seedlings 表1 菌株L2 2對(duì)藍(lán)莓灰霉病的防治效果及其相關(guān)防御酶活性 Tab 1 Control effect of strain L2 2 against gray mold of blueberry and related defense enzyme activities 處理病情指數(shù)防治效果 SOD U g 1 PPO U g 1 PAL U g 1 POD U g 1 CAT U g 1 CK 107 47 3 92 d 14 94 1 04 c 36 23 6 35 c 184 27 5 18 c 27 35 4 11 b L2 2 158 06 29 49 c 211 96 14 00 a 33 37 3 58 c 551 62 49 10 a 40 91 3 96 b HM4 1 35 22 1 99 a 104 45 5 13 d 11 68 1 38 c 56 37 3 37 bc 168 81 16 64 c 144 64 8 15 a L2 2 HM4 1 8 61 0 35 b 75 55 0 98 a 260 12 6 30 a 42 08 8 23 b 77 71 10 83 ab 197 34 10 36 bc 28 16 1 65 b HM4 1 L2 2 10 71 0 17 b 69 58 0 47 b 204 11 7 77 b 30 67 4 17 bc 82 36 11 10 a 242 52 18 88 b 36 61 7 33 b 注 表中數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 不同小寫(xiě)字母表示P 0 05水平上的顯著性差異 圖4 藍(lán)莓盆栽苗葉際真菌和細(xì)菌OTUs分布與群落組成分析 注 a Venn圖 a 1為真菌Venn圖 a 2為細(xì)菌bar圖 b 群落柱狀圖 b 1為真菌Venn圖 b 2為細(xì)菌bar圖 Fig 4 Venn diagram of OTUs distribution of fungi and bacteria in the interphyllosphere of potted blueberry seedlings 98 第1期 楊威平等 生防菌株L2 2的分離鑒定及其對(duì)藍(lán)莓灰霉病的防治效果研究 群落柱狀圖中 各處理組葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌 的相對(duì)豐度與CK存在差異 在細(xì)菌屬水平 CK的 葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為假單胞菌屬6 91 菌株L2 2處 理組為芽孢桿菌屬53 08 HM4 1處理組為未分 類的腸桿菌屬85 09 L2 2 HM4 1處理組為未分 類的腸桿菌屬32 58 和芽孢桿菌屬29 63 圖4 b 2 在真菌屬水平 CK組葉際優(yōu)勢(shì)真菌屬為枝 孢菌屬Cladosporium 71 66 菌株L2 2處理組為 枝孢菌屬43 06 HM4 1處理組為葡萄孢屬 25 47 枝孢菌屬10 63 L2 2 HM4 1處理組 為葡萄孢屬58 53 枝孢菌屬24 08 和木霉屬 Trichoderma 4 40 圖4 b 1 3 討論與結(jié)論 3 1 討論 本研究通過(guò)對(duì)菌株L2 2的形態(tài)學(xué)特征及16S rRNA序列進(jìn)行鑒定 構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 將菌 株L2 2鑒定為蘇云金芽孢桿菌 芽孢桿菌具有易 繁殖 生長(zhǎng)快 適應(yīng)強(qiáng) 代謝物穩(wěn)定等特點(diǎn) 可以 防治馬鈴薯 辣椒 煙草等多種作物的灰霉病病 害 具有良好的防治效果 28 菌株L2 2在培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)速度較快 存活時(shí)間長(zhǎng) 與生防類芽孢桿菌 具有相似性 另有研究表明芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)肽類 的表面活性劑代謝物與堿性脂肪酶能顯著抑制柑橘 炭疽病原菌的生長(zhǎng) 29 在本研究中 菌株L2 2能 夠顯著抑制藍(lán)莓灰霉病病原菌生長(zhǎng) 且高濃度的發(fā) 酵液可以抑制病原菌的孢子萌發(fā) 表明菌株L2 2 對(duì)病原菌有明顯的抑制作用 藍(lán)莓灰霉病主要發(fā)生在花 果實(shí) 葉片 果柄 以及枝條等部位 在藍(lán)莓盆栽試驗(yàn)中 菌株L2 2 的預(yù)防與防治處理均顯著降低藍(lán)莓灰霉病病情指 數(shù) 在芽孢桿菌對(duì)番茄灰霉病的防治研究中 也具 有相似效果 30 芽孢桿菌還能誘導(dǎo)寄主防御酶活 性上升從而提高寄主抗性 31 32 SOD POD CAT 等抗氧化酶可清除植物細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫和脂質(zhì)自由 基 減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成 其間接反映植物抗 逆能力 單接L2 2菌株的藍(lán)莓PPO POD酶活活 性提升了1 318 74 199 35 L2 2 HM4 1 HM4 1 HM4 1 L2 2的3個(gè)處理組分別對(duì)應(yīng)SOD CAT PAL酶活性提升了142 04 428 85 127 33 西瓜 Citrullus lanatus 上黃瓜綠斑駁 花葉病毒病害防治中提前施用解淀粉芽孢桿菌 B amyloliquefaciens 宿主生理指標(biāo)出現(xiàn)顯著提 高 生防菌L2 2的接種使得藍(lán)莓防御酶活性提 高 有利于藍(lán)莓的生長(zhǎng)和對(duì)不利環(huán)境的抗性 33 34 葉際中的微生物群落來(lái)源本體植株 環(huán)境 鄰 近的微生物群落 微生物之間共生 競(jìng)爭(zhēng) 捕食 寄生 抑制組成最適合的微生物組合 35 36 在藍(lán) 莓葉際微生物細(xì)菌屬水平上 CK假單胞菌屬為優(yōu) 勢(shì)屬 接種L2 2改變?nèi)~際微生物群落構(gòu)成 芽孢 桿菌屬成為主要優(yōu)勢(shì)屬 芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶 蛋白質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物 從而抑制病原菌生長(zhǎng) 爭(zhēng) 奪競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 并刺激宿主植物的防御反 應(yīng) 芽孢桿菌屬的相對(duì)豐富度提高有利于植株的生 長(zhǎng)發(fā)育 37 在HM4 1的處理組中未分類的腸桿菌 屬相對(duì)豐度達(dá)到最高 腸桿菌科能夠引起多種植物 病害 接種HM4 1使得腸桿菌屬在藍(lán)莓葉片相對(duì) 豐度提升而不利于藍(lán)莓的生長(zhǎng) 在L2 2 HM4 1 處理組中未分類的腸桿菌屬相對(duì)豐度出現(xiàn)了明顯下 降 表明L2 2的接種能改善葉際微生物環(huán)境 構(gòu) 成有利于寄主生長(zhǎng)的群落 藍(lán)莓葉際在菌株L2 2 存在的情況下對(duì)于HM4 1所形成的群落產(chǎn)生拮抗 作用 有利于藍(lán)莓植株抵抗病原菌侵染 38 41 在 藍(lán)莓葉際微生物真菌屬水平中發(fā)現(xiàn) 灰葡萄孢屬在 單接生防菌L2 2中出現(xiàn)更高的豐度 且在L2 2 HM4 1處理組中其相對(duì)豐度達(dá)到最高 但單接病 原菌處理各優(yōu)勢(shì)菌屬之間豐度差異較小 有研究表 明真菌群落中優(yōu)勢(shì)類群有著更高的生態(tài)位重疊效 應(yīng) 而菌株L2 2與原始菌群存在更多的重疊使得 灰葡萄孢屬豐度上升 且有研究證實(shí) 在噴施生防 菌后發(fā)生OTU數(shù)量減少的情況 42 43 同時(shí) L2 2 HM4 1處理組可招募具有抑菌作用的木霉屬 44 生防菌L2 2與病原菌HM4 1的互作可以改變藍(lán) 莓葉際微生物的群落構(gòu)成 并使其相對(duì)豐度與均勻 度出現(xiàn)顯著變化 3 2 結(jié)論 本研究從藍(lán)莓根際土壤中分離并篩選出一株對(duì) 藍(lán)莓灰霉病病原菌具有較好抑制作用的細(xì)菌菌株 L2 2 采用16S rDNA測(cè)序與形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株 L2 2為蘇云金芽孢桿菌 菌株L2 2對(duì)藍(lán)莓灰霉 致病菌HM4 1的平板對(duì)峙抑制率為72 01 發(fā) 酵液對(duì)HM4 1的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制率為 41 56 67 69 菌株L2 2能夠顯著降低寄主 的灰霉病發(fā)病指數(shù) 回接藍(lán)莓盆栽苗中L2 2 HM4 1 HM4 1 L2 2處理組防效達(dá)到75 55 69 58 前者L2 2 HM4 1處理組SOD PPO 09西 部 林 業(yè) 科 學(xué) 2025年 PAL POD CAT的酶活活性分別提升了 142 04 181 66 114 49 7 09 2 96 后者HM4 1 L2 2處理組SOD PPO PAL POD CAT酶活活性分別提升了89 92 105 29 127 33 31 61 33 86 葉際微 生物組成分析中 接種菌株L2 2后芽孢桿菌屬豐 度上升 而芽孢桿菌數(shù)量的提高有利于寄主抵御灰 霉病病原菌的入侵 綜上所述 菌株L2 2具有較 好抑制灰霉病病原菌能力 能夠通過(guò)抑制病原菌生 長(zhǎng) 提高藍(lán)莓植株的抗病性和藍(lán)莓葉際微生物優(yōu)勢(shì) 微生物的富集程度來(lái)防治藍(lán)莓灰霉病 參考文獻(xiàn) 1 董克鋒 姜惠鐵 影響藍(lán)莓栽培成敗的關(guān)鍵因素分 析 J 北方園藝 2015 14 49 51 2 王宏恩 馮國(guó)紅 徐華東 等 基于可見(jiàn) 近紅外光譜 和深度森林的藍(lán)莓成熟度判別 J 光譜學(xué)與光譜分析 2024 44 11 3280 3286 3 李梓旋 郭佳婧 蘇東林 等 藍(lán)莓花色苷生理活性 提取純化及穩(wěn)態(tài)化研究進(jìn)展 J 中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2024 24 2 407 417 4 胡雅馨 李京 惠伯棣 藍(lán)莓果實(shí)中主要營(yíng)養(yǎng)及花青 素成分的研究 J 食品科學(xué) 2006 10 600 603 5 劉慶忠 崔冬冬 朱東姿 世界及中國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀 J 落葉果樹(shù) 2024 56 4 1 7 107 6 李思 尚曉靜 張富美 等 藍(lán)莓根部?jī)?nèi)生木霉分離 鑒定及其拮抗作用 J 核農(nóng)學(xué)報(bào) 2022 36 8 1569 1578 7 張?chǎng)┚?冷云星 張?jiān)姮?等 貴州省藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展 現(xiàn)狀及對(duì)策 J 農(nóng)技服務(wù) 2024 41 8 81 84 8 李興龍 李彥忠 土傳病害生物防治研究進(jìn)展 J 草業(yè)學(xué)報(bào) 2015 24 3 204 212 9 戴啟東 李廣旭 藍(lán)莓灰霉病病原鑒定和生物學(xué)特 性研究 J 中國(guó)果樹(shù) 2011 3 46 48 10 嚴(yán)雪瑞 傅俊范 于舒怡 等 遼寧樹(shù)莓灰霉病流行調(diào) 查及原因分析 J 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2009 31 5 672 674 11 陳宇飛 文景芝 李立軍 葡萄灰霉病研究進(jìn)展 J 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2006 37 5 693 699 12 KHAN A R MUSTAFA A HYDER S et al Bacillus spp as bioagents Uses and application for sustainable agriculture J Biology 2022 11 12 1763 1780 13 邱德文 我國(guó)植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策 略 J 植物保護(hù) 2010 36 4 15 18 35 14 徐杰 農(nóng)婉晴 張耀芳 等 Bacillus rugosus對(duì)香蕉 枯萎病的防治及促生效果 J OL 分子植物育種 2023 03 26 2024 04 25 https link cnki net urlid 46 1068 s 20231025 1308 006 15 龐礴 不同地區(qū)蛇足石杉內(nèi)生真菌多樣性及分離 純化和生物活性研究 D 杭州 浙江理工大學(xué) 2023 16 李長(zhǎng)印 硒聯(lián)合茉莉酸甲酯防治番茄灰霉病的微 生物學(xué)機(jī)制 D 武漢 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2022 17 陳志誼 芽孢桿菌類生物殺菌劑的研發(fā)與應(yīng)用 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2015 31 5 723 732 18 BOUCHARD ROCHETTE M MACHRAFI Y COSS US L et al Bacillus pumilus PTB180 and Bacillus subtilis PTB185 Production of lipopeptides antifungal activity and bio control ability against Botrytis cinerea J Biological Control 2022 170 104925 19 MART NEZ ABSAL N S ROJAS SOL S D HERN NDEZ LE N R et al Potential use and mode of action of the new strain Bacillus thuringiensis UM96 for the biological control of the grey mould phytopathogen Botrytis cinerea J Bio control Science and Technology 2014 24 12 1349 1362 20 東秀珠 蔡妙英 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) M 北 京 科學(xué)出版社 2001 21 相凱文 李丹丹 郭自春 等 一株高產(chǎn)吲哚乙酸促 生菌的篩選鑒定 條件優(yōu)化 應(yīng)用效果及其代謝途徑 J OL 微生物學(xué)通報(bào) 2024 11 22 2024 12 01 https doi org 10 13344 j microbiol china 240796 22 袁惠君 余詩(shī)曼 徐琰瑩 等 1株抗真菌貝萊斯芽 孢桿菌 Bacillus velezensis lut Y1的鑒定及抑菌活性研究 J 中國(guó)畜牧獸醫(yī) 2024 51 6 2354 2364 23 王芳 于璐 齊澤錚 等 大豆鐮刀菌根腐病拮抗菌 的篩選及生防效果 J 生物技術(shù)通報(bào) 2024 40 7 216 225 24 吳慧芳 蒙耀 石暉琴 等 一株馬鈴薯干腐病生防菌 的鑒定及其抑菌活性研究 J 植物保護(hù) 2024 50 3 111 120 25 STINSON M EZRA D HESS W et al An endophytic Gliocladium spp of Eucryphia cordifolia producing selective vola tile antimicrobial compounds J Plant Science 2003 165 4 913 922 26 LIU K W ZHOU X J FU M R Inhibiting effects of epsilon poly lysine PL on Pencillium digitatum and its in volved mechanism J Postharvest Biology and Technology 2017 123 94 101 27 張榮勝 王曉宇 羅楚平 等 解淀粉芽孢桿菌Lx 11產(chǎn)脂肽類物質(zhì)鑒定及表面活性素對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的 防治作用 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013 46 10 2014 2021 28 胡朋 申琳 范蓓 等 番茄灰霉病拮抗細(xì)菌Bacillus 1的篩選和鑒定 J 食品科學(xué) 2008 6 276 279 29 SIDOROVA T M ASATUROVA A M HOMYAK A I Biologically active metabolites of Bacillus subtilis and their role in the control of phytopathogenic microorganisms J Agric Biol 2018 53 1 29 37 30 張金奎 徐生軍 李繼平 等 生防細(xì)菌HMQ20YJ04 發(fā)酵條件優(yōu)化及其對(duì)番茄灰霉病的效果評(píng)價(jià) J 中國(guó)生物 防治學(xué)報(bào) 2023 39 6 1418 1433 下轉(zhuǎn)第111頁(yè) 19 第1期 楊威平等 生防菌株L2 2的分離鑒定及其對(duì)藍(lán)莓灰霉病的防治效果研究 Brittle Culm1 a COBRA like protein functions in cellulose as sembly through binding cellulose microfibrils J PLoS Genet ics 2013 9 e1003704 28 NIU E L FANG S SHANG X G et al Ectopic ex pression of GhCOBL9A a cotton glycosyl phosphatidyl inositol anchored protein encoding gene promotes cell elongation thick ening and increased plant biomass in transgenic Arabidopsis J Molecular Genetics and Genomics 2018 293 5 1191 1204 29 SUN A Q YU B ZHANG Q et al MYC2 Activated TRICHOME BIREFRINGENCE LIKE37 acetylates cell walls and enhances herbivore resistance J Plant Physiology 2020 184 2 1083 1096 30 石江濤 劉一星 聶玉哲 等 正常木與應(yīng)壓木木材 形成組織中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的減低那個(gè) J 北京林業(yè)大學(xué) 學(xué)報(bào) 2013 35 3 137 142 31 王潔華 盧孟柱 木本植物次生維管系統(tǒng)形態(tài)建成 的基因調(diào)控與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展 J 林業(yè)科學(xué) 2009 45 11 127 134 32 CAO L ZHANG S CAO J et al Nitrogen modifies wood composition in poplar seedlings by regulating carbon and nitrogen metabolism J 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