河 南 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 2 4 5 3 8 1 0 8 1 1 7 J o u r n a l o f H e n a n A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s d o i 1 0 1 5 9 3 3 j c n k i 1 0 0 4 3 2 6 8 2 0 2 4 0 8 0 1 2 基 于 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 的 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 響 應(yīng) MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 挖 掘 梁 芳 1 張 燕 1 袁 秀 云 1 康 瑩 瑩 2 吳 征 3 許 申 平 1 1 鄭 州 師 范 學(xué) 院 生 物 工 程 研 究 中 心 河 南 鄭 州 4 5 0 0 4 4 2 洛 陽 市 孟 津 區(qū) 公 園 管 理 和 園 林 綠 化 中 心 河 南 洛 陽 4 7 1 1 0 0 3 鄭 州 師 范 學(xué) 院 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 河 南 鄭 州 4 5 0 0 4 4 摘 要 為 了 探 究 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 抗 冷 型 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 響 應(yīng) 中 的 功 能 從 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 轉(zhuǎn) 錄 組 文 庫 中 篩 選 出 3 1 條 具 有 完 整 開 放 閱 讀 框 的 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 基 因 序 列 對 其 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 域 理 化 性 質(zhì) 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 表 達(dá) 特 性 等 進(jìn) 行 分 析 結(jié) 果 表 明 有 1 9 條 序 列 屬 于 R 2 R 3 M Y B 其 中 所 含 R 2 氨 基 酸 排 列 模 式 為 W T S I X 2 E D X 2 L X 7 G X 3 W X 2 L V I X 3 A T S G S L X R C T S G K S C R L R W X N Y R 3 氨 基 酸 排 列 模 式 為 F I M L S T X 2 E X 3 I V I L V X L V H X 2 L W G N T R K W S A X I A X 2 L P G R T D N E I V K N X W N R H T S G 其 余 1 2 條 序 列 屬 于 1 R M Y B R 氨 基 酸 排 列 模 式 為 W S T X E D E H X 2 F L X A G X 4 G D R K G 0 1 A D W 或 W S T X E K Q E N D K X F E R K A L A V X 3 E D X T A P X R W 這 3 1 條 序 列 均 具 有 M y b D N A b i n d i n g 結(jié) 構(gòu) 域 平 均 相 對 分 子 質(zhì) 量 為 3 0 2 8 8 2 8 平 均 理 論 等 電 點(diǎn) 為 7 5 5 且 都 為 疏 水 蛋 白 蝴 蝶 蘭 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 T R I N I T Y D N 6 1 7 5 4 c 4 g 1 在 抗 冷 品 種 大 辣 椒 中 的 表 達(dá) 量 于 低 溫 處 理 前 后 基 本 不 變 但 在 不 抗 冷 品 種 富 樂 夕 陽 中 低 溫 處 理 早 期 表 達(dá) 量 就 開 始 下 降 T R I N I T Y D N 7 4 2 8 8 c 0 g 1 在 大 辣 椒 中 低 溫 處 理 后 4 8 h 表 達(dá) 量 顯 著 增 加 而 在 富 樂 夕 陽 中 低 溫 處 理 2 4 h 后 的 表 達(dá) 量 顯 著 降 低 結(jié) 合 其 與 小 蘭 嶼 蝴 蝶 蘭 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的 同 源 性 分 析 及 功 能 預(yù) 測 推 測 這 2 個(gè) 基 因 可 能 在 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 響 應(yīng) 過 程 發(fā) 揮 重 要 的 作 用 關(guān) 鍵 詞 蝴 蝶 蘭 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 低 溫 脅 迫 基 因 表 達(dá) 基 因 挖 掘 中 圖 分 類 號 S 6 8 2 3 1 文 獻(xiàn) 標(biāo) 志 碼 A 文 章 編 號 1 0 0 4 3 2 6 8 2 0 2 4 0 8 0 1 0 8 1 0 收 稿 日 期 2 0 2 4 0 4 2 0 基 金 項(xiàng) 目 河 南 省 科 技 攻 關(guān) 計(jì) 劃 項(xiàng) 目 2 2 2 1 0 2 1 1 0 4 7 0 河 南 省 高 校 重 點(diǎn) 科 研 項(xiàng) 目 2 2 A 2 1 0 0 2 5 2 4 A 2 2 0 0 0 7 2 0 2 2 年 度 鄭 州 地 方 高 校 大 學(xué) 生 創(chuàng) 新 創(chuàng) 業(yè) 訓(xùn) 練 計(jì) 劃 項(xiàng) 目 D C Y 2 0 2 2 0 1 4 作 者 簡 介 梁 芳 1 9 8 2 女 湖 北 鄖 西 人 講 師 博 士 主 要 從 事 花 卉 分 子 育 種 研 究 E m a i l l i a n g f a n g z z n u e d u c n 通 信 作 者 許 申 平 1 9 8 3 女 河 南 信 陽 人 副 教 授 博 士 主 要 從 事 花 卉 栽 培 育 種 研 究 E m a i l x u s h e n p i n g z z n u e d u c n A n a l y s i s o f M Y B T r a n s c r i p t i o n F a c t o r s R e l a t e d t o C o l d S t r e s s R e s p o n s e i n P h a l a e n o p s i s B a s e d o n R N A s e q u e n c i n g L I A N G F a n g 1 Z H A N G Y a n 1 Y U A N X i u y u n 1 K A N G Y i n g y i n g 2 W U Z h e n g 3 X U S h e n p i n g 1 1 B i o e n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r Z h e n g z h o u N o r m a l U n i v e r s i t y Z h e n g z h o u 4 5 0 0 4 4 C h i n a 2 P a r k M a n a g e m e n t a n d L a n d s c a p i n g C e n t e r o f M e n g j i n D i s t r i c t L u o y a n g 4 7 1 1 0 0 C h i n a 3 S c h o o l o f L i f e S c i e n c e Z h e n g z h o u N o r m a l U n i v e r s i t y Z h e n g z h o u 4 5 0 0 4 4 C h i n a A b s t r a c t I n o r d e r t o e x p l o r e t h e f u n c t i o n o f M Y B t r a n s c r i p t i o n f a c t o r i n t h e r e s p o n s e o f c o l d r e s i s t a n t P h a l a e n o p s i s t o l o w t e m p e r a t u r e s t r e s s t h i s r e s e a r c h o b t a i n e d a t o t a l o f 3 1 M Y B t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s w i t h c o m p l e t e O R F f r o m t r a n s c r i p t o m e l i b r a r y o f P h a l a e n o p s i s c u l t i v a r s u n d e r l o w t e m p e r a t u r e s t r e s s a n d a n a l y z e d t h e i r s t r u c t u r a l d o m a i n p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s p h y l o g e n e t i c e v o l u t i o n a n d e x p r e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s T h e r e s u l t s w e r e a s f o l l o w s t h e r e w e r e 1 9 s e q u e n c e s b e l o n g i n g t o R 2 R 3 M Y B w i t h W T 第 8 期 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 是 目 前 數(shù) 目 最 為 龐 大 的 植 物 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 之 一 因 其 N 端 含 有 高 度 保 守 的 M Y B D N A 結(jié) 合 結(jié) 構(gòu) 域 而 得 名 該 結(jié) 構(gòu) 域 通 常 由 1 4 個(gè) 不 完 全 重 復(fù) 序 列 R e p e a t R 構(gòu) 成 每 個(gè) 不 完 全 重 復(fù) 序 列 是 M Y B 蛋 白 D N A 結(jié) 合 域 的 基 本 單 位 包 含 5 0 5 3 個(gè) 氨 基 酸 殘 基 形 成 3 個(gè) 螺 旋 結(jié) 構(gòu) 1 第 2 和 第 3 個(gè) 螺 旋 形 成 螺 旋 轉(zhuǎn) 角 螺 旋 H T H 結(jié) 構(gòu) 其 疏 水 核 心 含 有 3 個(gè) 色 氨 酸 殘 基 W 是 D N A 的 結(jié) 合 位 點(diǎn) 1 2 M Y B 蛋 白 的 C 端 高 度 變 異 使 得 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 具 有 多 種 不 同 的 生 物 學(xué) 功 能 根 據(jù) 重 復(fù) 序 列 的 數(shù) 目 將 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 分 為 4 個(gè) 亞 家 族 1 R M Y B 型 R 2 R 3 M Y B 型 3 R M Y B 型 和 4 R M Y B 型 3 4 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 大 多 數(shù) 為 R 2 R 3 M Y B 型 也 是 研 究 最 多 的 類 型 其 分 布 廣 泛 功 能 眾 多 1 R M Y B 型 轉(zhuǎn) 錄 因 子 是 M Y B 家 族 中 的 第 二 大 類 一 般 含 有 1 個(gè) 或 部 分 重 復(fù) 序 列 5 4 R M Y B 型 是 最 少 的 一 類 只 發(fā) 現(xiàn) 于 極 少 數(shù) 植 物 中 關(guān) 于 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 參 與 植 物 低 溫 脅 迫 的 研 究 已 有 許 多 報(bào) 道 4 低 溫 處 理 冬 黑 麥 的 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 表 明 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 與 冬 黑 麥 的 抗 冷 性 密 切 相 關(guān) 6 超 表 達(dá) O s M Y B2 的 轉(zhuǎn) 基 因 水 稻 對 冷 害 干 旱 及 鹽 分 的 耐 受 性 均 增 加 7 轉(zhuǎn) 甘 蔗 S s M Y B18 玉 米 Z m M Y B I F35 和 Z m M Y B31 羊 草 L c M Y B4 的 煙 草 或 擬 南 芥 植 株 對 低 溫 的 抗 性 均 增 強(qiáng) 8 1 1 O s M Y B S 3 是 耐 冷 性 的 正 調(diào) 節(jié) 因 子 能 抑 制 水 稻 中 D R E B 1 C B F 依 賴 性 冷 信 號 通 路 1 2 以 上 結(jié) 果 表 明 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 成 員 能 夠 提 高 植 物 對 低 溫 的 耐 受 能 力 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 除 了 在 植 物 低 溫 響 應(yīng) 中 起 著 正 調(diào) 控 作 用 也 有 部 分 成 員 起 負(fù) 調(diào) 控 作 用 如 擬 南 芥 A t M Y B C1 在 C B F 通 路 中 減 弱 植 物 對 低 溫 的 耐 受 力 1 3 蝴 蝶 蘭 P h a l a e n o p s i s s p p 是 原 產(chǎn) 于 熱 帶 亞 熱 帶 地 區(qū) 的 蘭 科 O r c h i d a c e a e 蝴 蝶 蘭 屬 P h a l a e n o p s i s 多 年 生 植 物 因 花 型 高 貴 典 雅 花 色 豐 富 多 彩 花 期 超 長 而 深 受 人 民 的 喜 愛 1 4 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 蝴 蝶 蘭 中 的 報(bào) 道 較 少 而 且 多 集 中 在 M Y B 參 與 花 青 素 的 積 累 從 而 影 響 花 斑 形 成 方 面 的 研 究 1 5 1 7 關(guān) 于 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 響 應(yīng) 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 的 研 究 尚 未 見 報(bào) 道 鑒 于 此 在 前 期 工 作 基 礎(chǔ) 上 從 2 個(gè) 不 同 抗 冷 性 蝴 蝶 蘭 品 種 的 低 溫 脅 迫 轉(zhuǎn) 錄 組 文 庫 中 利 用 生 物 信 息 學(xué) 手 段 對 蝴 蝶 蘭 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 進(jìn) 行 系 統(tǒng) 的 分 析 篩 選 與 抗 冷 有 關(guān) 的 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 關(guān) 鍵 基 因 為 進(jìn) 一 步 探 究 蝴 蝶 蘭 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 基 因 的 功 能 及 利 用 M Y B 抗 冷 基 因 進(jìn) 行 蝴 蝶 蘭 分 子 育 種 奠 定 基 礎(chǔ) 1 材 料 和 方 法 1 1 試 驗(yàn) 材 料 及 處 理 方 法 試 驗(yàn) 材 料 為 蝴 蝶 蘭 抗 冷 品 種 大 辣 椒 P h a l a e n o p s i s c u l t i v a r B i g C h i l i 和 不 抗 冷 品 種 富 樂 夕 陽 P h a l a e n o p s i s c v F u l l e r s S u n s e t 5 6 葉 期 健 壯 大 棚 苗 試 驗(yàn) 在 植 物 人 工 光 照 培 養(yǎng) 箱 美 國 P E R C I V A L E 4 1 H O 2 中 進(jìn) 行 常 溫 對 照 為 晝 夜 溫 度 2 7 2 2 低 溫 處 理 為 晝 夜 溫 度 1 1 6 從 常 溫 培 養(yǎng) 到 低 溫 處 理 采 用 模 擬 自 然 降 溫 的 方 法 1 8 S I X 2 E D X 2 L X 7 G X 3 W X 2 L V I X 3 A T S G S L X R C T S G K S C R L R W X N Y o f t h e a m i n o a c i d a r r a n g e m e n t p a t t e r n f o r R 2 r e p e a t a n d F I M L S T X 2 E X 3 I V I L V X L V H X 2 L W G N T R K W S A X I A X 2 L P G R T D N E I V K N X W N R H T S G o f t h e a m i n o a c i d a r r a n g e m e n t p a t t e r n f o r R 3 r e p e a t t h e r e w e r e 1 2 s e q u e n c e s b e l o n g i n g t o 1 R M Y B w i t h W S T X E D E H X 2 F L X A G X 4 G D R K G 0 1 A D W o r W S T X E K Q E N D K X F E R K A L A V X 3 E D X T A P X R W o f t h e a m i n o a c i d a r r a n g e m e n t p a t t e r n f o r R r e p e a t A l l t h e s e 3 1 s e q u e n c e s h a d a M y b D N A b i n d i n g d o m a i n T h e a v e r a g e r e l a t i v e m o l e c u l a r w e i g h t a n d t h e o r e t i c a l i s o e l e c t r i c p o i n t w e r e 3 0 2 8 8 2 8 a n d 7 5 5 f o r 3 1 M Y B p r o t e i n s i n P h a l a e n o p s i s r e s p e c t i v e l y a l l o f t h e m w e r e h y d r o p h o b i c p r o t e i n s M Y B t r a n s c r i p t i o n f a c t o r T R I N I T Y D N 6 1 7 5 4 c 4 g 1 w a s a l m o s t u n c h a n g e d i n P h a l a e n o p s i s c u l t i v a r B i g C h i l i a m o n g t h e w h o l e p r o c e s s w h i l e t h e e x p r e s s i o n l e v e l w a s d e c r e a s e d i n t h e e a r l y s t a g e o f c o l d t r e a t m e n t i n P h a l a e n o p s i s c v F u l l e r s S u n s e t T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f R I N I T Y D N 7 4 2 8 8 c 0 g 1 w a s i n c r e a s e d o b v i o u s l y a t 4 8 h a f t e r c o l d t r e a t m e n t i n B i g C h i l i h o w e v e r t h e l e v e l w a s d e c r e a s e d r e m a r k a b l e l y a t 2 4 h a f t e r c o l d s t r e s s c o m p a r e d t o n o r m a l t e m p e r a t u r e i n F u l l e r s S u n s e t B a s e d o n t h e p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s a n d f u n c t i o n a l p r e d i c t i o n o f M Y B t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s b e t w e e n i n P h a l a e n o p s i s e q u e s t r i s a n d P h a l a e n o p s i s c u l t i v a r s i t i s s p e c u l a t e d t h a t t h e s e t w o g e n e s m a y p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n r e s p o n s e t o l o w t e m p e r a t u r e s t r e s s i n P h a l a e n o p s i s K e y w o r d s P h a l a e n o p s i s M Y B t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s L o w t e m p e r a t u r e s t r e s s G e n e e x p r e s s i o n G e n e m i n i n g 梁 芳 等 基 于 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 的 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 響 應(yīng) M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 挖 掘 109河 南 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 第 5 3 卷 分 別 在 正 常 培 養(yǎng) 溫 度 C K 1 和 低 溫 處 理 0 C K 2 2 4 4 8 7 2 1 2 0 h 自 上 而 下 第 2 片 成 熟 葉 取 樣 1 2 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 本 的 篩 選 將 所 有 蝴 蝶 蘭 取 樣 材 料 送 往 北 京 諾 禾 致 源 科 技 有 限 公 司 進(jìn) 行 高 通 量 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 采 用 T r i n i t y 軟 件 對 轉(zhuǎn) 錄 本 進(jìn) 行 拼 接 組 裝 后 獲 得 蝴 蝶 蘭 低 溫 轉(zhuǎn) 錄 組 文 庫 從 中 篩 選 M Y B 基 因 序 列 利 用 O R F F i n d e r 在 線 工 具 預(yù) 測 每 條 序 列 的 開 放 閱 讀 框 O R F 去 除 O R F 不 完 整 或 異 常 的 序 列 并 將 結(jié) 果 進(jìn) 行 B L A S T 搜 索 比 對 選 取 具 有 全 長 氨 基 酸 序 列 的 M Y B 蛋 白 進(jìn) 行 后 續(xù) 分 析 1 3 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 蛋 白 分 析 運(yùn) 用 T h e M E M E S u i t e 5 5 3 h t t p s m e m e s u i t e o r g m e m e i n d e x h t m l 在 線 程 序 分 析 蝴 蝶 蘭 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 蛋 白 的 基 序 m o t i f 基 序 數(shù) 量 設(shè) 為 1 0 基 序 長 度 最 小 值 設(shè) 為 8 最 大 值 設(shè) 為 5 5 其 余 為 默 認(rèn) 值 運(yùn) 用 在 線 工 具 S M A R T P r o t P a r a m S O P M A 和 S W I S S M O D E L 分 別 對 蛋 白 質(zhì) 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 理 化 性 質(zhì) 二 級 和 三 級 結(jié) 構(gòu) 進(jìn) 行 分 析 預(yù) 測 1 4 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 與 功 能 分 析 在 P l a n t T F D B 數(shù) 據(jù) 庫 中 下 載 蝴 蝶 蘭 屬 模 式 植 物 小 蘭 嶼 蝴 蝶 蘭 P h a l a e n o p s i s e q u e s t r i s 的 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 完 整 的 氨 基 酸 序 列 用 C l u s t a l W 程 序 對 二 者 的 M Y B 蛋 白 序 列 進(jìn) 行 比 對 將 比 對 結(jié) 果 在 M E G A 7 0 2 6 中 采 用 最 大 似 然 法 M a x i m u m l i k e l i h o o d M L 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 重 復(fù) 次 數(shù) 設(shè) 為 1 0 0 0 次 其 他 參 數(shù) 為 默 認(rèn) 值 1 5 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 表 達(dá) 分 析 基 于 蝴 蝶 蘭 抗 冷 品 種 大 辣 椒 和 不 抗 冷 品 種 富 樂 夕 陽 的 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 庫 獲 得 蝴 蝶 蘭 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 在 2 個(gè) 品 種 常 溫 對 照 與 低 溫 處 理 4 8 h 后 的 基 因 表 達(dá) 量 并 利 用 H e m I h e a t m a p i l l u s t r a t o r v 1 0 軟 件 對 表 達(dá) 量 進(jìn) 行 分 層 聚 類 分 析 對 篩 選 出 的 M Y B 基 因 進(jìn) 行 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 P C R 驗(yàn) 證 采 用 多 糖 多 酚 植 物 總 R N A 提 取 試 劑 盒 提 取 蝴 蝶 蘭 葉 片 總 R N A 后 以 P h P P2 A 作 為 內(nèi) 參 基 因 1 9 利 用 T B G r e e n P r e m i x E x T a q 對 不 同 低 溫 脅 迫 處 理 時(shí) 間 后 基 因 表 達(dá) 情 況 進(jìn) 行 q R T P C R 檢 測 引 物 設(shè) 計(jì) 見 表 1 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 的 獲 得 從 蝴 蝶 蘭 低 溫 轉(zhuǎn) 錄 組 文 庫 中 共 篩 選 到 7 6 條 M Y B 基 因 序 列 片 段 大 小 在 2 5 2 2 2 8 2 b p 將 序 列 一 一 輸 入 到 O R F F i n d e r 中 進(jìn) 行 搜 索 并 對 結(jié) 果 進(jìn) 行 B L A S T 搜 索 篩 選 到 3 1 條 具 有 完 整 O R F 的 M Y B 基 因 序 列 這 3 1 條 M Y B 基 因 序 列 平 均 長 度 為 1 3 5 4 b p 其 中 T R I N I T Y D N 7 4 3 5 2 c 2 g 1 基 因 序 列 最 長 為 2 2 7 0 b p 推 導(dǎo) 編 碼 3 7 3 個(gè) 氨 基 酸 T R I N I T Y D N 5 6 6 9 1 c 0 g 1 基 因 序 列 最 短 為 6 2 1 b p 推 導(dǎo) 編 碼 8 2 個(gè) 氨 基 酸 2 2 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 基 序 及 結(jié) 構(gòu) 域 分 析 通 過 T h e M E M E S u i t e 5 5 3 在 線 軟 件 分 析 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 轉(zhuǎn) 錄 組 中 篩 選 到 的 3 1 個(gè) M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的 1 0 個(gè) 基 序 如 圖 1 所 示 有 1 9 條 序 列 含 有 基 序 1 經(jīng) 分 析 發(fā) 現(xiàn) 基 序 1 是 R 2 R 3 M Y B 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 的 一 部 分 表 明 這 1 9 條 序 列 屬 于 R 2 R 3 M Y B 另 外 1 2 條 全 部 為 1 R M Y B 其 中 6 條 序 列 含 有 基 序 5 分 別 為 T R I N I T Y D N 5 9 1 9 4 c 4 g 1 T R I N I T Y D N 5 9 4 6 9 c 0 g 1 T R I N I T Y D N 7 4 8 3 0 c 1 g 1 T R I N I T Y D N 5 6 6 9 1 c 0 g 1 T R I N I T Y D N 7 1 5 5 5 c 1 g 2 T R I N I T Y D N 6 8 2 2 6 c 1 g 1 這 6 條 序 列 具 有 W X 2 2 W 結(jié) 構(gòu) 經(jīng) 進(jìn) 一 步 分 析 發(fā) 現(xiàn) 該 W X 2 2 W 結(jié) 構(gòu) 在 某 些 位 點(diǎn) 高 度 保 守 可 將 其 總 結(jié) 為 W S T X E K Q E N D K X F E R K A L A V X 3 E D X T A P X R W 另 6 條 序 列 具 有 W X 1 8 1 9 W 結(jié) 構(gòu) 分 別 為 T R I N I T Y D N 7 4 6 3 4 c 0 g 1 T R I N I T Y D N 7 4 2 8 8 c 0 g 1 T R I N I T Y D N 6 6 2 5 5 c 1 g 1 T R I N I T Y D N 7 5 0 0 4 c 4 g 1 T R I N I T Y D N 6 6 9 1 7 c 1 g 1 T R I N I T Y D N 7 7 8 9 8 c 2 g 1 經(jīng) 分 析 該 W X 1 8 1 9 W 結(jié) 構(gòu) 可 進(jìn) 一 步 總 結(jié) 為 W S T X E D E H X 2 F L X A G X 4 G D R K G 0 1 A D W 其 中 T R I N I T Y D N 6 6 9 1 7 c 1 g 1 和 T R I N I T Y D N 7 7 8 9 8 c 2 g 1 多 了 1 個(gè) 甘 氨 酸 殘 基 G 對 所 有 3 1 條 序 列 進(jìn) 行 在 線 S M A R T 分 析 發(fā) 現(xiàn) 均 具 有 M y b D N A b i n d i n g 結(jié) 構(gòu) 域 R 2 R 3 類 型 的 M Y B 結(jié) 構(gòu) 域 是 M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 最 典 型 的 結(jié) 構(gòu) 對 含 有 R 2 R 3 結(jié) 構(gòu) 域 的 蝴 蝶 蘭 M Y B 序 列 進(jìn) 行 分 析 以 T R I N I T Y D N 7 4 3 5 2 c 2 g 1 蛋 白 序 表1 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 引 物 序 列 Tab 1 ThesequencesofqRT PCR 基 因 I D G e n e I D T R I N I T Y D N 6 1 7 5 4 c 4 g 1 T R I N I T Y D N 7 4 2 8 8 c 0 g 1 P h P P 2 A 引 物 5 3 P r i m e r 5 3 F G C A G G G C T C T T T A G G T G T G R C A G C A A T C G C A G A C C A T C T F A C G G G A C T C A T C A A G C G A R T T G G T G A T T T A C T C T C C T G C T C F T C T G T T G G C T G T G G A A G G A T R A A A T C C G A C C T G G T A G T T T C T G 產(chǎn) 物 大 小 b p P r o d u c t 1 4 4 1 9 4 1 8 6 110第 8 期 R 2 R 3 M Y B 的 2 個(gè) 重 復(fù) 序 列 中 具 有 規(guī) 律 間 隔 的 色 氨 酸 殘 基 W 每 間 隔 1 8 1 9 個(gè) 氨 基 酸 就 有 1 個(gè) W 2 0 在 R 2 重 復(fù) 序 列 中 由 高 度 保 守 的 W 構(gòu) 成 W X 1 9 W X 1 9 W 排 列 模 式 2 1 但 在 蝴 蝶 蘭 T R I N I T Y D N 5 5 0 8 1 c 0 g 1 和 T R I N I T Y D N 7 1 3 9 6 c 2 g 1 的 R 2 重 復(fù) 序 列 中 丟 失 了 一 個(gè) 氨 基 酸 殘 基 形 成 W X 1 9 W X 1 8 W 模 式 對 蝴 蝶 蘭 1 7 個(gè) 典 型 的 R 2 R 3 M Y B 蛋 白 R 2 重 復(fù) 序 列 進(jìn) 行 分 析 發(fā) 現(xiàn) 除 了 含 有 3 個(gè) 高 度 保 守 的 W 某 些 位 點(diǎn) 也 高 度 保 守 特 別 是 在 第 3 個(gè) 螺 旋 中 有 連 續(xù) 7 個(gè) 保 守 的 氨 基 酸 G K S C R L R 形 成 高 度 保 守 的 基 序 因 此 蝴 蝶 蘭 R 2 R 3 M Y B 蛋 白 中 R 2 重 復(fù) 序 列 的 氨 基 酸 排 列 模 式 可 總 結(jié) 為 W T S I X 2 E D X 2 L X 7 G X 3 W X 2 L V I X 3 A T S G S L X R C T S G K S C R L R W X N Y 如 圖 3 A 所 示 在 R 3 重 復(fù) 序 列 中 由 高 度 保 守 的 W 構(gòu) 成 W X 1 8 W X 1 8 W 排 列 模 式 但 第 1 個(gè) W 常 被 其 他 氨 基 酸 替 代 2 2 2 在 蝴 蝶 蘭 R 2 R 3 M Y B 蛋 白 的 R 3 重 復(fù) 序 列 中 第 1 個(gè) W 被 F 苯 丙 氨 列 為 例 以 A 0 A 8 0 3 P W 1 0 1 A C a n n a b i s s a t i v a 為 模 板 預(yù) 測 了 蝴 蝶 蘭 R 2 R 3 重 復(fù) 序 列 的 三 級 結(jié) 構(gòu) 每 個(gè) 重 復(fù) 序 列 均 包 含 3 個(gè) 螺 旋 如 圖 2 所 示 圖1 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 基 序 分 析 Fig 1 MotifanalysisofMYBtranscriptionfactorsin P h a l a e n o p s i scultivars 圖2 蝴 蝶 蘭R2R3 MYB 蛋 白 保 守 結(jié) 構(gòu) 域 中R2 R3 重 復(fù) 序 列 的 三 級 結(jié) 構(gòu) 預(yù) 測 Fig 2 PutativetertiarystructureoftheR2andR3 repeatsofR2R3 MYBproteinin P h a l a e n o p s i scultivars 梁 芳 等 基 于 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 的 蝴 蝶 蘭 低 溫 脅 迫 響 應(yīng) M Y B 轉(zhuǎn) 錄 因 子 挖 掘 111河 南 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 第 5 3 卷 綠 色 橙 色 藍(lán) 色 下 劃 線 分 別 表 示 R 2 R 3 中 的 第 1 2 3 個(gè) 螺 旋 保 守 氨 基 酸 W 及 替 代 氨 基 酸 F I M L 用 紅 色 標(biāo) 出 X 代 表 任 意 氨 基 酸 T h e g r e e n o r a n g e a n d b l u e u n d e r l i n e s r e p r e s e n t t h e 1 s t 2 n d a n d 3 r d h e l i x i n R 2 a n d R 3 r e p e a t s r e s p e c t i v e l y T h e c o n s e r v a t i v e a m i n o a c i d W a n d a l t e r n a t i v e a m i n o a c i d F I M L a r e m a r k e d i n r e d X r e p r e s e n t s a n y a m i n o a c i d 圖3 蝴 蝶 蘭R2R3 MYB 中R2 A R3 B 重 復(fù) 序 列 氨 基 酸 排 列 情 況 Fig 3 SequencelogosoftheR2 A andR3 B repeatsofR2R3 MYBin P h a l a e n o p s i scultivars 酸 I 異 亮 氨 酸 M 甲 硫 氨 酸 或 L 亮 氨 酸 替 代 見 圖 3 A 中 第 5 4 位 與 R 2 重 復(fù) 序 列 一 樣 R 3 重 復(fù) 序 列 中 某 些 位 點(diǎn) 的 氨 基 酸 高 度 保 守 特 別 是 在 第 2 3 個(gè) 螺 旋 之 間 及 第 3 個(gè) 螺 旋 區(qū) 域 有 連 續(xù) 8 個(gè) 保 守 的 氨 基 酸 L P G R T D N E 形 成 高 度 保 守 的 基 序 因 此 蝴 蝶 蘭 R 2 R 3 M Y B 蛋 白 中 R 3 重 復(fù) 序 列 的 氨 基 酸 排 列 模 式 可 總 結(jié) 為 F I M L S T X 2 E X 3 I V I L V X L V H X 2 L W G N T R K W S A X I A X 2 L P G R T D N E I V K N X W N R H T S G 如 圖 3 B 所 示 此 外 在 蝴 蝶 蘭 R 2 R 3 重 復(fù) 序 列 的 第 1 個(gè) 螺 旋 有 2 個(gè) 位 點(diǎn) 高 度 保 守 即 在 第 1 個(gè) W R 2 中 或 F I M L R 3 中 后 的 第 5 1 7 位 均 為 E 谷 氨 酸 和 G 甘 氨 酸 在 R 2 R 3 重 復(fù) 序 列 之 間 的 連 接 區(qū) 域 有 4 個(gè) 保 守 的 氨 基 酸 L R P D 2 3 蝴 蝶 蘭MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族 理 化 性 質(zhì) 分