楊 柳 任春梅 陸 芳 等 江蘇葫蘆科作物上瓜類褪綠黃化病毒的發(fā)生及其分離物全基因組序列分析 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 江蘇葫蘆科作物上瓜類褪綠黃化病毒的發(fā)生 及其分離物全基因組序列分析 楊 柳 任春梅 陸 芳 繆 倩 程兆榜 季英華 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 江蘇南京 摘要 為了分析瓜類褪綠黃化病毒 在江蘇省葫蘆科作物上的分布情況 發(fā)生 趨勢以及變異情況 本研究對疑似感染 的葫蘆科樣本進行采集 覆蓋了江蘇省 個地區(qū)的 種常見葫蘆科作 物 通過 方法對病樣進行了分子鑒定 并對在泰州采集的黃瓜分離物 進行分段克隆與測序 拼接獲得 的全基因組序列后對其進行了序列比對和進化分析 檢測結(jié)果顯示 在建湖采集的西葫蘆樣本 泰州 興化和南京江寧地區(qū)采集的黃瓜樣本均有 感染 序列拼接與比對結(jié)果顯示 分離物 的 序 列與目前已經(jīng)公布的各個分離物基因組序列相似度在 以上 在進化樹上與山東西葫蘆分離物聚為一支 其 序列與各分離株的相似性為 以上 在進化上與廣東分離物聚為一支 本研究結(jié)果表明 可能由 多個途徑傳入江蘇 并已經(jīng)擴大蔓延到江蘇省多個地區(qū)和多種寄主上 對該病毒的監(jiān)測防控已逐漸擴大為葫蘆科作物 生產(chǎn)中亟待解決的突出問題之一 關(guān)鍵詞 瓜類褪綠黃化病毒 分布 分子鑒定 基因組 系統(tǒng)進化分析 中圖分類號 文獻標志碼 文章編號 收稿日期 基金項目 國家重點研發(fā)計劃 編號 江蘇省農(nóng)業(yè) 科技自主創(chuàng)新資金 編號 作者簡介 楊 柳 女 江蘇徐州人 博士 助理研究員 主要 從事蔬菜作物病毒病研究 通信作者 季英華 研究員 主要從事蔬菜病毒病研究 瓜類褪綠黃化病毒 屬于長形病毒科 毛形 病毒屬 它最早于 年在日本甜瓜 上被發(fā)現(xiàn) 隨后在許多國家都有報道 包括蘇丹 黎巴嫩 伊朗 希臘 土耳其 沙特阿拉伯 塞浦路 斯 以色列 美國 阿爾及利亞 西班牙 韓國和印度 等 年 于我國臺灣地區(qū)首次被發(fā) 現(xiàn) 而后在山東 北京 上海 河南 湖南 廣西 乃 至海南 新疆和貴州等省份逐漸被報道 并且其危 害地區(qū)還在不斷擴大 是煙粉虱以半持久方式進行傳播的 在 自然情況下主要感染葫蘆科作物 目前已經(jīng)報道的 以甜瓜 西瓜 黃瓜 南瓜 西葫蘆等常見作物居多 但室內(nèi)試驗顯示該病毒能夠侵染 種葫蘆科作 物 此外 還可以侵染本氏煙 甜菜 紫花 苜蓿 曼陀羅等植物 等明確了 種雜草 為 的寄主 莊新建等報道 可以感染 藥用作物地黃 韋建明等報道 可以感染山 藥 這些結(jié)果表明 的寄主范圍也在不斷 擴大 被 感染的植株在早期會出現(xiàn)中部或基部 葉片的褪綠黃化 而后逐步向上發(fā)展逐漸蔓延至植 株頂部 葉片最初呈現(xiàn)褪綠癥狀 隨著病情發(fā)展 葉 片黃化 同時仍能看見保持綠色的葉脈等局部組 織 最后導(dǎo)致整個植株黃化 在大田生產(chǎn)中嚴重影 響了葫蘆科作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì) 已逐漸擴大為 葫蘆科作物生產(chǎn)中亟待解決的突出問題之一 的基因組由 條正單鏈 和 組成 其中 約 可編碼甲基磷 酸轉(zhuǎn)移酶 依賴 的病毒解旋酶 依賴 的 聚合酶 蛋白和 蛋白 約 可編碼外殼蛋白 小外殼蛋白 類熱 激蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白和 蛋白 在病毒的侵染 復(fù)制和傳播過程中 這 些蛋白都發(fā)揮了重要的功能 江蘇地區(qū)的設(shè)施蔬菜和露地蔬菜在我國蔬菜 生產(chǎn)中均占有重要地位 但病毒病的發(fā)生也一直威 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 脅著省內(nèi)蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 根據(jù)目前已有報道 在 我國許多葫蘆科作物種植區(qū)都出現(xiàn)了 的感 染 但在江蘇地區(qū)尚未有針對性的報道 筆者所在課 題組于 年在江蘇省內(nèi)針對葫蘆科作物 感 染進行了普查 并對在主要感染區(qū) 泰州興化 采集 的 分離物進行了全基因組序列分析 材料與方法 病原材料 年 月在江蘇省多個葫蘆科作物生 產(chǎn)地采集到各種葫蘆科作物疑似病毒病感染樣品 主要為植株葉片 少部分為果實 癥狀表現(xiàn)為斑駁 褪綠 黃化 皺縮 畸形等 需要保存的樣品經(jīng)液氮 速凍存于 冰箱 提取和 的合成 取 病葉樣品 如果是病果則切取果皮部 分 于液氮中充分研磨成粉末 使用多糖多酚植物 試劑盒 上海浦迪生物科技有限公司 按說明 書步驟操作提取 而后取 使用 試劑盒 南京諾唯贊生物 科技股份有限公司 按說明書步驟反轉(zhuǎn)錄成 用于 和克隆 檢測分析 采用引物 和 對反轉(zhuǎn)錄后的病樣 進行 擴增 擴增體系為 南京諾唯贊生物科技股份有限公司 前后引物各 模板 補足 至 反應(yīng)程序 預(yù)變性 變性 退火 延伸 個循環(huán)后 再 延伸 若電泳后在約 處出現(xiàn) 目的條帶則將 產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有 限公司進行序列測定 基因組序列克隆與測序 根據(jù)干射香等設(shè)計的引物 分段擴增并通過 拼接獲得 和 序列全長 擴增體系 南京諾唯贊生物科技股份有限 公司 前后引物各 模板 補至 反應(yīng)程序 預(yù)變性 變性 退火 延伸 個循環(huán) 延伸 產(chǎn)物經(jīng) 的瓊 脂糖凝膠電泳后 在紫外燈下切取凝膠上的目的條 帶 使用 膠回收試劑盒 愛思進生物技術(shù)有 限公司 根據(jù)說明書步驟進行回收 回收產(chǎn)物連接 至 載體 北京全式金生物技術(shù)有限 公司 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞 南京擎科 生物科技有限公司 挑取單克隆經(jīng) 篩選后送 至南京擎科生物科技有限公司測序 序列比對分析 將測序測得的所有序列利用 軟件里 的 功能進行拼接獲得 和 全長序列 比對分析使用 網(wǎng)站的 和 軟件 聚類分析和進化樹的構(gòu)建使用 軟件 結(jié)果與分析 江蘇省 的發(fā)生情況 本研究于 年在江蘇省內(nèi)共采集樣本 份 分別來自于 個地區(qū)的 種常見葫蘆科作物 表 寄主植物樣品大多數(shù)來源于種植面積較大的葫 蘆科作物 如西瓜 甜瓜 南瓜和黃瓜 對所采樣品 提取 經(jīng)過 檢測后發(fā)現(xiàn)在建湖 興 化 南京采集的樣品中均檢測出了 其他地區(qū) 樣品中均未檢出 圖 在南京江寧采集的 份 甜瓜中有 份檢出 份黃瓜樣品中有 份 檢出 總檢出率為 在興化采集的 份樣 品中黃瓜占 份 絲瓜 份 其中包括絲瓜在內(nèi)的 份樣品檢出 檢出率為 在建湖采 集的 份西葫蘆樣品中全部檢出 在全部 份樣品中 總檢出率為 表 樣品采集地點和種類統(tǒng)計 采樣地 樣品 份 黃瓜西瓜甜瓜絲瓜西葫蘆南瓜葫蘆本地合計 建湖 興化 海門 南京 泗洪 盱眙 姜堰 大豐 各地合計 泰州興化分離物基因組特征分析 采用分段克隆拼接的策略 對 泰州興化 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 黃瓜分離物 的每條鏈分別分 段進 行克隆 通過軟件拼接獲得 全基因組 序列 對 序列信息進行分析比對發(fā) 現(xiàn) 該分離物的 序列全長共計 個堿基 包含 個開放閱讀框 其中 位堿 基為 編碼 個由 個氨基酸組成 分子 量約 的蛋白 位堿基為 編碼 個由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼 個由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼 個由 個氨基酸組成 分子量 約 的蛋白 和 的長度分 別為 和 序列全長共計 個堿基 編碼 個蛋 白 其中 位堿基編碼由 個氨基酸組 成 分子量約 的蛋白 位 堿基編碼由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼 個由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個氨基酸組成 分子量約 的蛋白 位堿基編碼由 個氨基酸組成 分 子量約 的蛋白 和 的長 度分別為 和 分析結(jié)果表明 的 序列與目前已經(jīng)公布的各個分離物基因組序列的 相似度在 以上 其中與北京分離物 和河南分離物 的相似度最高 序列一致性達 但 的 各編碼基因和非編碼序列與已知 分離物的各 序列相似度不完全一致 其中 和 基因序列保守性較高 大多數(shù)分離物的相似性為 堿基變化較多存在于 和 基因上 它們的一致性在 之間 表 的 序列與目前已公布的分 離物基因組序列相似度在 以上 其中與廣 東分離物 相似度最高 序列一致 性達 的各編碼基因 和非編碼序列與已知 分離物的各序列相似度 也不完全一致 其中 和 序列保 守性較高 許多分離物的相似性高達 而 和 上的變異較多 其一致性在 之間 表 將本研究獲得的分離物 與已經(jīng) 公布的和其一致性較高的 個分離物 的序列進行比較分析 結(jié)果 表 顯示 這 個分離物中共有 個位點存在堿 基變化 中有 個差異堿基位點 中有 個 與其他 個分離物均不相同的位點有 個 中 個 中 個 上的差 異堿基位點共有 個為同義突變 個位點為錯義 突變 上有 個位點為同義突變 個錯義突 變 另外還有 個突變位點處于 的 區(qū) 域 錯義突變存在的位置分別位于 和 上 將 中有全基因組序列報道的 和 序列分別使用鄰接法 進行聚類分析 將毛形病毒屬成員萵苣 褪綠病毒 作為外群 進化樹分支 置信度 使用 次自導(dǎo)復(fù)制驗證 由 此構(gòu)建的 結(jié)果 圖 顯示 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 表 分離物與 中其他分離物 的序列相似性 登錄號分離物宿主地區(qū) 相似性 基因組 黃瓜中國北京 哈密瓜美國喬治亞州 西葫蘆中國山東 地黃中國河南 黃瓜美國喬治亞州 黃瓜中國廣東 黃瓜中國廣東 黃瓜中國廣東 野蘿卜美國喬治亞州 甜瓜中國河南 西瓜以色列 中國河南 黃瓜中國山東 甜瓜中國上海 甜瓜中國臺灣 甜瓜中國新疆 甜瓜日本熊本 注 表示沒有相應(yīng)信息 表 分離物與 中其他分離物 的序列相似性 序列號分離物 相似性 基因組 注 表示沒有相應(yīng)信息 與其他 分離物聚在一起 表明 該分離物確實為 成員之一 根據(jù) 序列 的系統(tǒng)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)分析可以看出 與山東分離物 聚為一支 圖 說明 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 表 種 分離物序列突變位點比較分析 片段 堿基 位點 基因 或 氨基酸 替換 表 續(xù) 片段 堿基 位點 基因 或 氨基酸 替換 注 表示該位點突變的堿基由于位于非編碼區(qū)域 因此不涉及氨基酸 變化 表示同義突變 它們之間 親緣關(guān)系較近 但從 序列的 系統(tǒng)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)可以看出 與廣 東分離物 聚為一支 圖 表明這 個分 離物的 親緣關(guān)系較近 討論與結(jié)論 最初在 年被發(fā)現(xiàn) 后來在世界許多 國家的葫蘆科作物上均有發(fā)生報道 近些年來出現(xiàn) 越來越多的報道 年該病毒在我國臺灣地區(qū)被 發(fā)現(xiàn) 而后在多個省市陸續(xù)被發(fā)現(xiàn) 劉放等調(diào)查發(fā) 現(xiàn)湖南省南瓜 檢出率呈上升趨勢 并且對 分離物的 基因進行選擇壓力和中性檢測 分析 結(jié)果顯示 我國種群受到正向選擇壓力或多 樣化選擇作用 其種群多態(tài)性較低 正處于擴張趨 勢 但從世界范圍來看 維持相對穩(wěn)定狀 態(tài) 本研究團隊在前期研究普查中 曾于 年在山東壽光的黃瓜上發(fā)現(xiàn) 感染 后于 年在江蘇 個地區(qū)的 種葫蘆科作物 調(diào)查中發(fā)現(xiàn)豐縣 睢寧 南京 蘇州采集的樣品中出 現(xiàn)該病毒 感染寄主有黃瓜 西瓜和甜瓜 總感染率 為 這是首次在江蘇省境內(nèi)發(fā)現(xiàn) 的 侵染 年在對南京市 泰州市姜堰區(qū)和另外 個地區(qū)進行葫蘆科作物調(diào)研的過程中 又發(fā)現(xiàn)了該 病毒的侵染 除了黃瓜和甜瓜外 絲瓜和西葫蘆也 檢出 本次樣品 總檢出率為 該病毒在江蘇省內(nèi)的傳播可能也呈現(xiàn)逐漸擴大的 趨勢 煙粉虱的流行暴發(fā)本身就會給蔬菜產(chǎn)業(yè)造成 損失 而且煙粉虱又可以同時攜帶多種病毒 再加 上它們食性繁雜 寄主廣泛 這就給相關(guān)病毒的擴 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 展蔓延提供了很多機會 走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒 病的暴發(fā)時間與煙粉虱的暴發(fā)時間相吻合 條件適 宜的溫室環(huán)境下隨時可能暴發(fā) 而露地作物在 月期間也有可能集中暴發(fā) 不僅煙粉虱向周邊 地區(qū)的擴散會造成病毒的蔓延 蔬菜作物和種子的 貿(mào)易往來等也會造成病毒長距離的傳播 圖 為分別基于 中不同 分離物的 和 全序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹 該類型的進 化樹是很多次 得到的平均結(jié)果 從圖 可以看出 無論是 還是 來自國外的分 離物 美國分離物 日本分離物和以色列分離物 都 聚在一個大分支上 這說明 的進化具有一定 的地域性 在國內(nèi)分離物中 江蘇分離物 的 與山東分離物 親緣關(guān)系最近 但是 其 卻與廣東分離物 親緣關(guān)系最近 這 可能意味著該病毒通過多種途徑傳入江蘇 并在不 同毒株之間發(fā)生了復(fù)制重組 實驗室條件下發(fā)現(xiàn)該病毒能感染 種葫蘆科 作物 本研究在葫蘆科作物集中生產(chǎn)地采集的黃 瓜 甜瓜 絲瓜和西葫蘆上均發(fā)現(xiàn)了該病毒 這說明 該病毒在自然狀態(tài)下確實可以感染多種作物導(dǎo)致 生產(chǎn)問題 目前已有報道該病毒在自然情況下侵 染西甜瓜 西葫蘆 黃瓜等多種葫蘆科作物 其中 感染絲瓜還未有詳細報道 因此該病毒是葫 蘆科作物生產(chǎn)中的巨大威脅 還有研究報道其能 感染 種雜草 這更加大了該病毒的防控難度 在 生產(chǎn)中不僅要注意作物本身的防控還要注意田邊 雜草的管理 此外 相似度和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)來 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期 源于同一寄主的分離物并沒有聚在一起 圖 表 明該病毒的進化不受寄主的影響 參考文獻 孫曉輝 趙 靜 代惠潔 等 瓜類褪綠黃化病毒在山東省的流 行調(diào)查及西葫蘆分離物全基因組擴增與序列分析 植物病 理學(xué)報 臧連毅 孫曉輝 蘇文敏 等 瓜類褪綠黃化病毒山東分離物全 基因組序列擴增及分析 植物保護學(xué)報 劉珊珊 彭 斌 吳會杰 等 海南省和河南省發(fā)生甜瓜褪綠黃 化病的分子鑒定 果樹學(xué)報 唐 鑫 張德詠 李 凡 等 瓜類褪綠黃化病毒 在湖南省的首次報道及其流行動態(tài)研究 植物病理學(xué)報 劉 放 劉 勇 張德詠 等 瓜類褪綠黃化病毒自然侵染南瓜 及分子進化分析 植物病理學(xué)報 楊世安 李戰(zhàn)彪 秦碧霞 等 廣西三種甜瓜病毒分離物的分子 檢測與鑒定 植物保護 彭 斌 劉莉銘 劉珊珊 等 瓜類褪綠黃化病毒新疆分離物基 因組分析 植物病理學(xué)報 潘衛(wèi)萍 張以和 吉艷玲 吐魯番首次發(fā)生甜瓜褪綠黃化病毒病 蔬菜 韋建明 岳寧波 李云洲 貴州首次報道瓜類褪綠黃化病毒侵染 山藥 植物病理學(xué)報 莊新建 郭 梟 丁詩文 等 河南溫縣地黃上瓜類褪綠黃化病 毒的鑒定及其 序列分析 植物病理學(xué)報 古勤生 彭 斌 劉珊珊 等 瓜類新病毒病害 一 瓜類褪綠 黃化病 中國瓜菜 干射香 山東黃瓜分離物基因組結(jié)構(gòu)特征及致病相關(guān)蛋 白研究 荊州 長江大學(xué) 干射香 涂麗琴 吳淑華 等 山東壽光黃瓜上瓜類褪綠黃化病 毒的分子鑒定 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 楊 柳 況佳穎 任春梅 等 江蘇省主要葫蘆科作物病毒種類 及分布 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 年第 卷第 期